顧沐恩 黃艷 劉雅楠 劉慧榮 黃儒德 吳璐一 彭廣彬 李國娜 李璟 吳煥淦

摘要 目的：觀察隔藥餅灸及隔姜灸治療慢性萎縮性胃炎（CAG）的臨床療效，探討艾灸對CAG相關(guān)癌前病變外周血DNA甲基化譜的影響。方法：選取2018年5月至2020年10月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科收治的CAG患者70例作為研究對象，隨機(jī)分為隔藥餅灸組和隔姜灸組，每組35例，2組患者均選取中脘、氣海、雙側(cè)足三里、雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴進(jìn)行治療。比較2組治療前后中醫(yī)癥狀評分、光鏡下胃黏膜組織病理學(xué)變化，評價(jià)2組的臨床療效，并選取每組治療前后患者全血樣本各2例，采用全基因組甲基化測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，觀察外周血DNA甲基化位點(diǎn)和甲基化狀態(tài)的變化。結(jié)果：1）治療后，2組中醫(yī)癥狀總積分均較治療前顯著降低（均P<0.01），隔藥餅灸組胃脘疼痛、食欲減退癥狀積分低于隔姜灸組（均P<0.01），隔姜灸組燒心、反胃癥狀積分低于隔藥餅灸組（均P<0.01）;隔藥餅灸組臨床總有效率為87.88%，隔姜灸組為78.79%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后2組胃黏膜的萎縮、腸化病變程度及隔藥餅灸組的炎癥程度有明顯改善（P<0.05）。隔藥餅灸組胃鏡病理總體有效率82.14%，隔姜灸組總體有效率69.57%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。2）CG序列環(huán)境下，治療前后隔藥餅灸組共有176個差異甲基化基因，隔姜灸組有652個差異甲基化基因。隔藥餅灸組治療前后差異甲基化區(qū)域（DMR）錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因涉及的KEGG通路包括cAMP、AMPK和核因子κB信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等，隔姜灸組涉及的KEGG通路包括mTOR和HIF-1信號通路、代謝通路、細(xì)胞凋亡等。結(jié)論：隔藥餅灸和隔姜灸可改善慢性萎縮性胃炎患者臨床癥狀，減輕胃黏膜萎縮、腸化生等病理狀態(tài);隔藥餅灸在改善患者胃脘疼痛、食欲減退癥狀更具優(yōu)勢，而隔姜灸在改善患者燒心、反胃癥狀更優(yōu)。艾灸能影響CAG患者外周血全基因組DMR的DNA甲基化水平，這可能是艾灸對CAG的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞 艾灸;慢性萎縮性胃炎;DNA甲基化

Clinical Observation of Moxibustion on Patients with Chronic Atrophic Gastritis and Its Effect on DNA Methylation in Peripheral Blood

GU Muen1，HUANG Yan2，LIU Yanan2，LIU Huirong1，2，HUANG Rude2，WU Luyi1，2，PENG Guangbin1，LI Guona3，LI Jing1，WU Huangan1，2

（1 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To observe the clinical efficacy of herb-partitioned moxibustion （HM） and ginger-partitioned moxibustion （GM） in the treatment of chronic atrophic gastritis （CAG） and explore the effect of moxibustion on DNA methylation in peripheral blood of CAG-related precancerous lesions.Methods：Seventy CAG patients who were treated in the Acupuncture and Moxibustion Department of Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine from May 2018 to October 2020 were randomly divided into an HM group and a GM group，with 35 cases in each group.“Zhongwan” （CV 12），“Qihai” （CV 6），bilateral “Zusanli” （ST 36），and bilateral “Neiguan” （PC 6） were selected for treatment in both groups.The clinical efficacies were evaluated by comparing the symptom scores of traditional Chinese medicine （TCM） and the gastric mucosal changes under gastroscopy before and after treatment.Whole blood samples from two patients in each group were collected before and after treatment.Genome-wide methylation sequencing and bioinformatics analysis were used to observe the changes of DNA methylation sites and methylation status in the peripheral blood.Results：1） The post-treatment TCM symptom scores were lower than pre-treatment ones in both groups （both P<0.01）.The scores of gastric pain and loss of appetite were lower in the HM group and heartburn and nausea scores were lower in the GM group after treatment （both P<0.01）.The total clinical effective rates were 87.88% and 78.79% in the HM group and the GM group，respectively （P>0.05）.The histopathological changes in the gastric mucosa atrophy and intestinal metaplasia of the two groups as well as the degree of mucosal inflammation in the HM group were improved after treatment （P<0.05）.The total effective rates of gastroscopy were 82.14% and 69.57% in the HM group and the GM group （P>0.05）.2） In the CG sequencing environment，there were 176 and 652 differentially methylated genes in the HM group and the GM group，respectively，before and after treatment.In the HM group，the KEGG pathways of genes involved in the differentially methylated region （DMR）-anchored promoter region before and after treatment included cAMP，AMPK，and NF-κB signaling pathways，ubiquitin-mediated proteolysis，etc.，while in the GM group，the KEGG pathways included mTOR and HIF-1 signaling pathways，metabolic pathway，cell apoptosis，etc.Conclusion：Both HM and GM can improve the clinical symptoms of CAG patients and alleviate pathological conditions such as gastric mucosal atrophy and intestinal metaplasia.HM is advantageous in improving the symptoms of gastric pain and loss of appetite，while GM is potent in improving the symptoms of heartburn and nausea.Moxibustion can affect the DNA methylation levels in the DMR of the whole genome in the peripheral blood of CAG patients，which may be one of the epigenetic regulatory mechanisms of moxibustion against CAG.

Keywords Moxibustion; Chronic atrophic gastritis; DNA methylation

中圖分類號：R246.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.002

慢性萎縮性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）是一種以胃黏膜固有腺體形態(tài)萎縮、數(shù)量減少，胃黏膜變薄，黏膜肌層增厚為特征的慢性消化系統(tǒng)疾病。研究證實(shí)CAG特別是伴有不完全型腸上皮化生（Intestinal Metaplasia，IM）和（或）中重度異型增生（Dysplasia，Dys）者有癌變傾向。據(jù)最新流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，2020年全球新發(fā)胃癌病例約108萬，死亡約76.9萬。發(fā)生率與死亡率分別為全球癌癥第6位與第4位[1-2]。因其臨床表現(xiàn)無特異性，疾病早期易被忽略，患者生存率偏低[3]。因此，開展胃癌癌前病變的防治具有重要的臨床意義。

CAG可歸屬于中醫(yī)“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等。針灸治療CAG有其獨(dú)特優(yōu)勢，在改善患者臨床癥狀、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、保護(hù)及修復(fù)胃黏膜等方面都表現(xiàn)出較好的治療效果[4-7]，但艾灸治療CAG的效應(yīng)機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。DNA甲基化是表觀遺傳修飾形式之一，與慢性炎癥介導(dǎo)的癌變密切相關(guān)。有研究表明，胃炎患者DNA甲基化水平與胃黏膜炎癥活動有關(guān)，在CAG伴腸化生等胃癌前病變中發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)基因的啟動子區(qū)域高甲基化;并且在癌變過程中，CpG島區(qū)域的DNA甲基化水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，使特定區(qū)域的腫瘤抑制基因缺失或失活，促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展[8]。因此，本研究擬進(jìn)一步證實(shí)隔藥餅灸及隔姜灸對CAG的臨床療效，研究艾灸對CAG患者外周血DNA甲基化譜的影響，以期為針灸在CAG的臨床應(yīng)用提供客觀的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年5月至2020年10月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸科收治的CAG患者70例作為研究對象，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件生成隨機(jī)數(shù)字，根據(jù)患者的就診順序，按照1∶1比例將患者隨機(jī)分為隔藥餅灸組和隔姜灸組，每組35例。試驗(yàn)過程中隔藥灸組脫落2例，隔姜灸組脫落2例，最終每組完成33例，共完成66例。其中隔藥餅灸組中男14例，女19例，年齡37～74歲，平均年齡為61.55歲，病程6個月至50年，平均病程為8.68年，隔姜灸組中男12例，女21例，年齡33～74歲，平均年齡為59.36歲，病程2個月至30年，平均病程為8.67年。2組患者性別、年齡、病程等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究已通過上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會的倫理審查（倫理審批號：2017-013）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》[9]以及《慢性萎縮性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2017年）》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。具體如下：1）胃鏡診斷標(biāo)準(zhǔn)：黏膜紅白相間、以白為主，黏膜皺襞變平甚至消失，部分黏膜血管顯露，可伴有黏膜顆?；蚪Y(jié)節(jié)狀等表現(xiàn)。2）病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：只要慢性胃炎病理活檢顯示有固有腺體萎縮，即可診斷為萎縮性胃炎，而不必考慮活檢標(biāo)本的萎縮塊數(shù)和程度。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1）符合CAG的診斷標(biāo)準(zhǔn);2）年齡18～75歲，性別不限;3）自愿加入本研究并簽署了知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1）合并嚴(yán)重肝、腎、心腦血管、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌疾病者以及精神病患者;2）妊娠或準(zhǔn)備妊娠婦女，哺乳期婦女;3）伴有結(jié)核、肝炎、艾滋、淋病等傳染病患者;4）有明顯出血傾向，和（或）嚴(yán)重糖尿病患者。

1.5 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn) 1）受試者依從性差，未配合完成治療者;2）試驗(yàn)過程中接受其他治療或有明顯的其他干預(yù)因素而影響療效判定者;3）病情惡化或出現(xiàn)其他嚴(yán)重疾病而無法繼續(xù)治療者;4）出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)或不良事件者;5）在治療期間自行退出研究或失訪者。

1.6 治療方法 2組患者均取穴中脘、氣海、足三里（雙）、內(nèi)關(guān)（雙）穴。隔藥餅灸組將含有制附子、肉桂等的中藥碾粉，加黃酒調(diào)成厚糊狀，每個藥餅含藥粉2.5 g，黃酒3 g，用模具按壓成直徑2.3 cm、厚度0.5 cm大小;隔姜灸組將新鮮生姜切成直徑2.3 cm、厚度0.5 cm大小姜片，用直徑1 mm粗針扎20個孔。分別將藥餅或姜片置于艾灸托具下層，鐵絲網(wǎng)上置長約17 mm、直徑2 cm、重約1.8 g的艾炷，點(diǎn)燃后置于穴位上進(jìn)行隔藥餅灸或隔姜灸，每穴各灸1壯/次，3次/周，共治療24周。治療采用單盲法，患者全程不知曉自己所在的治療組別，并設(shè)立操作人員以外的獨(dú)立人員分別進(jìn)行療效評價(jià)、數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 胃腸中醫(yī)癥狀積分 參照《胃腸疾病中醫(yī)癥狀評分表》[11]對患者進(jìn)行中醫(yī)癥狀評分，所有癥狀均分為無、輕、中、重4級賦予積分值，于治療前后填寫量表進(jìn)行評估。

1.7.2 胃黏膜組織病理學(xué)觀察 于光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜的組織病理學(xué)形態(tài)，參考《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》[9]將胃黏膜組織病變分炎癥、活動性、萎縮、腸化、異型增生，根據(jù)程度分為無、輕、中、重四級（-、+、++、+++），觀察患者治療前后胃黏膜組織病理學(xué)變化。

1.7.3 DNA甲基化測序及分析 根據(jù)患者臨床癥狀及胃鏡組織病理學(xué)改善情況，每組選取療效較優(yōu)的2例患者，于治療前及治療結(jié)束后，使用EDTA抗凝采血管采集患者空腹外周靜脈血3～5 mL。1）DNA提取與處理后進(jìn)行文庫構(gòu)建與質(zhì)控：提取DNA，超聲破碎至200～400 bp大小片段;進(jìn)行末端修復(fù)加A尾，連接對應(yīng)的測序接頭;對加了測序接頭的DNA重亞硫酸鹽（Bisulfite）處理，未發(fā)生DNA甲基化的C變成U（在PCR擴(kuò)增以后改變?yōu)門），而發(fā)生DNA甲基化的C保持不變，再PCR擴(kuò)增，構(gòu)建好WGBS文庫后，定量加入稀釋液后使用Agilent 2100檢測片段長度上機(jī)測序;2）測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和參考序列比對：應(yīng)用Illumina測序使用cutadapt過濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)（Clean Data），質(zhì)控后采用BSMAP軟件進(jìn)行比對分析;3）甲基化位點(diǎn)檢測：比對完成后采用Bsmap軟件檢測發(fā)生甲基化的位點(diǎn);4）使用Metilene軟件分析差異甲基化區(qū)域（Different Methylation Region，DMR），統(tǒng)計(jì)DMR數(shù)量分布;5）組間DMR錨定啟動子區(qū)域差異基因篩選：篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異甲基化區(qū)域位于啟動子區(qū)，diff絕對值大于0.1，且P<0.05;6）對基因啟動子區(qū)域（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1.5K到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游0.5K）有交疊的基因進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。

1.8 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

胃腸中醫(yī)癥狀積分療效參照《慢性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2011年天津）》[12]中的標(biāo)準(zhǔn)：1）臨床痊愈：主要癥狀、體征消失或基本消失，療效指數(shù)≥95%;2）臨床顯效：主要癥狀、體征明顯改善，70%≤療效指數(shù)<95%;3）臨床有效：主要癥狀、體征明顯好轉(zhuǎn)，30%≤療效指數(shù)<70%;4）臨床無效：主要癥狀、體征無明顯改善，甚或加重，療效指數(shù)<30%。療效指數(shù)=[（治療前積分-治療后積分）/治療前積分]×100%。

胃鏡下胃黏膜病理療效參考《慢性胃炎中西醫(yī)結(jié)合診療共識意見（2011年天津）》[12]中胃鏡及病理學(xué)療效判定標(biāo)準(zhǔn)：1）治愈：胃鏡復(fù)查活動性炎癥消失，慢性炎癥好轉(zhuǎn)達(dá)輕度;腺體萎縮、腸化生和異型增生消失;2）顯效：黏膜急性炎癥基本消失，慢性炎癥好轉(zhuǎn);腺體萎縮、腸化生和異型增生明顯減輕;3）有效：黏膜病變范圍縮小1/2以上，炎癥有所減輕;腺體萎縮、腸化生和異型增生減輕;4）無效：內(nèi)鏡及病理學(xué)所見均無好轉(zhuǎn)者。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究臨床數(shù)據(jù)采用符合方案集（Per Protocol Set，PPS）進(jìn)行分析。采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)數(shù)資料采用例或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)（Chi-Square Test）。計(jì)量資料若符合正態(tài)分布且方差齊性，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對t檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用M（P25，P75）表示，2組間比較采用Mann-Whitney U法，組內(nèi)比較采用Wilcoxon（W）法。2組療效比較采用Ridit分析，有效率比較采用χ2檢驗(yàn)。取檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組CAG患者中醫(yī)癥狀積分比較

治療后，2組患者中醫(yī)癥狀總積分均顯著降低（均P<0.01），而2組間治療前后差值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。治療后，2組患者的胃脘痞滿、食后腹脹、泛酸、噯氣、口苦、便秘、精神疲乏、畏寒怕冷、煩躁易急、失眠多夢等單個主要癥狀積分均明顯降低（P<0.05或P<0.01），2組患者上述癥狀的積分差值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后隔藥餅灸組胃脘疼痛、食欲減退癥狀積分明顯降低（P<0.01），且癥狀積分的差值優(yōu)于隔姜灸組（P<0.01），而治療后隔姜灸組燒心、反胃癥狀積分明顯降低（P<0.01），此癥狀積分的差值優(yōu)于隔藥餅灸組（P<0.05）。見表2。

2.2 2組CAG患者中醫(yī)癥狀療效

比較根據(jù)2組患者治療后中醫(yī)癥狀積分改善情況，隔藥餅灸組顯效2例，有效27例，無效4例;隔姜灸組顯效0例，有效26例，無效7例。隔藥餅灸組療效優(yōu)于隔姜灸組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。隔藥餅灸組總有效率87.88%，隔姜灸組總有效率78.79%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.3 2組CAG患者胃黏膜病理學(xué)比較

66例患者中，共有51例患者在治療后進(jìn)行了胃鏡和病理學(xué)復(fù)查，其中隔藥餅灸組28例，隔姜灸組23例。與治療前比，2組治療后胃黏膜的萎縮、腸化病變程度有明顯改善，隔藥餅灸組治療后胃黏膜的炎癥也明顯改善（P<0.05），2組患者治療后胃黏膜的各項(xiàng)病變程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4～5。

2.4 2組CAG患者胃黏膜胃鏡病理學(xué)療效比較

隔藥餅灸組28例患者治療后進(jìn)行了胃鏡復(fù)查，其中顯效13例，有效10例，無效5例;隔姜灸組23例患者治療后進(jìn)行了胃鏡復(fù)查，其中顯效7例，有效9例，無效7例。根據(jù)Ridit分析結(jié)果，隔藥餅灸組胃鏡病理學(xué)療效優(yōu)于隔姜灸組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Pearson卡方檢驗(yàn)結(jié)果，隔藥餅灸組總有效率82.14%，隔姜灸組總有效率69.57%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表6。

2.5 DNA甲基化測序分析

經(jīng)DNA樣本檢測和文庫質(zhì)檢，8個樣本文庫均合格，可用于全基因組甲基化測序分析。

2.5.1 全基因組平均甲基化水平 對所有樣本在全基因組范圍和CG、CHG、CHH不同序列環(huán)境下的C位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，隔藥餅灸組治療前全基因組平均甲基化水平為0.047 25，隔藥餅灸組治療后全基因組平均甲基化水平為0.046 15，隔姜灸組治療前全基因組平均甲基化水平為0.040 14，隔姜灸組治療后全基因組平均甲基化水平為0.039 96。在CG序列環(huán)境下，隔藥餅灸組和隔姜灸組樣本甲基化水平均高于CHG與CHH序列，2種灸法治療組間全基因組平均甲基化水平類似。見表7和圖1。

2.5.2 差異甲基化區(qū)域（DMR）檢測 差異甲基化區(qū)域是指不同樣本或者組別間的甲基化水平有明顯區(qū)別，由基因組上連續(xù)甲基化位點(diǎn)構(gòu)成的一個區(qū)域，可調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而影響基因功能。應(yīng)用Metilene軟件分析具體的DMR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同組間比較的DMRs絕大多數(shù)都位于CG序列環(huán)境，CHH次之，而在CHG序列下的DMRs最少。因此，下面僅展示在CG序列環(huán)境下2組治療前后比較的DMR個數(shù)。如表8所示，CG序列環(huán)境下，隔藥餅灸組治療前后比較共有1 384個DMRs，其中高甲基化狀態(tài)的DMR數(shù)有758個，低甲基化水平的有626個;隔姜灸組治療前后比較共有6 327個DMRs，其中高甲基化狀態(tài)的DMR數(shù)有3 195個，低甲基化水平的有3 132個。

2.5.3 DMR錨定啟動子區(qū)域差異甲基化基因的篩選 基于DMR在基因組上的分布，篩選出CG序列環(huán)境下，隔藥餅灸組治療前后、隔姜灸組治療前后的基因啟動子區(qū)域差異甲基化基因。CG序列環(huán)境下，隔藥餅灸組治療前后共有176個差異甲基化基因，隔姜灸組治療前后共有652個差異甲基化基因。通過文獻(xiàn)檢索，結(jié)合這些差異基因涉及的信號通路，列出與炎癥、胃炎、胃癌前病變或胃癌等相關(guān)的差異甲基化基因。見表9～10。

2.5.4 DMR錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因KEGG富集分析 基于DMR在基因組上的分布，對和基因啟動子區(qū)域有交疊的基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。對富集最顯著的20條通路進(jìn)行展示。見圖2。CG序列環(huán)境下：2組治療前后DMR錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因涉及的KEGG通路均包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工。另外，隔藥餅灸組涉及的KEGG通路還包括cAMP、AMPK、核因子κB信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等;隔姜灸組涉及的KEGG通路還包括mTOR、HIF-1信號通路、代謝通路、細(xì)胞凋亡等。2組治療前的DMR錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因涉及的KEGG通路包括AMPK、HIF-1、cAMP信號通路等。2組治療后的DMR錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因涉及的KEGG通路包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、癌癥的途徑、RIG-I-樣受體信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解等。

3 討論

CAG的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，西醫(yī)治療CAG只能針對患者癥狀給予對癥處理，如抗幽門螺桿菌感染藥物、胃黏膜保護(hù)制劑、促胃動力藥物等，雖短期內(nèi)有一定療效，但長期服用會造成藥物耐受和不良反應(yīng)，效果并不理想。中醫(yī)認(rèn)為，脾胃乃人體后天之本，氣血生化之源，“內(nèi)傷脾胃，百病由生”“有胃氣則生，無胃氣則死”[13]。本病的發(fā)生以本虛（脾胃虛弱）為主，加之外感寒邪、飲食不節(jié)（潔）、情志不舒，使氣機(jī)不暢、胃失和降，從而引起胃脘疼痛、腹脹痞悶、惡心嘔吐、噯氣泛酸等不適。隔物灸，是將艾炷與皮膚之間襯隔藥物或材料進(jìn)行施灸的一種方法[14]?，F(xiàn)代研究表明，隔物灸主要通過在體表穴位運(yùn)用艾灸的熱力及藥物的透皮作用，綜合其溫?zé)嵝?yīng)、輻射效應(yīng)、藥化效應(yīng)等，發(fā)揮灸、藥、穴3者的聯(lián)合效用[15]，芳香性藥物如附子、生姜等，可使藥物的透皮吸收能力極大提高[16]。另外，通過實(shí)驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)[17]，隔附子餅灸、隔姜灸等在燃燒過程中所產(chǎn)生的光譜與人體穴位紅外輻射光譜高度一致，因穴位輻射共振原理而形成最佳吸收，其效用優(yōu)于傳統(tǒng)艾條灸。足三里乃胃之下合穴，《靈樞·邪氣藏府病形》有云“合治內(nèi)府”，說明下合穴是治療六腑病的主要穴位;而胃之募穴中脘，因其位置與胃脘部相近，因而在治療胃腑病上有其特殊療效。足三里與中脘“合募相配”，此乃取合穴和募穴在治療上的共同特性，通過相互協(xié)作以增強(qiáng)通調(diào)腑氣、和胃止痛的療效。而足三里與內(nèi)關(guān)的“上下配穴”，體現(xiàn)了中醫(yī)治病的整體觀念，在足三里通調(diào)胃氣之際，內(nèi)關(guān)可寧神和胃，共治嘔吐呃逆、不思飲食等證。氣海乃元?dú)庵?，藏精之府，足三里乃胃氣之本，水谷精微之源，兩穴相配，可助胃熟谷，升陽健運(yùn)。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過6個月治療，隔藥餅灸組及隔姜灸組患者的中醫(yī)癥狀積分均顯著降低，其中隔藥餅灸組總有效率87.88%，隔姜灸組總有效率78.79%，2組患者治療后胃脘痞滿、食后腹脹、泛酸、噯氣、口苦、便秘、精神疲乏、畏寒怕冷、煩躁易急、失眠多夢等癥狀改善明顯，提示隔藥餅灸、隔姜灸治療均能有效改善患者上述臨床癥狀。同時，隔藥餅灸在改善患者胃脘疼痛、食欲減退癥狀更具優(yōu)勢，而隔姜灸在改善患者燒心、反胃癥狀更優(yōu)。隔藥

餅灸的藥餅以制附子、肉桂等中藥配比而成，共奏溫陽健脾、理氣和中之效以治其本，清熱燥濕、活血化瘀以治其標(biāo)，針對患者胃脘疼痛、食欲減退等癥狀，充分發(fā)揮了其和胃止痛、健脾助運(yùn)之功。隔姜灸取生姜“嘔家圣藥”之特性，針對患者反胃、燒心等癥狀，體現(xiàn)了其溫中止嘔、和胃降逆之良效。本研究中，綜合評估胃黏膜組織病理學(xué)的炎癥、活動性、萎縮、腸化生、異型增生等5項(xiàng)病變程度，結(jié)果顯示隔藥餅灸組患者治療后胃黏膜的炎癥、萎縮、腸化病變程度明顯改善，而隔姜灸組患者治療后胃黏膜的萎縮、腸化病變程度也有明顯改善，對于積分無明顯變化的活動性及異型增生2項(xiàng)病變進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸組活動性呈陽性的8例患者在治療后均較前好轉(zhuǎn)，隔姜灸組9例陽性患者好轉(zhuǎn)，2例無改變;異型增生在2組各有2例病例呈陽性，治療后隔藥餅灸組2例均轉(zhuǎn)陰，隔姜灸組2例無變化。由此可見，雖然這2項(xiàng)病變的分值改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但艾灸對胃黏膜炎癥活動性及異型增生仍有改善趨勢，其療效有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合胃鏡及胃黏膜組織病理學(xué)結(jié)果顯示，隔藥餅灸組總體有效率82.14%，隔姜灸組總體有效率69.57%，2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示隔藥餅灸、隔姜灸治療均能改善CAG患者胃黏膜組織病理學(xué)變化，減輕CAG患者胃黏膜萎縮、腸化病變程度。

DNA甲基化是最重要的表觀遺傳修飾形式之一，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團(tuán)添加到胞嘧啶的5′位置上，從而產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶[18]。其中CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點(diǎn)，此區(qū)域稱為CpG島[19]，DNA甲基化的異常在CAG及其相關(guān)性癌變的發(fā)展中有重要作用，在慢性胃炎患者中，胃黏膜的炎癥反應(yīng)使大量CpGs發(fā)生超甲基化和低甲基化[20]。本研究結(jié)果顯示，8個外周血樣本中C位點(diǎn)甲基化主要發(fā)生在CG序列環(huán)境下，CG序列環(huán)境下的全基因組平均甲基化水平均高于CHG與CHH序列。通過對組間全基因組平均甲基化水平比較發(fā)現(xiàn)，2組治療前后的全基因組平均甲基化水平無明顯差異，且組內(nèi)每組治療前后的甲基化水平基本類似。這可能是由于人的個體差異較大，不同CAG患者的全基因組甲基化水平本身也存在較大差異，此外，全基因組甲基化水平反映的是所有差異基因的整體水平，關(guān)鍵還是要聚焦具體基因的甲基化水平是增高或降低。本研究中，組間比較的DMRs基本都位于CG序列環(huán)境。隔藥餅灸組治療前后DMR錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因涉及cAMP、AMP活化蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）和核因子κB信號通路等炎癥相關(guān)通路;隔姜灸組涉及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）和缺氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1）信號通路、代謝通路、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞凋亡等與自噬、免疫炎癥、代謝相關(guān)的通路。以往研究發(fā)現(xiàn)萎縮性胃炎大鼠胃黏膜核因子κB/HIF-1α通路異常激活[21]，CAG患者不同胃黏膜萎縮病變程度也與p-NF-κB p65表達(dá)正相關(guān)，針刺可能通過調(diào)節(jié)核因子κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起到減輕CAG炎癥反應(yīng)，減輕胃黏膜細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用[22-23];mTOR通路異常激活、胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡增加在CAG胃癌前病變的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要作用[24-26]。

綜上所述，艾灸可能通過調(diào)節(jié)差異甲基化基因的甲基化水平，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與調(diào)節(jié)這些基因涉及的信號通路，從而起到治療CAG的作用。甲基化調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，本研究只初步觀察了艾灸對CAG患者外周血DNA甲基化譜的影響，只是對DMR錨定啟動子區(qū)域相關(guān)基因進(jìn)行了KEGG富集分析，還不能充分說明差異基因的甲基化水平是否發(fā)生變化，今后可運(yùn)用高通量BSP甲基化測序進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等深入探討這些基因?qū)AG的影響，為艾灸治療CAG的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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（2022-01-06收稿 本文編輯：吳珊）