張宇琪，彭 湉，周新麗

（上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

益生菌具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、提高機(jī)體免疫力、維持腸道菌群平衡等益生功能[1]。植物乳桿菌作為益生菌的一種，具有免疫調(diào)節(jié)、降低血液膽固醇水平和心血管疾病發(fā)病率等諸多益生功能[2]。為了在宿主上發(fā)揮其益生功能，在生產(chǎn)加工、儲存和胃腸道消化期間應(yīng)確保有足夠數(shù)量的活細(xì)胞。但是，在各階段菌體的生存力受如底物濃度、環(huán)境pH 等因素影響，難以保證菌體的存活率，大大減少了植物乳桿菌的益生效果[3]。微膠囊技術(shù)是對益生菌細(xì)胞進(jìn)行微囊化包封的一種有效保護(hù)方式[4]，可以提高菌體對不利條件的抵抗力，從而減少活性損失。

封裝益生菌的壁材是提高益生菌存活率的關(guān)鍵因素之一。目前常用的益生菌封裝壁材分為多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)三大類[5]。海藻酸鈉是最常用的微生物封裝壁材之一，但其多孔結(jié)構(gòu)、在過量Ca2+情況下凝膠易分解等特點干擾益生菌的保護(hù)和釋放，因此，可將海藻酸鈉與其他天然聚合物共混以改善微囊性質(zhì)[6]。劉仁杰等[7]將大豆分離蛋白/乳清分離蛋白和海藻酸鈉等制備成蛋白質(zhì)-多糖復(fù)配壁材用于植物乳桿菌的包埋，實現(xiàn)了植物乳桿菌的高效率封裝。因膠凝原理近似，海藻酸鈉與低酯果膠復(fù)配體系水溶液在鈣離子存在下具有協(xié)同膠凝特性，有利于植物乳桿菌的高效封裝[8-9]。Chun 等[10]以海藻酸鈉和吉蘭糖膠/阿拉伯膠為多糖-多糖復(fù)合壁材制備植物乳桿菌微膠囊，包封率高于單一壁材。而脂質(zhì)通常用作藥物載體，目前使用脂質(zhì)作為益生菌微囊化壁材的研究較少[5]。新型復(fù)合壁材研究是目前益生菌微膠囊研究值得探索的一個重要方向，復(fù)合壁材的濃度配比也是影響益生菌包埋的重要因素，有必要對其進(jìn)行壁材優(yōu)化，從而獲取最高的封裝效率。

為了保護(hù)益生菌活細(xì)胞免受不利環(huán)境因素的影響并將其傳遞到腸道，益生菌微膠囊化封裝技術(shù)的選擇尤為重要。擠壓法常用于益生菌的封裝[11-12]，但擠壓法制備的微膠囊粒徑相對較大（2～5 mm左右），微膠囊化過程較緩慢，不利于規(guī)?；a(chǎn)。乳化法微囊化細(xì)胞生長快、細(xì)胞漏出少，模擬胃腸道條件下的細(xì)胞存活率高，但該方法不能準(zhǔn)確地控制微膠囊的尺寸范圍和形狀[13]。微滴噴射法是將空氣流和壁材-菌懸液構(gòu)成共流，利用氣流將菌懸液快速吹打成微滴，直接噴入交聯(lián)劑中實現(xiàn)凝膠化。微滴噴射法能夠減小微囊尺寸、增加微囊產(chǎn)量，試驗過程快速且溫和，可實現(xiàn)益生菌的高效封裝。文獻(xiàn)[14]通過使用與空氣壓縮機(jī)相連的霧化噴頭成功地將耐酸乳桿菌La-14 封裝在抗性淀粉、殼聚糖和藻酸鹽中，微膠囊的大小為55～70 μm。

本文以海藻酸鹽、低酯果膠和卵磷脂為壁材原料，利用微滴噴射系統(tǒng)制備植物乳桿菌微膠囊，首先對微滴噴射的氮氣流速進(jìn)行優(yōu)化，其次通過單因素和正交試驗確定復(fù)合壁材濃度，最后對制備的植物乳桿菌微膠囊的耐酸性和腸溶性進(jìn)行測試。微滴噴射法制備植物乳桿菌微膠囊為益生菌微膠囊的生產(chǎn)制備與壁材優(yōu)化提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

植物乳桿菌，杜邦中國集團(tuán)有限公司上海分公司；海藻酸鈉、低酯果膠、卵磷脂、無水氯化鈣、檸檬酸鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶（酶活力1∶10 000）、胰蛋白酶（酶活力1∶250），生工生物工程（上海）股份有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO18AC，松下醫(yī)療器械有限公司，日本）、高壓滅菌鍋（HRLM-80，青島海爾特種電器有限公司）、低溫離心機(jī)（ST16r，賽默飛技術(shù)（北京）有限公司）、光學(xué)顯微鏡（CFI60，尼康，日本）。

1.2 主要溶液的配制

乳酸細(xì)菌（MRS）培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，檸檬酸二氨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，KH2PO42.0 g，MnSO4·H2O 0.2 g，吐溫80 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5，121℃滅菌20 min。

模擬胃液：0.2% kg/L 的NaCl 溶液，加入濃鹽酸調(diào)至pH 1.5，加入胃蛋白酶（1g/100 mL，酶活力1∶10 000）充分溶解，過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

模擬腸液：6.8 g KH2PO4，500 mL 去離子水，加入0.1 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)至pH 7.4，加入10 g胰蛋白酶（酶活力1∶250），完全溶解后定容至1 000 mL，過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 微滴噴射微囊化裝置搭建

圖1 為微滴噴射微囊化系統(tǒng)示意圖。系統(tǒng)主要由氮氣流輸送裝置、菌懸液注射裝置、噴射噴嘴、收集裝置等部分組成。氮氣流輸送裝置由氮氣瓶提供氮氣流，通過流量計調(diào)節(jié)氮氣流速，雙表頭減壓器調(diào)節(jié)氮氣出口壓力。菌懸液注射裝置由微注射泵按一定速度推動微注射器，勻速穩(wěn)定地注射微生物細(xì)胞懸液，微注射器出口端選用內(nèi)徑為0.16 mm 的平口針頭，平口針頭出口端連接內(nèi)徑0.3 mm 的聚四氟乙烯軟管，輸送微生物細(xì)胞懸浮液[15-16]。軟管的另一端連接噴射噴嘴，該噴嘴由200 μL 的移液器槍頭和25G 的尖口針頭制作而成，如圖2 所示，將移液器槍頭尖端切去2 mm后，用針頭從距槍頭尖端2 cm 處側(cè)面插入，直至針頭露出槍頭尖端2 mm。接收裝置采用的是50 mL的無菌離心管。

圖1 微滴噴射裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of micro-droplet spray device

圖2 形成微滴的共流原理圖Fig.2 Cocurrent schematic diagram of droplet formation

微滴噴射系統(tǒng)的工作原理是：由氮氣流和壁材-菌懸液構(gòu)成共流，在氮氣流的剪切作用下將含有益生菌微生物細(xì)胞的菌懸液吹打成微滴，產(chǎn)生的微滴直接噴入下方盛有氯化鈣的收集裝置中。因產(chǎn)生的微滴體積足夠小，凝膠速率會明顯提升，微滴與氯化鈣直接接觸易實現(xiàn)凝膠固化。進(jìn)行噴射實驗時，由氮氣流和含有益生菌的菌懸液構(gòu)成共流，在菌懸液的分子擠壓及氮氣流剪切的機(jī)械力作用下，于噴嘴處形成微液滴。

1.4 植物乳桿菌微膠囊的制備

植物乳桿菌培養(yǎng)及菌懸液制備：將菌粉溶解并接種至已滅菌冷卻的MRS 固體培養(yǎng)基上37℃恒溫傳代培養(yǎng)2～3 次，完全活化后挑取單個菌落接種到MRS 液體培養(yǎng)基中壯大，在4℃條件下經(jīng)6 000 r/min 離心10 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2 次后離心并等體積重懸于生理鹽水中。

壁材配制：按一定濃度配制海藻酸鈉-低酯果膠-卵磷脂復(fù)合壁材溶液，并將收集得到的菌體加入到復(fù)合壁材溶液中，按菌∶壁材為1∶4 的比例混合均勻。用無菌注射器吸取適量混合液，固定在微滴噴射系統(tǒng)的泵送裝置上，泵送速度設(shè)置為200 μL/min，氮氣速度設(shè)置為3 L/min，將菌和壁材的混合液噴入氯化鈣溶液中進(jìn)行凝膠反應(yīng)，靜置30 min，4 000 r/min 離心5 min 后去上清液收集微膠囊，并用無菌生理鹽水洗滌2 次，再次離心收集植物乳桿菌微膠囊。

1.5 微膠囊的性能測定

粒徑大?。弘S機(jī)抽取微滴噴射制備的植物乳桿菌微膠囊若干，置于顯微鏡下拍照獲取放大40 倍的微膠囊照片，每組樣本選取3 個視野，設(shè)置3 次平行實驗。拍攝的照片用Image-Pro Plus 處理軟件對微膠囊粒徑大小進(jìn)行測量統(tǒng)計。

包埋率：取1 mL 植物乳桿菌微膠囊，加入9 mL濃度為0.06 mol/L 的無菌檸檬酸鈉解囊液，放置在恒溫?fù)u床中37 ℃，180 r/min 振蕩使其完全崩解后，梯度稀釋平板點樣法進(jìn)行菌落計數(shù)（cfu/mL）。包埋率計算公式為

式中：E為包埋率；a為微膠囊包埋菌落數(shù)；b為初始菌液菌落數(shù)。

1.6 壁材優(yōu)化試驗設(shè)計

a.單因素試驗。

海藻酸鈉質(zhì)量濃度：低酯果膠質(zhì)量濃度0.75% kg/L，卵磷脂質(zhì)量濃度0.75% kg/L，氯化鈣濃度0.4 mol/L，海藻酸鈉濃度分別為0.5%，1%，1.5%，2%，2.5% kg/L。

低酯果膠質(zhì)量濃度：海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5% kg/L，卵磷脂質(zhì)量濃度0.75% kg/L，氯化鈣濃度0.4 mol/L，低酯果膠質(zhì)量濃度分別為0.25%，0.5%，0.75%，1%，1.25% kg/L。

卵磷脂質(zhì)量濃度：海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5% kg/L，低酯果膠質(zhì)量濃度0.75% kg/L，氯化鈣濃度0.4 mol/L，卵磷脂質(zhì)量濃度分別為0.25%，0.5%，0.75%，1%，1.25% kg/L。

氯化鈣濃度：海藻酸鈉質(zhì)量濃度1.5% kg/L，低酯果膠質(zhì)量濃度0.75% kg/L，卵磷脂質(zhì)量濃度為1% kg/L，氯化鈣濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mol/L。

用微滴噴射法制備植物乳桿菌微膠囊，測定微膠囊的粒徑和包埋率。結(jié)合微膠囊的形態(tài)，分析海藻酸鈉、低酯果膠、卵磷脂以及氯化鈣對植物乳桿菌微膠囊粒徑和包埋率的影響。

b.正交試驗。

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，以植物乳桿菌微膠囊包埋率為評價指標(biāo)，對海藻酸鈉、低酯果膠、卵磷脂的質(zhì)量濃度（%（kg/L））以及氯化鈣濃度（mol/L）選擇相對適宜的水平進(jìn)行正交試驗（L9(34)），探索復(fù)合壁材的最佳濃度組合。

1.7 微膠囊在模擬消化道中的性能研究

微膠囊胃液耐受性試驗：將益生菌微膠囊置于37 ℃，pH 1.5 的模擬胃液中，混合均勻后放置在37 ℃，200 r/min 的恒溫?fù)u床溫育，分別在0，30，60，90，120 min 時取樣，用無菌生理鹽水洗凈后，加入檸檬酸鈉溶液釋放菌體，并用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。每組樣品重復(fù)3 次平行試驗。

微膠囊胃腸道釋放試驗：將益生菌微膠囊置于37 ℃模擬腸液中，混合均勻后放置在37 ℃，200 r/min 的恒溫?fù)u床溫育，分別在0，30，60，90，120 min 時取樣，稀釋至合適的梯度，用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。每組樣品重復(fù)3 次平行試驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 微滴噴射法制備植物乳桿菌微膠囊

壁材濃度分別為低酯果膠0.75% kg/L，卵磷脂0.75% kg/L，氯化鈣0.4 mol/L，海藻酸鈉1.5% kg/L，菌懸液注射速度200 μL/min，氮氣速度為1 L/min 和2 L/min時，流速較慢，生成微膠囊粒徑大且不均勻；氮氣流速為4 L/min，對液面造成的壓力過大，形成漩渦影響液滴凝膠的過程，從而導(dǎo)致微膠囊球形度較差。當(dāng)?shù)獨馑俣? L/min 時，植物乳桿菌微膠囊如圖3 所示，粒徑大小分布圖如圖4 所示。從圖4 中可以看出，微膠囊的粒徑分布較為集中，微膠囊球形度較好，微膠囊的粒徑變異系數(shù)為4.94%，粒徑均勻且可控。劉歡[17]使用噴霧干燥法對乳酸菌進(jìn)行包封，制備所得的微膠囊粒徑為15～20 μm，但其形狀普遍呈不規(guī)則狀，且制備過程中涉及高溫，易至植物乳桿菌失活。對比擠壓法、噴霧干燥等傳統(tǒng)工藝，微滴噴射法可對微膠囊的形態(tài)及粒徑大小精準(zhǔn)控制，制備過程溫和且迅速。

圖3 植物乳桿菌微膠囊Fig.3 Lactobacillus plantarum microcapsules

圖4 微膠囊粒徑正態(tài)分布圖Fig.4 Normal distribution of microcapsule size

2.2 植物乳桿菌微膠囊制備單因素試驗

使用不同濃度的壁材制備的植物乳桿菌微膠囊的粒徑和包埋率如圖5 所示。

圖5 不同壁材濃度下植物乳桿菌微膠囊粒徑和包埋率Fig.5 Microcapsule size and embedding rate of Lactobacillus plantarum under different concentrations of biological materials

微膠囊的粒徑隨海藻酸鈉質(zhì)量濃度的增加而增加。由于海藻酸鈉質(zhì)量濃度過低時，微膠囊機(jī)械強(qiáng)度較低，從而影響包埋效果；質(zhì)量濃度過高時，微滴噴射過程中導(dǎo)致微膠囊形狀粒徑分布不均，包埋率下降。選取1.5% kg/L 海藻酸鈉作為適宜組分。

低酯果膠質(zhì)量濃度為0.75% kg/L 時包埋率達(dá)到最高82.1%，當(dāng)?shù)王スz質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，微膠囊的包埋率下降。加入低酯果膠使海藻酸鈣凝膠表面的多孔結(jié)構(gòu)改善，減少微滴噴射包菌過程中菌體的損失，從而提高微膠囊的包埋率，但質(zhì)量濃度過高時，益生菌菌體不易分散。選取0.75% kg/L 低酯果膠作為適宜組分。

由于卵磷脂的兩親性特質(zhì)，其質(zhì)量濃度的增加使得微膠囊的球形度得到了一定程度的改善。卵磷脂質(zhì)量濃度增加，粒徑逐漸減小，質(zhì)量濃度為1% kg/L 時達(dá)到最高包埋率80.0%。選取1% kg/L卵磷脂作為適宜組分。

氯化鈣濃度持續(xù)增大時，微膠囊的包埋率下降。由于鈣離子含量的增加，使得海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更密致，微滴噴射包菌過程中菌體損失較少；鈣離子含量過高時，結(jié)合位點少，包埋率變化較小。選取0.4 mol/L 為包埋植物乳桿菌的最佳氯化鈣濃度。

2.3 植物乳桿菌微膠囊制備條件正交試驗

在上述單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以植物乳桿菌微膠囊包埋率為評價指標(biāo)，對海藻酸鈉、低酯果膠、卵磷脂的濃度（%(kg/L)）以及氯化鈣濃度（mol/L）選擇相對適宜的水平進(jìn)行正交試驗（L9(34)），確定復(fù)合壁材的最佳濃度組合。具體正交因素水平值設(shè)置如表1 所示，對應(yīng)試驗結(jié)果如表2 所示。

表1 正交因素水平表Tab.1 Level table of orthogonal factors

表2 正交試驗結(jié)果Tab.2 Orthogonal experimental results

由極差分析可知，各因素對益生菌微膠囊包埋率影響的主次順序為：A（海藻酸鈉）＞D（氯化鈣）＞C（卵磷脂）＞B（低酯果膠）。因此，微膠囊復(fù)合壁材最佳配方為A1D2C2B2，即壁材濃度在海藻酸鈉1% kg/L，氯化鈣0.4 mol/L，卵磷脂1% kg/L，低酯果膠0.75% kg/L 時的保護(hù)效果最好，可使微膠囊的包埋率達(dá)到最高89.05%，顯著高于其他組別。相較于姚澤晨等[18]以阿拉伯木聚糖與海藻酸鈉為壁材，通過銳孔凝固浴法制備植物乳桿菌微膠囊的包埋率73.60%，使用海藻酸鈉、低酯果膠與卵磷脂的復(fù)合壁材實現(xiàn)了較高的包埋率，且微膠囊粒徑可控。

2.4 植物乳桿菌微膠囊在模擬胃腸液中的存活試驗結(jié)果

2.4.1 微膠囊在模擬胃液中的耐受性

按照前面所述的方法進(jìn)行耐受性實驗研究，植物乳桿菌微膠囊及菌懸液在模擬胃液中的存活率如圖6(a)所示。菌懸液在模擬胃液中的存活率隨時間的增加急劇下降，2 h 后降至11.03%。包封的植物乳桿菌的存活率下降較為緩慢，2 h 后存活率為62.3%，活菌數(shù)為4.38×109cfu/mL。與植物乳桿菌菌懸液對比，植物乳桿菌微膠囊能有效抵抗模擬胃液酸性環(huán)境的侵害。文獻(xiàn)[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，由于海藻酸鈉的多孔結(jié)構(gòu)，單獨使用時無法有效對抗胃腸道的惡劣環(huán)境，導(dǎo)致益生菌生存力下降。本研究中添加低酯果膠和卵磷脂后有助于填充海藻酸鈉的孔隙，從而在胃液環(huán)境中保護(hù)植物乳桿菌，提高其存活率。李哲[20]以乳清分離蛋白、海藻酸鈉、丙三醇為復(fù)合壁材，制備了植物乳桿菌微膠囊，菌體包埋率高達(dá) 95.31%，并有效提高了胃脅迫存活率。

圖6 植物乳桿菌微膠囊在模擬胃腸道中的性能Fig.6 Property of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated gastrointestinal tract

2.4.2 微膠囊在模擬腸液中的釋放性

將植物乳桿菌微膠囊加入模擬腸液（pH 6.8，37 ℃）中培養(yǎng)，按照前面所述的方法進(jìn)行腸溶性試驗研究，植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中的活菌數(shù)變化如圖6(b)所示。前0.5 h 植物乳桿菌快速釋放，之后呈緩慢趨勢，2 h 后完全釋放，活菌數(shù)達(dá)7.14×109cfu/mL。海藻酸鈉、低酯果膠、卵磷脂復(fù)合壁材制備的植物乳桿菌微膠囊具有良好的腸溶性，為菌體靶向腸道發(fā)揮益生效果奠定了基礎(chǔ)。脂質(zhì)具有良好的阻水性和阻氣性，是用于親水性生物活性物質(zhì)封裝、保護(hù)和釋放的良好材料。文獻(xiàn)[21]使用明膠和阿拉伯樹膠包裹負(fù)載益生菌的脂質(zhì)微球，研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)可在消化過程中保護(hù)益生菌，并將其釋放到腸道中，從而確保它們的功能性。復(fù)合壁材制備的微膠囊是一種有效的益生菌保護(hù)結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的技術(shù)潛力。

3 總結(jié)與展望

本研究使用海藻酸鹽、低酯果膠和卵磷脂為壁材原料，采用微滴噴射法制備植物乳桿菌微膠囊，結(jié)果證實，復(fù)合壁材和微滴噴射法的使用使得該微膠囊具有均勻的形態(tài)和良好的腸溶性與耐酸性，有利于后續(xù)定殖于腸道發(fā)揮其益生作用。微滴噴射法更是實現(xiàn)了植物乳桿菌的溫和高效封裝，微膠囊的包埋率高達(dá) 89.05%。本研究為提高益生菌的存活率與耐受性，以及包封益生菌微膠囊新型復(fù)合壁材和制備方法研究提供了新思路。本研究僅對多糖-脂質(zhì)型的復(fù)合壁材濃度進(jìn)行探討，可選取蜂蠟、硬脂酸等其他脂質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)化壁材配方，也可探尋其他天然的生物性壁材，以實現(xiàn)更好的益生菌微囊化。微滴噴射法雖然可以實現(xiàn)植物乳桿菌的高效制備，但過程中可能會產(chǎn)生細(xì)小飛沫造成菌體損失，后續(xù)可探索如微流控等更高效穩(wěn)定的微膠囊制備方法。