劉 敏 車文學(xué) 邊偉杰 甘禧霖 趙懷寶

八門灣紅樹林土壤放線菌多樣性及抗病原菌活性分析*

劉 敏 車文學(xué) 邊偉杰 甘禧霖 趙懷寶①

(海南熱帶海洋學(xué)院 海南省現(xiàn)代化海洋牧場(chǎng)工程研究中心 海南三亞 572022)

紅樹林土壤中蘊(yùn)藏著豐富的放線菌資源, 是新菌種的重要來源。為獲得更多新的放線菌資源以用于開發(fā)新的生物活性化合物, 了解放線菌的多樣性是非常重要和必要的。研究采用擴(kuò)增子高通量測(cè)序和傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)八門灣紅樹林土壤放線菌進(jìn)行了非培養(yǎng)和培養(yǎng)水平多樣性研究, 同時(shí)對(duì)其抗病原菌活性進(jìn)行了分析。對(duì)于非培養(yǎng)水平多樣性研究, 與細(xì)菌通用引物相比, 利用放線菌相關(guān)引物可以提高放線菌豐度的檢測(cè)水平, 其百分比含量提高2.47倍; 可以檢測(cè)到放線菌門更多的目、科和屬; 對(duì)于在目水平上的放線菌類群組成來說, Acidimicrobiales、Corynebacteriales、Gaiellales、Kineosporiales、Solirubrobacterales是優(yōu)勢(shì)類群, 但是在用兩對(duì)不同引物得到的結(jié)果中, 其百分含量差異較大。放線菌相關(guān)引物更適合環(huán)境樣品中放線菌多樣性的分析。對(duì)于培養(yǎng)水平多樣性研究, 分離到256株放線菌, 屬于7個(gè)目、9個(gè)科、14個(gè)屬, Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為1.32,(42.58%)和(42.19%)是優(yōu)勢(shì)屬; 與模式菌株的相似性小于98.5%的有13株, 其中菌株HA161004和HA161010與N1165T相似性分別為95.56%和96.80%, 是潛在新種。病原微生物拮抗活性測(cè)定表明, 來自9個(gè)屬的92株代表性菌株具有抗病原菌活性, 其中對(duì)、、、和有拮抗活性的菌株數(shù)量分別為71、25、6、9和19株。研究為選擇更合適的引物以便更客觀地反映環(huán)境中放線菌多樣性提供了數(shù)據(jù)支持, 同時(shí)也為后續(xù)紅樹林放線菌資源收集、活性評(píng)價(jià)和開發(fā)利用提供菌種保障。

放線菌; 多樣性; 抗菌活性; 紅樹林

紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是指位于熱帶和亞熱帶海岸潮間帶, 包括種類豐富的動(dòng)物群落、紅樹木本植物群落、微生物群落的復(fù)雜而獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)。紅樹林生態(tài)系統(tǒng)覆蓋了世界上60%～75%的海岸線, 是生產(chǎn)力水平最高的四個(gè)海洋生態(tài)系統(tǒng)之一(Alongi, 2008)。紅樹林作為重要的近岸濕地生態(tài)系統(tǒng), 具有防風(fēng)消浪、促淤護(hù)岸、調(diào)節(jié)大氣、凈化海水和美化景觀等作用, 對(duì)海洋環(huán)境保護(hù)和生態(tài)平衡有重要的作用(Alongi, 2008)。紅樹林土壤具有高濕度、高鹽度、強(qiáng)還原性、強(qiáng)酸性、營養(yǎng)成分豐富等特點(diǎn), 因此微生物群落具有極高的多樣性和獨(dú)特性(Alongi, 1996)。

放線菌廣泛分布于陸地(Hayakawa, 2000; Xu, 2014)和海洋生境(Demain, 2009; 洪葵, 2013)。由于紅樹林生態(tài)環(huán)境的獨(dú)特性, 被認(rèn)為是分離放線菌新種資源的理想生境(Ser, 2016b; Huang, 2018; 候師師等, 2020; Asha, 2021)。已有研究表明紅樹林土壤中存在豐富多樣的放線菌資源(洪葵, 2013; Claverías, 2015), 部分菌株已被鑒定為新種(Demain, 2009; Suthindhiran, 2010; Arumugam, 2017; Huang, 2018)。放線菌因其具有產(chǎn)生多種生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力而備受關(guān)注(Demain, 2009), 具有多種抗菌、抗氧化、抗癌、神經(jīng)保護(hù)和酶抑制劑等功能(Amrita, 2012; Ser, 2016b; Arumugam, 2017), 在醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生態(tài)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用(Xu, 2014)。然而, 近年來從陸地來源的放線菌中發(fā)現(xiàn)活性化合物效率低(Ser, 2016b), 因此, 從海洋生境中尋找新的放線菌資源及其天然產(chǎn)物越來越受到關(guān)注, 其中紅樹林已成為尋找新的放線菌資源及其天然產(chǎn)物的熱點(diǎn)生境。

為了挖掘出更多新的放線菌菌株以滿足活性物質(zhì)開發(fā), 首先需要了解它們的多樣性。以往的研究主要集中于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)紅樹林放線菌多樣性的研究(Mevs, 2000; Janssen, 2002; Page, 2004; Arumugam, 2017; Law, 2017; Huang, 2018)。本研究將利用兩種不同引物(放線菌相關(guān)引物和細(xì)菌通用引物)對(duì)八門灣紅樹林土壤放線菌在非培養(yǎng)水平多樣性進(jìn)行對(duì)比分析; 利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)紅樹林土壤放線菌在可培養(yǎng)水平多樣性進(jìn)行分析, 同時(shí)分析放線菌的抗病原菌活性, 為后續(xù)從紅樹林生境中挖掘新的放線菌資源提供前期數(shù)據(jù)支持, 也為放線菌的開發(fā)利用提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集地點(diǎn)位于海南省文昌市八門灣紅樹林濕地, 以和為優(yōu)勢(shì)樹種的紅樹林區(qū), 設(shè)立3個(gè)采樣點(diǎn), 于2011年12月采集5～30 cm深的黑褐色泥質(zhì)土壤樣品, 在每個(gè)采樣點(diǎn)采集3份重復(fù)土壤樣品(每份約500 g土壤), 重復(fù)樣品采集點(diǎn)呈正三角形分布（兩點(diǎn)間隔5 m）, 然后將三個(gè)重復(fù)樣品混勻, 將所有樣品混合均勻, 置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 DNA提取和高通量測(cè)序

土壤總DNA的提取按照試劑盒FastPrep?SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 美國)步驟進(jìn)行。利用兩對(duì)引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增, 引物分別是: 放線菌相關(guān)引物(可提高環(huán)境樣品中放線菌的檢出率)ACT235F (CGCGGCCTATCAGCTTGTTG)和ACT878R (CCGTACTCCCCAGGCGGGG), 細(xì)菌通用引物341F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和1073R (5′-ACGAGCTGACGACARCCATG-3′) (Farris, 2007)。PCR反應(yīng)體系為(20 μL混合體系): 4 μL 5× FastPfu Buffer, 2 μL 2.5 mmol/L dNTPs, 0.8 μL 引物1 (5 μmol/L), 0.8 μL 引物2 (5 μmol/L), 0.4 μL FastPfu Polymerase, 10 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序: 95 °C 10 min; 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 30 s; 72 °C 10 min (Liu, 2017)。利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, 美國)膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物純化, 利用QuantiFluor? -ST (Promega, 美國)進(jìn)行定量, 然后送至上海美吉醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序(Roche Genome Sequencer GS FLX+ Titanium platform)。對(duì)獲得的原始序列進(jìn)行拼接、過濾除雜和去除嵌合體等質(zhì)量控制后得到最終分析的有效序列, 通過UPARSE (version 7.1 http:// drive5.com/uparse/)對(duì)有效序列以97%的一致性進(jìn)行聚類分析, 獲得OTU (操作分類單元, operational taxonomic unit)(Yan, 2006; Dias, 2011)。將OTU序列與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)確定OTU的系統(tǒng)發(fā)育信息(Yan, 2006; Dias, 2011; Mendes, 2012), 使用QIIME(版本1.17)處理序列(Caporaso, 2010), 進(jìn)行多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析。將從高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中選取放線菌門序列做進(jìn)一步分析。高通量測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫的序列接收號(hào)為SRX506963和SRX3938853。

1.3 放線菌的分離和16S rDNA序列分析

土壤在室溫下自然風(fēng)干, 然后研磨成粉末。沉淀物粉末采用以下兩種方法處理: 一種方法是將5 g沉淀物粉末懸浮在10 mL林格氏液中, 并將水加熱至55 °C; 另一種方法是將5 g沉淀物粉末在120 °C下加熱1 h, 然后懸浮在10 mL林格氏液中。將沉淀物懸浮液在28 °C搖床(180 r/min轉(zhuǎn)速)搖動(dòng)30 min。利用稀釋涂布平板法, 將稀釋(10-2到10-4)的土壤懸浮液涂布在瓊脂分離培養(yǎng)基上分離放線菌菌株。分離培養(yǎng)基有: 高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基(20 g可溶性淀粉, 1 g KNO3, 0.5 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.1 g FeSO4·7H2O, 15 g瓊脂, 1 L海水, pH 7.2); 腐殖酸維生素培養(yǎng)基(1.0 g腐殖酸, 0.5 g Na2HPO4, 1.7 g KCL, 21 g CaCL2, 0.5 g MgSO4·7H2O, 0.01 g FeSO4·H2O, 復(fù)合維生素, H2O 1 L, 20.0 g瓊脂, pH 7.2; 復(fù)合維生素: 0.5 mg肌醇, 0.5 mg泛酸, 0.5 g氨基苯酸, 0.25 mg生物素, 0.5 mg VB1, 0.5 mg VB2, 0.5 mg VB3, 0.5 mg VB6); 土壤提取物培養(yǎng)基(50%土壤提取物, 2%瓊脂, 1 L海水, pH 6.8)。在分離培養(yǎng)基中, 添加細(xì)菌與真菌抑制劑: 50 μg/mL重鉻酸鉀、100 μg/mL制霉菌素、20 μg/mL萘啶酮酸。將平板置于28 °C恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～4周, 挑取符合條件的單菌落劃線于ISP2培養(yǎng)基上直至菌株純化。純化菌株的16S rDNA序列使用細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增, 引物為27f (5′-AGAGTTTGAT CMTGCCTCAG-3′) 和1492r (5′-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3′), 16S rDNA序列提交至EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育相似性比對(duì)。多樣性分析采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù):

其中P＝N/即第種占總個(gè)體數(shù)的比例。

1.4 抗病原菌活性測(cè)定

為了分析抗菌活性, 菌株在ISP2培養(yǎng)基中28 °C搖床(200 r/min)培養(yǎng), 7～14 d后, 收集發(fā)酵液并離心, 取上清液通過0.45 μm和0.2 μm硝酸纖維素過濾器過濾, 然后使用紙片擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性(Kamei, 2003)。試驗(yàn)中使用的致病微生物菌株為、、、和。

2 結(jié)果與討論

2.1 在非培養(yǎng)水平上放線菌多樣性分析

利用放線菌相關(guān)引物進(jìn)行擴(kuò)增子高通量測(cè)序, 經(jīng)過質(zhì)控檢測(cè)后, 共獲得44 003條有效序列用來進(jìn)一步分析, 測(cè)序深度指數(shù)Good’s coverage為0.986 6～0.989 6, 表明測(cè)序量足夠大, 可以反映樣品中絕大部分的微生物物種信息(附表1)。對(duì)于細(xì)菌群落多樣性, 共檢測(cè)到33個(gè)門, 前10個(gè)門分別是: Actinobacteria (41.56%)、Proteobacteria (29.48%)、Gemmatimonadetes (6.99%)、Chloroflexi (5.71%)、Acidobacteria (4.23%)、Nitrospirae(1.48%)、Bacteroidetes (1.31%)、Chlorobi (1.17%)、Cyanobacteria (1.10%)和Firmicutes (0.97%) (圖1)。對(duì)于放線菌多樣性, 共有18297條序列屬于Actinobacteria門, 共包括15個(gè)目, 分別是: Acidimicrobiales (30.10%)、Corynebacteriales (17.25%)、Gaiellales (9.90%)、Kineosporiales (9.82%)、Solirubrobacterales (6.70%)、Frankiales (5.57%)、Micrococcales (5.11%)、Micromonosporales (4.60%)、Propionibacteriales (3.12%)、Streptomycetales (1.26%)、Pseudonocardiales (0.99%)、PeM15 (0.35%)、Streptosporangiales (0.27%)、Euzebyales (0.11%)、Coriobacteriales (0.05%)和未分類放線菌(4.80%) (圖2); 29個(gè)科(不包括未培養(yǎng)和未分類的科), 32個(gè)屬, 其中百分比大于1%的屬包括(16.2%)、(4.9%)、(2.3%)、(1.5%)、(1.7%)、(1.7%)、(1.3%)、(1.5%)、(1.4%)和(1.3%) (附表2)。

利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增子高通量測(cè)序, 經(jīng)過質(zhì)控檢測(cè), 共有24 821條有效序列用來進(jìn)一步分析, 測(cè)序深度指數(shù)Good’s coverage為0.979 4～0.989 0, 表明測(cè)序量足夠大, 可以反映樣品中絕大部分的微生物物種信息(附表1)。對(duì)于細(xì)菌群落多樣性, 共檢測(cè)到30個(gè)門, 其中前10個(gè)門分別是: Proteobacteria (49.40%)、Actinobacteria (16.79%)、Chloroflexi (9.46%)、Acidobacteria (7.20%)、Gemmatimonadetes (2.74%)、Nitrospirae (2.24%)、Bacteroidetes (2.06%)、Cyanobacteria (1.90%)、Chlorobi (1.89%)、Firmicutes (1.71%)(Fig. 1)。對(duì)于放線菌多樣性, 共有4140條序列屬于Actinobacteria門, 共包括13個(gè)目, 分別是: Gaiellales (28.03%)、Acidimicrobiales (27.57%)、Solirubrobacterales (22.82%)、Kineosporiales (7.10%)、Micrococcales (2.73%)、Frankiales (2.51%)、 Propionibacteriales (1.11%)、Corynebacteriales (0.94%)、Micromonosporales (0.94%)、Streptomycetales (0.51%)、PeM15 (0.27%)、Coriobacteriales (0.22%)、Euzebyales (0.17%)、Streptosporangiales (0.10%)、未分類放線菌(4.97%) (圖2); 23個(gè)科(不包括未培養(yǎng)和未分類的科)(附表2); 17個(gè)屬, 其中百分比大于1%的屬包括(6.43%)、(3.31%)、(2.10%)和(1.62%) (附表2)。

通過對(duì)放線菌相關(guān)引物和細(xì)菌通用引物獲得的數(shù)據(jù)對(duì)比分析可知: (1) 與細(xì)菌通用引物相比, 利用放線菌相關(guān)引物可以檢測(cè)到更多的目、科和屬; (2) 對(duì)于在門水平上的細(xì)菌群落組成來說, Actinobacteria、Proteobacteria、Gemmatimonadetes、Chloroflexi、Acidobacteria都是優(yōu)勢(shì)類群, 但是其百分含量差異較大; 利用放線菌相關(guān)引物可以提高Actinobacteria豐度的檢測(cè)水平, 其百分比含量提高了2.47倍; Gemmatimonadetes的百分比含量提高2.55倍; 此外, 對(duì)于minor-groups(所占百分比小于1%的類群)中Planctomycetes和Verrucomicrobia檢出豐度也分別提高18和11倍; 其中三個(gè)minor-groups (Lentisphaerae、Elusimicrobia和Armatimonadetes)只在利用放線菌相關(guān)引物進(jìn)行測(cè)序時(shí)檢測(cè)到(圖1); (3) 對(duì)于在目水平上的放線菌類群組成來說, 5個(gè)目(Acidimicrobiales、Corynebacteriales、Gaiellales、Kineosporiales、Solirubrobacterales)是豐度相對(duì)較高的類群, 在兩對(duì)不同引物得到的結(jié)果中, 其豐度差異較大; 利用放線菌相關(guān)引物檢出的Corynebacteriales的百分含量提高了18.32倍, Micromonosporales提高了4.89倍, Propionibacteriales、Streptosporangiales、Streptomycetales和Frankiales分別提高了2.81、2.77、2.48和2.22倍。相比之下, 利用細(xì)菌通用引物檢出Solirubrobacterales和Gaiellales的百分比更高, 分別提高3.4和2.83倍(圖2)。

圖1 利用放線菌相關(guān)引物和細(xì)菌通用引物對(duì)八門灣紅樹林土壤細(xì)菌多樣性的分析(門水平)

圖2 利用放線菌相關(guān)引物和細(xì)菌通用引物對(duì)八門灣紅樹林土壤放線菌多樣性的分析(目水平)

通過以上比較分析表明, 利用放線菌相關(guān)引物可以提高放線菌的百分比含量, 更多目、科和屬被檢測(cè)到, 這與前人的研究一致(Mcveigh, 1996; Heuer, 1997; Lüdemann, 2000; Stach, 2003; Sch?fer, 2010)。以前的研究報(bào)道, 某些微生物類群, 特別是具有高G+C含量的類群(如放線菌)在16S rRNA基因庫中被低估(Hill, 2006)。細(xì)菌16S rDNA通用引物不能擴(kuò)增環(huán)境樣品中所有放線菌的該基因片段, 而專門設(shè)計(jì)的放線菌相關(guān)引物可大大提高環(huán)境樣品中放線菌16S rDNA的擴(kuò)增概率(Mcveigh, 1996; Heuer, 1997; Lüdemann, 2000; Stach, 2003)。Stach等(2003)報(bào)道, 利用放線菌相關(guān)引物擴(kuò)增環(huán)境樣品時(shí), 約75% PCR產(chǎn)物序列屬于放線菌門, 本研究中為41.56%, 這說明放線菌相關(guān)引物更適合于環(huán)境樣品中放線菌多樣性的分析。另外, 在非可培養(yǎng)水平上, 利用放線菌相關(guān)引物專門針對(duì)紅樹林放線菌多樣性的研究未見報(bào)道, 目前文獻(xiàn)中主要利用細(xì)菌通用引物研究紅樹林細(xì)菌多樣性, 其中放線菌（Actinobacteria所占比例較低, 所占百分比在以下研究地點(diǎn)分別為: 香港Mai Po Ramsar濕地為2.1% (Jiang, 2013)和3.5% (Wang, 2012), 巴西S?o Paulo State、Rio de Janeiro state Ilha Grande和Bahia state Porto Seguro紅樹林濕地為5.4%～12.2% (Andreote, 2012)、8.4%和7.5% (Thompson, 2013), 馬來西亞Rantau Abang紅樹林濕地為4.55% (Chan, 2015)、深圳灣紅樹林濕地2.2% (Zhang, 2015), 本研究中利用細(xì)菌通用引物檢測(cè)到的放線菌百分比是16.79%, 而用放線菌相關(guān)引物檢測(cè)到的百分比為41.56%, 可見放線菌相關(guān)引物可提高自然環(huán)境中放線菌類群的檢測(cè)水平。此外, 對(duì)于Corynebacteriales類群, 放線菌相關(guān)引物檢出的百分率(17.25%)高于細(xì)菌通用引物(0.94%), 這可能是細(xì)菌通用引物對(duì)該類群也存在一定的低估所致。

本研究中利用放線菌相關(guān)引物和細(xì)菌通用引物檢測(cè)微生物多樣性時(shí), 4個(gè)目(Acidimicrobiales、Gaiellales、Kineosporiales和Solirubrobacterales)和3個(gè)屬(、和)相對(duì)豐度都較高。Acidothermaceae科中的屬中只有一個(gè)種, 代表菌株具有嗜熱、嗜酸性和分解纖維能力(Mohagheghi, 1986), 而紅樹林土壤呈酸性, 且含有大量來自植物落葉的纖維素和木質(zhì)素, 這說明這類細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性, 及其可能參與了紅樹林有機(jī)碳的代謝。是利用放線菌相關(guān)引物檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)的豐度最高的屬, 這類微生物廣泛存在于酸性環(huán)境中, 與紅樹林土壤酸性環(huán)境相適應(yīng); 該屬物種最主要特征是細(xì)胞壁比其他細(xì)菌厚, 疏水、蠟質(zhì)且富含霉菌酸(Faller, 2004), 細(xì)胞壁由疏水霉酸酯層和由阿拉伯半乳聚糖連接在一起的肽聚糖層組成, 對(duì)植物的耐寒性有重要貢獻(xiàn), 細(xì)胞壁這些組成成分的生物合成途徑也成為結(jié)核病新藥的潛在靶點(diǎn), 可見, 紅樹林放線菌是蘊(yùn)藏著豐富的可用于海洋藥物開發(fā)的放線菌資源。

2.2 在培養(yǎng)水平上放線菌多樣性

通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法, 本研究共分離得到放線菌256株, 其中通過水浴55 °C加熱土壤樣品分離到207株, 120 °C加熱1 h土壤樣品分離到49株。利用不同培養(yǎng)基分離到的菌株數(shù)量也不同, 利用高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量最多(共105株), 其次是利用腐殖酸維生素培養(yǎng)基分離到80株, 利用土壤提取物培養(yǎng)基分離到71株。將純化菌株與數(shù)據(jù)庫中的模式菌株做16S rDNA相似性分析, 相似性100%的有58株細(xì)菌, 相似性99.0%～99.9%有155株, 相似性98.5%～ 98.9%有25株, 相似性98.0%～98.5%有11株, 相似性低于98%的有2株, 分別是菌株HA161004和HA161010, 這兩株菌與N1165T相似性為95.56%和96.80% (表1), 表明是潛在新種(Tindall, 2010)。在分離放線菌時(shí), 對(duì)于相似性低于98.5%的13株潛在新種放細(xì)菌, 從不同樣品處理方法來看, 其中4株是通過將土壤樣品水浴55 °C加熱分離到, 9株是通過將土壤樣品120 °C加熱1 h分離到; 從不同培養(yǎng)基來看, 其中6株利用腐殖酸維生素培養(yǎng)基分離到, 7株利用土壤提取物培養(yǎng)基分離到, 由此可知, 為獲得更多的新種資源, 需要嘗試不同的樣品處理方法和多種培養(yǎng)基。

表1 八門灣紅樹林土壤可培養(yǎng)放線菌的16S rDNA序列分析及拮抗病原菌活性分析

Tab.1 16S rDNA sequence analysis and antimicrobial activity of representative actinobacterial strains isolated from Bamenwan mangrove soil

續(xù)表

注: C:; E:; F:; M:; V:; －: 無拮抗活性

國內(nèi)外對(duì)于紅樹林土壤放線菌資源的分離收集已有大量研究(Usha, 2010; Rosmine, 2016; Ser, 2016a, 2016b; Ariffin, 2017; Arumugam, 2017; Law, 2017; Huang, 2018; Asha, 2021), 從紅樹林中分離鑒定的放線菌共有8亞目11科24屬(Xu, 2014)。本研究分離得到的放線菌屬于7個(gè)目, Micromonosporales (46.48%)、Streptomycetales (42.92%)、Actinomycetales (4.69%)、Streptosporangiales (3.13%)、Corynebacteriales (1.95%)、Frankiales (0.39%)和Micrococcales (0.39%); 9個(gè)科; 14個(gè)屬,、、、、、、、、、、、、和, 其中(42.58%)和(42.19%)是優(yōu)勢(shì)屬(表1)。本研究獲得的可培養(yǎng)放線菌多樣性指數(shù)為1.32, 用同樣方法對(duì)其他地點(diǎn)的紅樹林土壤可培養(yǎng)放線菌多樣性進(jìn)行了評(píng)估, 其中在海南三亞沿海紅樹林土壤(馮玲玲等, 2018)、海南西海岸真紅樹根系土壤(候師師等, 2020)、廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤(葉景靜等, 2018)、印度洋紅樹林沉積物(何潔等, 2012)、馬來西亞紅樹林土壤(Lee, 2014)和印度南部沿海紅樹林土壤(Arumugam, 2017)中可培養(yǎng)放線菌多樣性指數(shù)分別為1.74、1.75、1.61、2.16、1.44、0.63, 通過比較可知從印度洋紅樹林沉積物分離得到的放線菌多樣性較高, 可能與選用的培養(yǎng)基種類多有關(guān), 在該研究中選用了24種唯一碳源分離培養(yǎng)基, 可見選用多種不同的培養(yǎng)基對(duì)于獲得多樣的菌株是很重要的, 本研究后續(xù)將繼續(xù)選用其他培養(yǎng)基分離放線菌, 以期獲得更多樣的種類。通過與非培養(yǎng)水平放線菌多樣性對(duì)比分析, 利用擴(kuò)增子高通量測(cè)序能檢測(cè)到更高的多樣性(通過放線菌相關(guān)引物和細(xì)菌通用引物得到的放線菌多樣性指數(shù)分別為2.96和2.41), 表明與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比, 分子方法在發(fā)現(xiàn)微生物多樣性方面更有效(Li, 2014)。并非所有培養(yǎng)的細(xì)菌都在土壤環(huán)境DNA樣本中被檢測(cè)到, 例如屬于、、和的可培養(yǎng)菌株在DNA樣本中存在, 但其他10個(gè)屬, 包括、、、、、、、、和, 沒有被檢測(cè)到。在環(huán)境DNA中未檢測(cè)到, 可能與這10個(gè)屬的豐度低有關(guān)系, 導(dǎo)致提取DNA的難度較大。

以往研究表明、和是海洋沉積物中常被分離到的放線菌(Maldonado, 2005; Bredholdt, 2007; Duncan, 2015; Huang, 2018)。鄭志成等(1989)從紅樹林根際土壤中分離到的放線菌中占75. 7%。Eccleston等(2008)從澳大利亞Sunshine Coast紅樹林土壤中分離到放線菌主要為。在本研究中分離到最多的是, 其中有菌株(HA161045、HA161164、HA161166、HA161001)與模式菌株的相似性較低(表1), 是潛在新種。本研究還分到大量的稀有放線菌, 如、、、等。稀有放線菌的分離通常需要預(yù)處理或者復(fù)雜的富集培養(yǎng)過程(Janssen, 2002; Jensen, 2005; Pathom-Aree, 2006; Bredholdt, 2007; Solano, 2009)。例如本研究中大量的菌株就是通過將土壤樣品進(jìn)行55 °C水浴后在腐殖酸維生素培養(yǎng)基分離到, 其中包括一些潛在新種(如菌株HA13702、HA13639、HA13643)(表1)。近年來已經(jīng)發(fā)表許多新種, 例如(Xu, 2009)、(Law, 2017)、(Ser, 2016a)、(Huang, 2008)、(Liu, 2015)、(Huang, 2015)。此外, 本研究在非培養(yǎng)水平放線菌多樣性分析中得到大量的未分類或者未培養(yǎng)放線菌, 所有以上研究結(jié)果表明紅樹林濕地中分布著大量未被挖掘的放線菌資源, 是發(fā)現(xiàn)新的放線菌的關(guān)鍵區(qū)域。

2.3 拮抗病原菌活性測(cè)定

放線菌因其可產(chǎn)生許多重要的具有生物活性的天然產(chǎn)物, 因此, 仍是生物技術(shù)領(lǐng)域最有用的微生物之一(Sharon, 2014; Xu, 2014)。本研究對(duì)123株代表性菌株進(jìn)行了病原微生物拮抗活性測(cè)定, 其中來自9個(gè)屬(、、、、、、、、)的92株被測(cè)菌株(占總菌株數(shù)的74.8%)具有病原微生物拮抗活性, 其中對(duì)1種病原微生物有拮抗活性的菌株數(shù)量是57, 2種的菌株數(shù)量是32, 3種的菌株數(shù)量是3(分別是菌株HA161225/ HA161279/ HA1362)(表1)。來自和兩個(gè)屬的大部分菌株對(duì)至少1種病原菌是有拮抗活性的, 活性菌株數(shù)量分別是32和50。所有被測(cè)菌株中有71株(占總菌株數(shù)的57.7%)對(duì)有拮抗活性, 25株(占總菌株數(shù)的20.3%)對(duì)有拮抗活性, 6株(占總菌株數(shù)的4.9%)對(duì)有拮抗活性, 9株(占總菌株數(shù)的7.3%)對(duì)有拮抗活性, 19株(占總菌株數(shù)的15.4%)對(duì)有拮抗活性。

來自的成員可產(chǎn)生天然抗生素(Kinkel, 2014; Ser, 2016a)和多種具有抗菌、抗癌、抗氧化和免疫抑制活性的化合物(Rashad, 2015; Ser, 2016b; Law, 2017;候師師等, 2020)。已有研究報(bào)道, 紅樹林放線菌中是天然產(chǎn)物的最主要來源, 其次是(Xu, 2014), 本研究也得到相似的結(jié)果, 作為天然產(chǎn)物主要來源的紅樹林放線菌已成為天然藥物研究的熱點(diǎn)。此外, 來自和兩個(gè)屬的菌株具有拮抗和的活性, 類似結(jié)果在以前的研究中也有報(bào)道(Singh, 2007; Zhang, 2008; 奚逢源等, 2014)。來自以下屬、、和的抗菌活性以往未見報(bào)道, 在本研究中檢測(cè)到了病原菌拮抗活性, 可用于后續(xù)菌株的開發(fā)利用。本研究中來自、、、和的菌株沒有檢測(cè)到抗病原菌活性。由于抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生受到培養(yǎng)基、pH值和培養(yǎng)溫度等因素的影響, 因此, 下一步將研究不同培養(yǎng)條件下菌株的抗菌活性檢測(cè), 以便為菌株開發(fā)利用提供前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

3 結(jié)論

本研究在培養(yǎng)水平和非培養(yǎng)水平分別對(duì)八門灣紅樹林濕地土壤中放線菌的多樣性及其抗病原菌活性進(jìn)行了分析。對(duì)于非培養(yǎng)水平多樣性, 與細(xì)菌通用引物相比, 利用放線菌相關(guān)引物可以提高放線菌豐度的檢測(cè)水平, 可以檢測(cè)到放線菌門更多的目、科和屬; 優(yōu)勢(shì)類群在兩對(duì)不同引物得到的結(jié)果中的百分含量差異較大; 放線菌相關(guān)引物更適合環(huán)境樣品中放線菌多樣性的分析。本研究獲得的可培養(yǎng)放線菌多樣性指數(shù)為1.32,(42.58%)和(42.19%)是優(yōu)勢(shì)屬; 與模式菌株的相似性小于98.5%有13株, 是潛在新種。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比, 基于分子生物學(xué)的方法可以檢測(cè)到更高的微生物多樣性。來自9個(gè)屬的92株(74.8%)代表性菌株具有抗病原菌活性, 其中對(duì)、、、和有拮抗活性的菌株數(shù)量分別為71、25、6、9和19株。

電子附件材料:

附表1、附表2 見http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20210800176

馮玲玲, 楊芹, 張露, 等, 2018. 海南三亞紅樹林放線菌多樣性及抗菌活性[J]. 中國抗生素雜志, 43(11): 1355-1363.

葉景靜, 鄭紅蕓, 吳越, 等, 2018. 廣西茅尾海紅樹林植物根際土壤放線菌多樣性及抗菌活性研究[J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 13(11): 1221-1226, 1231.

何潔, 張道鋒, 徐盈, 等, 2012. 印度洋紅樹林沉積物可培養(yǎng)海洋放線菌多樣性及其活性[J]. 微生物學(xué)報(bào), 52(10): 1195-1202.

鄭志成, 周美英, 姚炳新, 1989. 紅樹林根際放線菌的組成及生物活性[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 28(3): 306-310.

洪葵, 2013. 紅樹林放線菌及其天然產(chǎn)物研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào), 53(11): 1131-1141.

候師師, 李蜜, 姜舒, 等, 2020. 海南西海岸四種真紅樹根系土壤放線菌物種多樣性及其延緩衰老活性初篩[J]. 廣西植物, 40(3): 320-326.

奚逢源, 薛長艷, 郝之奎, 2014.XI的鑒定及抗菌活性研究[J]. 中國抗生素雜志, 39(5): 394-398.

ALONGI D M, 1996. The dynamics of benthic nutrient pools and fluxes in tropical mangrove forests [J]. Journal of Marine Research, 54(1): 123-148.

ALONGI D M, 2008. Mangrove forests: resilience, protection from tsunamis, and responses to global climate change [J]. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 76(1): 1-13.

AMRITA K, NITIN J, DEVI C S, 2012. Novel bioactive compounds from mangrove derived Actinomycetes [J]. International Research Journal of Pharmacy, 3(9): 25-29.

ANDREOTE F D, JIMéNEZ D J, CHAVES D,, 2012. The microbiome of Brazilian mangrove sediments as revealed by metagenomics [J]. PLoS One, 7(6): e38600.

ARIFFIN S, ABDULLAH M F F, MOHAMAD S A S, 2017. Identification and antimicrobial properties of Malaysian mangrove actinomycetes [J]. International Journal on Advanced Science, Engineering and Information Technology, 7(1): 71-77.

ARUMUGAM T, KUMAR P S, KAMESHWAR R,, 2017. Screening of novel actinobacteria and characterization of the potential isolates from mangrove sediment of south coastal India [J]. Microbial Pathogenesis, 107: 225-233.

ASHA K, BHADURY P, 2021.sp. nov., an actinobacterium isolated from mangrove sediment of Sundarbans, India [J]. Archives of Microbiology, 203(4): 1577-1585.

BREDHOLDT H, GALATENKO O A, ENGELHARDT K,, 2007. Rare actinomycete bacteria from the shallow water sediments of the Trondheim fjord, Norway: isolation, diversity and biological activity [J]. Environmental Microbiology, 9(11): 2756-2764.

CAPORASO J G, KUCZYNSKI J, STOMBAUGH J,, 2010. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 7(5): 335-336.

CHAN K G, ISMAIL Z, 2015. Tropical soil metagenome library reveals complex microbial assemblage [J]. BioRxiv, doi: 10.1101/018895.

CLAVERíAS F P, UNDABARRENA A, GONZáLEZ M,, 2015. Culturable diversity and antimicrobial activity of Actinobacteria from marine sediments in Valparaíso bay, Chile [J]. Frontiers in Microbiology, 6: 737.

DEMAIN A L, SANCHEZ S, 2009. Microbial drug discovery: 80 years of progress [J]. The Journal of Antibiotics, 62(1): 5-16.

DIAS A C F, DINI-ANDREOTE F, TAKETANI R G,, 2011. Archaeal communities in the sediments of three contrasting mangroves [J]. Journal of Soils and Sediments, 11(8): 1466-1476.

DUNCAN K R, HALTLI B, GILL K A,, 2015. Exploring the diversity and metabolic potential of actinomycetes from temperate marine sediments from Newfoundland, Canada [J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 42(1): 57-72.

ECCLESTON G P, BROOKS P R, KURTB?KE D I, 2008. The occurrence of bioactive micromonosporae in aquatic habitats of the sunshine coast in Australia [J]. Marine Drugs, 6(2): 243-261.

FALLER M, NIEDERWEIS M, SCHULZ G E, 2004. The structure of a mycobacterial outer-membrane channel [J]. Science, 303(5661): 1189-1192.

FARRIS M H, OLSON J B, 2007. Detection of Actinobacteria cultivated from environmental samples reveals bias in universal primers [J]. Letters in Applied Microbiology, 45(4): 376-381.

SHARON S , KALIDASS S, 2014. Antimicrobial activity of marine actinomycetes Streptomyces Dhinakaran 2011 (JF751041) [J]. International Multidisciplinary Research Journal, 5(1): 158-164.

HAYAKAWA M, OTOGURO M, TAKEUCHI T,, 2000. Application of a method incorporating differential centrifugation for selective isolation of motile actinomycetes in soil and plant litter [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 78(2): 171-185.

HEUER H, KRSEK M, BAKER P,, 1997. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic separation in denaturing gradients [J]. Applied and Environmental Microbiology, 63(8): 3233-3241.

HILL J E, TOWN J R, HEMMINGSEN S M, 2006. Improved template representation in cpn60 polymerase chain reaction (PCR) product libraries generated from complex templates by application of a specific mixture of PCR primers [J]. Environmental Microbiology, 8(4): 741-746.

HUANG H Q, LIU M, ZHONG W D,, 2018.sp. nov., isolated from mangrove mud [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 68(10): 3080-3083.

HUANG H Q, LV J S, HU Y H,, 2008.sp. nov., a novel actinomycete from mangrove sediment [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58(1): 17-20.

HUANG H Q, XING S S, YUAN W D,, 2015.sp. nov., isolated from mangrove sediment [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 107(6): 1541-1546.

JANSSEN P H, YATES P S, GRINTON B E,, 2002. Improved culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of novel members of the divisions Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, and Verrucomicrobia[J]. Applied and Environmental Microbiology, 68(5): 2391-2396.

JENSEN P R, GONTANG E, MAFNAS C,, 2005. Culturable marine actinomycete diversity from tropical Pacific Ocean sediments [J]. Environmental Microbiology, 7(7): 1039-1048.

JIANG X T, PENG X, DENG G H,, 2013. Illumina sequencing of 16S rRNA tag revealed spatial variations of bacterial communities in a mangrove wetland [J]. Microbial Ecology, 66(1): 96-104.

KAMEI Y, ISNANSETYO A, 2003. Lysis of methicillin-resistantby 2, 4-diacetylphloroglucinol produced bysp. AMSN isolated from a marine alga [J]. International Journal of Antimicrobial Agents, 21(1): 71-74.

KINKEL L L, SCHLATTER D C, XIAO K,, 2014. Sympatric inhibition and niche differentiation suggest alternative coevolutionary trajectories among[J]. The ISME Journal, 8(2): 249-256.

LAW W F, SER H L, DUANGJAI A,, 2017.sp. nov., a novel actinobacterium isolated from Malaysia mangrove soil exhibiting antioxidative activity and cytotoxic potential against human colon cancer cell lines [J]. Frontiers in Microbiology, 8: 877.

LEE L H, ZAINAL N, AZMAN A S,, 2014. Diversity and antimicrobial activities of Actinobacteria isolated from tropical mangrove sediments in Malaysia [J]. The Scientific World Journal, 2014: 698178.

LI H, ZHONG Q P, WIRTH S,, 2014. Diversity of autochthonous bacterial communities in the intestinal mucosa of grass carp () (Valenciennes) determined by culture-dependent and culture-independent techniques [J]. Aquaculture Research, 46(10): 2344-2359.

LIU M, CUI Y, CHEN Y Q,, 2017. Diversity of-like bacterial community in the sediments of the Bamenwan mangrove wetland in Hainan, China [J]. Canadian Journal of Microbiology, 63(3): 238-245.

LIU M, XING S S, YUAN W D,, 2015.sp. nov., isolated from mangrove sediment in Hainan, China [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 108(3): 571-577.

LüDEMANN H, CONRAD R, 2000. Molecular retrieval of large 16S rRNA gene fragments from an Italian rice paddy soil affiliated with the class Actinobacteria [J]. Systematic and Applied Microbiology, 23(4): 582-584.

MALDONADO L A, STACH J E M, PATHOM-AREE W,, 2005. Diversity of cultivable actinobacteria in geographically widespread marine sediments [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 87(1): 11-18.

MCVEIGH H P, MUNRO J, EMBLEY T M, 1996. Molecular evidence for the presence of novel actinomycete lineages in a temperate forest soil [J]. Journal of Industrial Microbiology, 17(3/4): 197-204.

MENDES L W, TAKETANI R G, NAVARRETE A A,, 2012. Shifts in phylogenetic diversity of archaeal communities in mangrove sediments at different sites and depths in southeastern Brazil [J]. Research in Microbiology, 163(5): 366-377.

MEVS U, STACKEBRANDT E, SCHUMANN P,, 2000.gen. nov., sp. nov., a budding actinomycete from soils of the Asgard Range (Transantarctic Mountains) [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50: 337-346.

MOHAGHEGHI A, GROHMANN K, HIMMEL M,, 1986. Isolation and characterization ofgen. nov., sp. nov., a new genus of thermophilic, acidophilic, cellulolytic bacteria [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 36(3): 435-443.

PAGE K A, CONNON S A, GIOVANNONI S J, 2004. Representative freshwater bacterioplankton isolated from Crater Lake, Oregon [J]. Applied and Environmental Microbiology, 70(11): 6542-6550.

PATHOM-AREE W, STACH J E M, WARD A C,, 2006. Diversity of actinomycetes isolated from challenger deep sediment (10,898 m) from the mariana trench [J]. Extremophiles, 10(3): 181-189.

RASHAD F M, FATHY H M, EL-ZAYAT A S,, 2015. Isolation and characterization of multifunctionalspecies with antimicrobial, nematicidal and phytohormone activities from marine environments in Egypt [J]. Microbiological Research, 175: 34-47.

ROSMINE E, VARGHESE S A, 2016. Isolation of actinomycetes from mangrove and estuarine sediments of Cochin and screening for antimicrobial activity [J]. Journal of Coastal Life Medicine, 4(3): 207-210.

SCH?FER J, J?CKEL U, K?MPFER P, 2010. Development of a new PCR primer system for selective amplification of Actinobacteria [J]. FEMS Microbiology Letters, 311(2): 103-112.

SER H L, PALANISAMY U D, YIN W F,, 2016a.sp. nov.: A novel Malaysian mangrove soil actinobacterium with antioxidative activity and cytotoxic potential against human cancer cell lines [J]. Scientific Reports, 6: 24247.

SER H L, TAN L T H, PALANISAMY U D,, 2016b.sp. nov., a novel mangrove soil actinobacterium with antioxidative and neuroprotective potentials [J]. Frontiers in Microbiology, 7: 899.

SINGH S B, OCCI J, JAYASURIYA H,, 2007. Antibacterial evaluations of thiazomycin-a potent thiazolyl peptide antibiotic from amycolatopsis fastidiosa [J]. The Journal of Antibiotics, 60(9): 565-571.

SOLANO G, ROJAS-JIMéNEZ K, JASPARS M,, 2009. Study of the diversity of culturable actinomycetes in the North Pacific and Caribbean coasts of Costa Rica [J]. Antonie Van Leeuwenhoek, 96(1): 71-78.

STACH J E M, MALDONADO L A, WARD A C,, 2003. New primers for the class Actinobacteria: application to marine and terrestrial environments [J]. Environmental Microbiology, 5(10): 828-841.

SUTHINDHIRAN K, KANNABIRAN K, 2010. Diversity and exploration of bioactive marine actinomycetes in the Bay of Bengal of the Puducherry coast of India [J]. Indian Journal of Microbiology, 50(1): 76-82.

THOMPSON C E, BEYS-DA-SILVA W O, SANTI L,, 2013. A potential source for cellulolytic enzyme discovery and environmental aspects revealed through metagenomics of Brazilian mangroves [J]. AMB Express, 3(1): 65.

TINDALL B J, ROSSELLó-MóRA R, BUSSE H J,, 2010. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 60(1): 249-266.

USHA R, ANANTHASELVI P, VENIL C K,, 2010. Antimicrobial and antiangiogenesis activity ofKUAP106 from mangrove soil [J]. European Journal of Biological Sciences, 2(4): 77-83.

WANG Y, SHENG H F, HE Y,, 2012. Comparison of the levels of bacterial diversity in freshwater, intertidal wetland, and marine sediments by using millions of Illumina tags [J]. Applied and Environmental Microbiology, 78(23): 8264-8271.

XU J, WANG Y, XIE S J,, 2009.sp. nov., isolated from mangrove sediment [J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59(3): 472-476.

XU D B, YE W W, HAN Y,, 2014. Natural products from mangrove actinomycetes [J]. Marine Drugs, 12(5): 2590-2613.

YAN B, HONG K, YU Z N, 2006. Archaeal communities in mangrove soil characterized by 16S rRNA gene clones [J]. Journal of Microbiology, 44(5): 566-571.

ZHANG S P, LIAO S A, YU X Y,, 2015. Microbial diversity of mangrove sediment in Shenzhen Bay and gene cloning, characterization of an isolated phytase-producing strain of SPC09[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 99(12): 5339-5350.

ZHANG C W, ZINK D L, USHIO M,, 2008. Isolation, structure, and antibacterial activity of thiazomycin A, a potent thiazolyl peptide antibiotic from[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 16(19): 8818-8823.

DIVERSITY AND ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ACTINOBACTERIA IN THE SOIL OF THE BAMENWAN MANGROVE IN HAINAN, CHINA

LIU Min, CHE Wen-Xue, BIAN Wei-Jie, GAN Xi-Lin, ZHAO Huai-Bao

(Modern Marine Ranching Engineering Research Center of Hainan, Hainan Tropical Ocean University, Sanya 572022, China)

Mangrove is recognized a rich source of new Actinobacteria strains. To obtain more Actinobacteria for development of new bioactive compounds, it is important and necessary to understand their diversity. The diversity at culture-independent and culture-dependent level of Actinobacteria in the Bamenwan mangrove soil (Hainan, South China) was investigated by using amplicon high-throughput sequencing and traditional culture methods. The antimicrobial activities of representative isolates were characterized. For the diversity at culture-independent level, compared with bacterial universal primers, the detection level of actinobacterial abundance can be improved using Actinobacteria-related primers by 2.47 times in percentage. More orders, families, and genera of actinomycetes can be detected. Acidimicrobiales, Corynebacteriales, Gaiellales, Kineosporiales, Solirubrobacterales are the dominant orders, but their percentage contents are quite different in the results obtained by two pairs of different primers. Actinobacteria-related primers are more suitable for the analysis of actinobacterial diversity in environmental samples. For the diversity at culture-dependent level, 256 strains of actinobacterial strains were isolated, being affiliated to 7 orders, 9 families, and 14 genera. The Shannon-Wiener diversity index was 1.32.(42.58%) and(42.19%) were the dominant genera. The similarities of 13 strains with the type-strain were below 98.5%. Among them, strains HA161004 and HA161010 were the closest toN1165Twith similarities of 95.56% and 96.80%, respectively, indicating that both were potentially novel strains of species. The determination of antagonistic activity of pathogenic microorganisms showed that 92 representative strains from 9 genera had antimicrobial activity, among which 71, 25, 6, 9, and 19 strains had antagonistic activity against,,,,and, respectively. This study provides data support for selecting more appropriate primers for the actinobacterial diversity, and supplies strain resources for the collection, activity evaluation, and utilization of Actinobacteria in mangrove.

Actinobacteria; diversity; antimicrobial activity; mangrove

*海南熱帶海洋學(xué)院引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目, RHDRC201901號(hào); 海南省重點(diǎn)計(jì)劃項(xiàng)目, ZDYF2020190號(hào); 海南省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)領(lǐng)域)高層次人才項(xiàng)目, 2019RC241號(hào)。劉 敏, 碩士生導(dǎo)師, 副研究員, E-mail: minliu@hntou.edu.cn

趙懷寶, 碩士生導(dǎo)師, 教授, E-mail: 1743670582@qq.com

2021-08-04,

2021-09-12

R915

10.11693/hyhz20210800176