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多肽原料藥的分析和表征

2022-03-25 00:14:00王二琴
上海醫(yī)藥 2022年13期
關(guān)鍵詞:原料藥多肽雜質(zhì)

王二琴

(上海昂博生物技術(shù)有限公司 上海 201417)

多肽的相對(duì)分子質(zhì)量介于典型的有機(jī)小分子和高分子化合物之間。一般來說,多肽是由≤50 個(gè)氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物。多肽廣泛存在于人體內(nèi),并具有重要的生理效能,而多肽類藥物也早已用于臨床治療糖尿病和某些癌癥等[1]。隨著多肽類藥物的不斷出現(xiàn),多肽相關(guān)的分析檢測(cè)研究的重要性亦日益凸顯[2]。

質(zhì)量是保障藥品安全性和有效性的基礎(chǔ)。在制藥企業(yè)按藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范要求進(jìn)行多肽原料藥生產(chǎn)時(shí),如果沒有嚴(yán)格的分析、表征和雜質(zhì)檢測(cè),產(chǎn)品就會(huì)出現(xiàn)問題并可能造成非常嚴(yán)重的后果。本文概要介紹多肽原料藥的分析、表征及其檢測(cè)項(xiàng)目。

1 指導(dǎo)原則

質(zhì)量控制部門是藥品質(zhì)量控制的重要組成部分,產(chǎn)品的各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果只有符合預(yù)先制定的指標(biāo)才能放行。對(duì)于原料藥,人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)發(fā)布的協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則Q7 部分論述了需要進(jìn)行的檢測(cè)項(xiàng)目和建立規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的過程。

隨著市場(chǎng)上多肽類藥物越來越多,藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)必須確立各種多肽原料藥的質(zhì)量控制參數(shù)。為了確保生產(chǎn)的藥品的高質(zhì)量和一致性,多肽原料藥的分析和表征必須考慮采用多項(xiàng)質(zhì)量控制參數(shù),以確保藥品質(zhì)量保證部門能夠在放行產(chǎn)品之前充分評(píng)估產(chǎn)品的質(zhì)量。

2007 年10 月,國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,后者結(jié)合國內(nèi)對(duì)多肽藥物研究和評(píng)價(jià)的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),對(duì)多肽藥物各項(xiàng)藥學(xué)研究提出了一般性要求。多肽原料藥的質(zhì)量與其生產(chǎn)工藝關(guān)系密切,且即使源自同一生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品,不同生產(chǎn)批次的產(chǎn)品的質(zhì)量也可能不同[3]。因此,多肽原料藥的結(jié)構(gòu)完整性表征和質(zhì)量檢測(cè)至關(guān)重要。下面從鑒別、檢驗(yàn)(純度)、含量測(cè)定和其他一般屬性檢測(cè)幾個(gè)方面來介紹多肽原料藥的分析和表征。

2 分析和表征

2.1 鑒別

鑒別主要是為了確認(rèn)多肽的結(jié)構(gòu),即確認(rèn)產(chǎn)品的身分同一性。多肽的鑒別不是簡單、單一的檢測(cè)就能完成的,其一級(jí)結(jié)構(gòu)的確證一般采用質(zhì)譜測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量,色譜測(cè)定氨基酸組成,質(zhì)譜結(jié)合酶切或采用Edman 降解測(cè)定肽序[4]。Edman 降解是一種傳統(tǒng)的、有效的肽序測(cè)定方法,但一般不適用于氨基末端封閉或呈環(huán)狀的多肽;質(zhì)譜檢測(cè)的多肽所含的氨基酸個(gè)數(shù)通常不宜超過25 個(gè),否則會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)解析困難。多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)際上是肽鏈因氫鍵而形成的局部結(jié)構(gòu),其確證一般有X 射線單晶衍射、核磁共振、紅外、紫外、圓二色譜等檢測(cè)方法。多肽結(jié)構(gòu)的鑒別常用到且不限于上述檢測(cè)方法。由于每種檢測(cè)方法只能獲得多肽結(jié)構(gòu)的一些特定信息,故采用正交表征方法是確保能夠準(zhǔn)確鑒別多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵[5]。一般而言,采用磁共振、紅外、紫外檢測(cè)和進(jìn)行氨基酸組成分析即可獲知短肽的結(jié)構(gòu)特征,但對(duì)于中、長肽,則還需要進(jìn)行氨基酸序列分析并結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)來確證肽序的準(zhǔn)確性,即需要進(jìn)行更多的檢測(cè)和分析并對(duì)所得信息進(jìn)行綜合解析與歸屬。必須指出的是,如果能夠得到多肽標(biāo)準(zhǔn)品,可將多肽待檢品與標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖進(jìn)行比對(duì),由此大大簡化和方便多肽的鑒別。多肽的鑒別需要設(shè)定哪些檢測(cè)指標(biāo),取決于多肽的生產(chǎn)工藝、鏈長特點(diǎn)及其與檢測(cè)方法的匹配度。根據(jù)藥典的要求,鑒別中提到的“檢測(cè)”必須能夠達(dá)到檢測(cè)的目的。

2.2 檢驗(yàn)(純度)

檢驗(yàn)(純度)部分主要用來限制有關(guān)物質(zhì)中的雜質(zhì),檢測(cè)多肽的純度和完整性。除目標(biāo)肽外,其他的肽均可視為雜質(zhì),主要包括與目標(biāo)肽結(jié)構(gòu)相似的工藝相關(guān)雜質(zhì)和降解產(chǎn)物、聚合物、殘留溶劑、主成分離子、水分等。工藝相關(guān)雜質(zhì)是指在多肽合成生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)。如在多肽合成生產(chǎn)過程中,為了防止發(fā)生不希望的側(cè)鏈反應(yīng),會(huì)引進(jìn)許多側(cè)鏈保護(hù)基,而后又會(huì)根據(jù)需要清除側(cè)鏈保護(hù)基。由于這些化學(xué)反應(yīng)不是100%的完全反應(yīng),故最后側(cè)鏈保護(hù)基仍可能附著于目標(biāo)肽上,導(dǎo)致多肽相關(guān)物質(zhì)的出現(xiàn)。另外,無論生產(chǎn)工藝如何,由于化學(xué)不穩(wěn)定性,多肽的降解產(chǎn)物都可能會(huì)產(chǎn)生。多肽一般通過水解、氧化、外消旋化等不同機(jī)制[6]而產(chǎn)生降解產(chǎn)物。

高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)是用于多肽及其相關(guān)雜質(zhì)的鑒別、分離和定量的主要方法[7],雜質(zhì)能否被檢出、分離和鑒別是衡量所用方法好壞的重要依據(jù)之一。在執(zhí)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范的制藥企業(yè)中,質(zhì)量控制部門也需負(fù)責(zé)開發(fā)產(chǎn)品分析方法并隨后進(jìn)行驗(yàn)證以確保其準(zhǔn)確性。通常,對(duì)于第一批生產(chǎn)的多肽原料藥,HPLC 純度要求不低于97%,同時(shí)要求其他單一雜質(zhì)含量不超過1%。藥典中的多肽原料藥一般都有規(guī)格和雜質(zhì)限度要求。雜質(zhì)可以指定或不指定,取決于它們存在的含量。雜質(zhì)的限度應(yīng)大于其檢出限度,報(bào)告格式一般為“不超過”。

聚合物是由于產(chǎn)品物理不穩(wěn)定性而導(dǎo)致的通過表面吸附、聚集或沉淀所產(chǎn)生的雜質(zhì),一般通過排阻色譜法檢測(cè)單體和聚合物的含量。元素和有機(jī)試劑雜質(zhì)往往來自產(chǎn)品合成和純化工藝中所使用的材料、試劑和設(shè)備的浸出等。人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)發(fā)布的協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則Q3D 和Q3C 部分分別論述了產(chǎn)品在不同給藥途徑時(shí)需要檢測(cè)的元素雜質(zhì)和殘留溶劑的類型及限度。

關(guān)于有關(guān)物質(zhì)的分析方法及其檢測(cè)限度可依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局有關(guān)部門2004 年發(fā)布的《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行研究和確定,所采用的分析方法必須能夠有效分離工藝相關(guān)雜質(zhì)、降解產(chǎn)物和聚合物等。一般需要對(duì)兩種以上的分析方法進(jìn)行比對(duì)研究。需要指出的是,對(duì)于多肽,不同色譜柱的洗脫效能差異很大。目前市場(chǎng)上有很多多肽分析色譜柱,如選用得合適,可以明顯改善多肽原料藥的雜質(zhì)分離度。

對(duì)多肽主成分離子(如醋酸根、鹽酸根和三氟乙酸根)及水分的檢測(cè),反相色譜法和離子交換色譜法是最常用的方法。反相色譜法主要用于檢測(cè)三氟乙酸根和醋酸根,但其檢測(cè)范圍較窄,且雜質(zhì)峰多而明顯,分離效果可能不佳。不過,反相色譜柱能耐受有機(jī)溶劑,故對(duì)水不溶的多肽樣品,可先添加少量有機(jī)溶劑溶解,然后再用反相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。相比之下,離子交換色譜法一般不能使用有機(jī)溶劑,否則會(huì)損害色譜柱的。當(dāng)然,有些情況下可以改用特殊的離子交換色譜柱。

水分測(cè)定多用卡爾·費(fèi)休滴定法。水份不僅是產(chǎn)品放行的重要指標(biāo),也是產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)中常用的考察指標(biāo)??枴べM(fèi)休滴定法可按原理分為庫侖滴定法和電位滴定法,其中庫侖滴定法靈敏度高,適用于痕量水分檢測(cè),對(duì)于含量偏高的水分檢測(cè),則耗時(shí)較長??筛鶕?jù)多肽原料藥的親疏水性來選用不同的水分測(cè)定方法。藥典也依據(jù)多肽的親疏水性,給出了水份不超過3% ~ 14%的規(guī)定。

2.3 含量測(cè)定

含量(效價(jià))測(cè)定是評(píng)價(jià)多肽原料藥質(zhì)量的主要指標(biāo)之一。藥典中通常采用比較色譜法(樣品稱重時(shí)須在有溫度和濕度控制的條件下進(jìn)行)來測(cè)定,以確定的化學(xué)對(duì)照物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn),但必須有足夠的定量對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品(其本身必須經(jīng)過全檢分析)。指標(biāo)通常以無醋酸或無水多肽表示。這種檢測(cè)的允許限度通常是非對(duì)稱的,上限為100%+允許的試驗(yàn)重復(fù)性(通常是2.0%),下限為100%-(允許的試驗(yàn)重復(fù)性+最大允許雜質(zhì)水平)[8]。采用比較色譜法的前提是必須有足夠的定量對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

多肽的含量測(cè)定也可很容易地由氨基酸組成分析結(jié)果來確定,通過計(jì)算檢測(cè)到的每種氨基酸的摩爾含量得到樣品的總質(zhì)量。這種方法的缺點(diǎn)是在多肽水解過程中有些氨基酸如色氨酸等可能會(huì)被破壞而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。其他方法包括通過元素分析進(jìn)行氮測(cè)定、凱氏定氮分析和在HPLC 檢測(cè)中使用氮特異性檢測(cè)器等,但這些方法對(duì)氨基酸衍生氮沒有特異性,容易產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。

2.4 其他檢測(cè)

除了上述重要的質(zhì)量屬性之外,質(zhì)量控制還須考慮是否需要檢測(cè)產(chǎn)品的其他屬性,如一般屬性,包括外觀、色澤、溶解度、澄清度、酸堿度、可見異物、旋光性和質(zhì)量平衡等。這些屬性都是多肽原料藥質(zhì)量控制的一般要求,同時(shí)也能證明產(chǎn)品批與批間的一致性。溶液的澄清度及其色澤、酸堿度是原料藥質(zhì)量控制的重要指標(biāo),通常應(yīng)做此兩項(xiàng)檢查,特別是對(duì)注射用多肽原料藥。此外,大多數(shù)多肽通過注射或口服給藥,故有微生物和內(nèi)毒素檢測(cè)要求。

從質(zhì)量平衡的角度講,多肽原料藥的檢測(cè)應(yīng)該對(duì)其多肽、主成分離子和水分含量之和進(jìn)行控制,一般要求控制在100%±5%,以確保沒有大量的無機(jī)鹽或其他不明雜質(zhì)的存在[9]。

3 小結(jié)

對(duì)于多肽原料藥生產(chǎn),建立全面、可靠的質(zhì)量控制指標(biāo)是建立可重復(fù)的生產(chǎn)工藝的必要前提。上述鑒別、檢驗(yàn)(純度)、含量測(cè)定和一般屬性檢測(cè)是多肽原料藥全檢的必要組成。根據(jù)不同多肽的不同生產(chǎn)工藝,多肽原料藥的分析、表征內(nèi)容可適當(dāng)調(diào)整。多肽原料藥只有通過了所有的預(yù)定質(zhì)量檢測(cè)后才能被放行使用。

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