張希平，田 菊，木其爾，余向陽，李拖平，李 勇

（1.沈陽農業(yè)大學食品學院，沈陽 110161；2.省部共建國家重點實驗室培育基地/江蘇省食品質量安全重點實驗室，南京 210014；3.江蘇省農業(yè)科學院農產品質量安全與營養(yǎng)研究所，南京 210014）

隨著全球人口的增長和人均食品消費量的增加，全球對食物中青菜的需求也在增加[1]，而農藥的使用可以提高糧食作物的產量。目前在我國使用的農藥種類多種多樣，如殺蟲劑、殺菌劑和除草劑等，由于其獨特的性質，如廣譜活性、低使用率、系統(tǒng)活性和靈活的施用方法等，已在世界范圍內廣泛的使用。但它們的使用往往與環(huán)境污染和害蟲抗藥性有關，甚至對青菜本身造成一定的影響。每年到達目標生物體的農藥施用量通常不到1%，其他大部分由于偏離目標而沉積在土壤中，或者通過葉面吸收和土壤-根遷移在作物中積累；而環(huán)境中的殘留物可能會被非目標生物（包括脊椎動物和無脊椎動物）吸收，從而增加對食品和環(huán)境安全的風險[2-3]。

近年來，農藥暴露對青菜生理代謝及品質的影響已成為研究熱點，代謝組學可用于研究農藥對青菜代謝的影響。LI等[4]發(fā)現低濃度吡蟲啉在長期暴露下可以促進上海青莖葉部分生物量累積，即存在毒物興奮效應，利用基于LC-QTOF/MS 的非靶向代謝組學技術分析不同暴露時期上海青莖葉樣品，發(fā)現吡蟲啉暴露初期對上海青產生一定氧化應激反應，而吡蟲啉暴露后期對上海青的氧化應激反應得到一定緩解，基于代謝通路分析發(fā)現，吡蟲啉可能通過調控上海青的氮代謝通路來促進植物生長。LIU 等[5]基于代謝組學結合轉錄組學分析3種不同農藥對水稻植株的脅迫響應，發(fā)現丁草胺可以影響碳水化合物代謝途徑，干擾淀粉-蔗糖的分布，毒死蜱顯著影響了氨基酸代謝途徑，導致游離氨基酸含量增加和可溶性蛋白質降解，三環(huán)唑顯著影響脂肪酸代謝途徑，主要編碼油體膜蛋白的DEGs 顯著上調，導致飽和脂肪酸（棕櫚酸和硬脂酸）減少，不飽和脂肪酸（亞麻酸和十八碳二烯酸）增加。ZHANG等[6]發(fā)現有機氯殺蟲劑林丹和十氯酮施用可以影響玉米根中淀粉和糖代謝，造成蔗糖含量下降。CHEN等[7]發(fā)現殺菌劑代森錳鋅可以調控萵苣中抗壞血酸鹽、糖、脂質和核苷酸以及氨基酸含量。

本研究基于代謝組學研究不同類型殺蟲劑噻蟲嗪、殺菌劑戊唑醇農藥對上海青葉片的脅迫響應。通過土培方式種植青菜，并向青菜噴施推薦劑量的兩種不同類別的殺蟲劑噻蟲嗪和殺菌劑戊唑醇農藥，基于LCQTOF/MS 的非靶向代謝組學分析青菜莖葉樣品，分析不同農藥對青菜的代謝影響。本研究結果有助于農藥生態(tài)環(huán)境風險評價，并對農藥安全使用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

上海青（Brassica rapavar.chinensis）的種子購自江蘇省農業(yè)科學院；噻蟲嗪和戊唑醇標準品購買自上海源葉生物科技有限公司。乙腈（MeCN）和甲醇（MeOH）均為色譜（HPLC）級，購自上海安培科學儀器有限公司（上海）。過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒由南京建城生物工程研究所有限公司（南京）提供。

1.2 盆栽試驗

將上海青種子移到育苗盤中催芽生長，培養(yǎng)4周后，選擇大小相似的植物，用無菌水沖洗蔬菜幼苗的根部，將這些蔬菜幼苗轉移到裝有農田土的育苗盒培養(yǎng)。將噻蟲嗪和戊唑醇標準品分別溶于甲醇中，參照商品農藥標簽規(guī)定使用劑量農藥推薦劑量，噻蟲嗪為2g 有效成分/0.0667hm2，戊唑醇為15g 有效成分/0.0667hm2，計算蔬菜盆栽面積，配置相應體積農藥溶液，并進行噴施，對照組噴施含有10μL甲醇的水溶液。培養(yǎng)1周后，采集5株上海青莖葉組織，剪碎混成1個樣品，每個處理組共收集5組樣品，并用于生理指標測定以及代謝組學測定，其中代謝組學樣品進行液氮速凍，研缽粉碎后，保存于-80℃冰箱。

1.3 生理指標測定

使用試劑盒分析蔬菜莖葉的生理活性指標，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）。首先將新鮮蔬菜莖葉樣品（0.5g）切碎后與生理鹽水以1∶9（W/V）的比例混合。樣品在低溫條件下提取，并以3500r·min-1的速度離心10min。根據試劑盒使用說明，取上清液用于檢測超氧化物歧化酶、過氧化物酶和丙二醛的含量[8]。

1.4 代謝組學分析

1.4.1 樣品提取 稱取0.05g莖葉樣品于10mL離心管中，加入3mL甲醇水溶液（V/V=80∶20），振蕩提取20min，5000r·min-1離心15min 后，移取1mL 上清液過0.22μm 濾膜于進樣小瓶。然后每個樣品各取20μL 混成質量控制（QC）樣品，待上機檢測。

1.4.2 代謝圖譜測定 使用配備Shimadzu HPLC（LC-20A）和Sciex QTOF/MS（Triple TOF 5600+）的LC-QTOF/MS 檢測植物葉片樣品的代謝譜圖。每個樣品均以正電離和負電離模式進行分析。梯度流動相由水（A）和乙腈（B）組成，其中正電離模式流動相A 為0.1%的甲酸，負電離模式流動相A 為5mmol·L-1的醋酸銨，色譜條件：0～3.0min，10%B；3.0～21.0min，10%B線性增加至95%B；28.0～34.0min，10%B。色譜柱為LC HSS T3色譜柱，規(guī)格為：150mm×2.1 mm×3.5μm。所有代謝樣品均在信息依賴采集（IDA）模式下采集，質量掃描范圍均為50～1000m/z，正電離和負電離模式下的離子源電壓分別為5500V 和4500V，正模式和負模式下的碰撞能量（CE）分別設置為-30V 和30V。在數據采集之前，將QC 樣品運行5次以確保質譜儀在相關實驗條件下達到平衡，隨后每5個樣品進行1次檢測。

1.4.3 代謝組學數據分析 利用MS-DIAL 軟件對LC-QTOF/MS 數據進行分析，獲得質譜峰的信息，包括保留時間、精確質量數、二級質譜及一級質譜峰面積。通過主成分分析（PCA）方法分析不同樣品指紋圖譜代謝差異。通過PLS-DA（VIP＞1）、t檢驗（p＜0.05）篩選差異質譜峰，利用開源數據庫（HMDB、METLIN 等）差異質譜峰進行鑒定，比對保留時間、一級質譜和二級質譜準確度，利用Metaboanalyst 軟件（https://www.metaboanalyst.ca）進行差異代謝物代謝通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 農藥噴施對青菜生理指標影響

植物受脅迫下會產生活性氧，破壞細胞脂質、蛋白質和DNA，并誘導植物調節(jié)復雜的抗氧化防御系統(tǒng)，以消除活性氧的毒性作用，保護植物細胞免受氧化損傷[8-9]。SOD 和POD 是抗氧化酶，SOD 首先通過歧化作用將超氧陰離子轉化為H2O2，POD 繼續(xù)將H2O2轉化為H2O 和O2[10]。圖1為農藥噴施后青菜葉片中SOD、POD 活性水平變化。與對照組相比，兩種農藥噴施均增加了青菜的SOD 和POD 活性，說明噴施農藥對青菜造成了氧化應激。此外，噻蟲嗪處理組POD活性比戊唑醇處理組高，兩種農藥的SOD活性和MDA含量無顯著差異。MDA是在自由基引起的脂質過氧化過程中產生的，是脂質過氧化的指標[11]。兩種農藥脅迫均造成青菜葉片MDA 含量增多，表明膜脂過氧化作用增加[12]?；谝陨蠑祿砻?，兩種農藥在推薦劑量下均對青菜生理造成一定的影響，且不同類型農藥的影響程度不同。

圖1 兩種農藥對上海青莖葉生理指標影響Figure 1 Effect of two pesticides on physiological activities in vegetables tissues

2.2 代謝組學分析

主成分分析（PCA）是一種常用的數據降維方法，它對數據中的原始變量進行線性組合，得到幾個正交的成分（即主成分）對原數據的協(xié)方差陣進行解釋，其屬于無監(jiān)督模式識別，在主成分分析投影圖中，相近的樣品會聚到一起，不相似樣品的空間距離較遠。本試驗利用奇異值分解方法對代謝組學數據進行主成分分析。主成分分析結果（圖2）可以看出，3 組青菜樣品代謝圖譜存在明顯差異，說明兩種農藥可以顯著影響青菜指紋代謝圖譜?；诜讲罘治黾百|譜數據庫比對，共鑒定出98 個顯著變化代謝物（p＜0.05），包括21 個類黃酮、13 個有機酸、9 個氨基酸、10 個核苷、2 個生物堿、7 個酚酸、9 個脂類、4 個糖磷酸、3 個維生素、2 個生物堿、7個其他（圖3）。噻蟲嗪處理組中，顯著上調代謝物40種，其中變化最多的代謝物為腺嘌呤、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素、喜樹醇-3-O-葡萄糖、煙酸、甘油酸、木犀草素4'-O-葡萄糖、鳥苷、楊梅苷；顯著下調代謝物28種，其中變化最多的代謝物為芐基硫代葡萄糖苷、吲哚甲基硫代葡萄糖苷、阿魏酰腐胺等、（2S）-2-羥基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷、新蕓薹素、甲氨蝶呤、4-吡哆醇酸、β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、丁香脂素吲哚-3-甲醛等。戊唑醇處理組中，顯著上調代謝物24 種，其中變化最多的代謝物為黃腐酚、二氫辣椒素、海生菊甙、谷胱甘肽、3-羥基黃酮、苯乙酸、亞油酸、N2-甲基鳥苷、甘油酸、龍膽苦苷等；顯著下調代謝物47 種，其中變化最多的代謝物為芐基硫代葡萄糖苷、阿魏酰腐胺、二裂酸、棉子糖、吲哚-3-甲醛、N、N-二甲基精氨酸、煙酰胺、精氨酸、松三糖、脯氨酸等。

圖2 主成分分析（PCA）不同處理組代謝圖譜差異Figure 2 PCA analysis the metabolic profiling of vegetable samples in different groups

利用MetaboAnalyst軟件進行代謝通路富集分析，具體結果如圖4，兩種不同農藥處理均顯著影響了上海青葉片中的黃酮和黃酮醇的生物合成、煙酸酯和煙酰胺代謝和三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）。此外，噻蟲嗪處理顯著影響了亞油酸代謝、苯丙烷生物合成和C5-分支二元酸代謝；戊唑醇處理影響了丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝、次級代謝產物生物合成和亞油酸代謝。

氨基酸是植物初級代謝的必需成分，在植物的生理過程中起著重要作用，可作為滲透調節(jié)物質，調節(jié)氣孔開度，并作為合成防御相關代謝物和信號代謝物的前體[13-15]。本試驗中共檢測到9個差異變化的氨基酸。與對照組相比，噻蟲嗪處理組中差異氨基酸有4個，且均顯著增多，而戊唑醇處理組中顯著增多的氨基酸有1個，顯著降低的氨基酸有8 個。噻蟲嗪脅迫下，上海青中脯氨酸顯著積累，有助于穩(wěn)定酶和膜結構，從而提高植物耐受脅迫的能力[16]；而在戊唑醇脅迫下，脯氨酸顯著減少。谷胱甘肽是一種非酶抗氧化劑，是植物抗氧化防御系統(tǒng)的組成部分，可防止活性氧對重要細胞成分的損傷[17-18]。在戊唑醇處理時，葉片中谷胱甘肽顯著積累，有利于植物清除過剩的自由基從而保護植物免受農藥脅迫引起的氧化損傷[19-20]；而在噻蟲嗪處理組沒有顯著變化。在不同農藥處理下，兩種防御型氨基酸變化趨勢不一致，可能說明植物響應兩種農藥脅迫響應不一致。谷氨酰胺和精氨酸、N,N-二甲基精氨酸是葉片中主要的富含氮的氨基酸，主要參與無機氮的固定[21]。噻蟲嗪脅迫造成青菜葉片中谷氨酰胺和N,N-二甲基精氨酸顯著累積，表明固定無機氮的過程可能得到加強，有利于核酸和蛋白質的合成[22]。在戊唑醇處理組，這三種氨基酸顯著降低，表明固定無機氮的過程可能受到影響。此外，相比噻蟲嗪，戊唑醇處理后的葉片其他氨基酸含量也顯著降低，包括異亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、色氨酸等。以上結果表明，兩種農藥均可以影響青菜氨基酸代謝，但兩種農藥處理后葉片中氨基酸含量差異很大。

糖和有機酸不僅被認為是植物構建碳骨架和提供能量所需的代謝資源，也是影響青菜風味的重要因素[23]。本實驗中共檢測到13個差異變化有機酸和4個差異變化糖磷酸。與對照組相比，噻蟲嗪處理組中顯著增多的有機酸有4 個、糖磷酸1 個，顯著降低的有機酸有4 個；而戊唑醇處理組中顯著增多的有機酸有3 個，顯著降低的有機酸有6個、糖磷酸均顯著降低。糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑可以產生大量能量物質及各種中間代謝產物，是碳代謝和氮代謝聯系的樞紐[24]。蘋果酸、檸檬酸和丁二酸是三羧酸（TCA）循環(huán)的中間體，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和三羧酸循環(huán)反應初期的產物，磷酸烯醇丙酮酸是糖酵解作用與糖質新生作用的中間產物[25]。兩種農藥處理后4個有機酸和糖磷酸的累積趨勢不一致，噻蟲嗪噴施后，檸檬酸和6-磷酸葡萄糖顯著上調，蘋果酸顯著下調，而丁二酸沒有顯著變化；戊唑醇噴施后，丁二酸顯著上調，檸檬酸和6-磷酸葡萄糖顯著下調，而蘋果酸沒有顯著變化；而兩種農藥處理差磷酸烯醇丙酮酸含量均減少。6-磷酸甘露糖、棉子糖和松三糖不僅是可溶性糖，還可作為滲透保護劑、前體和細胞對某些脅迫效應的反應的能量來源[26]。戊唑醇處理組中6-磷酸甘露糖、棉子糖和松三糖均顯著下調，由此可以說明，兩種農藥對植物糖酵解和三羧酸循產生一定影響，但中間產物累積不一致。甘油酸是甘油氧化形成的三碳醇酸，是絲氨酸降解的中間產物，磷酸化后生成甘油酸3-磷酸，可進一步異生成糖或進一步參與糖酵解。兩種農藥處理后甘油酸含量均顯著增多，甘油酸增多后會影響植物糖酵解過程。此外，噻蟲嗪還促進葉片中檸康酸、喹啉酸含量增多，而丙酸、馬來酸含量減少；戊唑醇還促進葉片中2-羥基苯乙酸增多，而哌啶酸、莽草酸、葡萄糖酸、檸康酸顯著減少。由此可以發(fā)現兩種農藥均可以影響青菜糖酸代謝，影響青菜品質。

核苷類物質是核酸的結構單元，與細胞能量代謝有關[27]。本試驗中共檢測到10 個差異變化核苷類物質。與對照組相比，噻蟲嗪處理組中顯著增多的核苷類有5 個，顯著降低的核苷類有5 個；而戊唑醇處理組中顯著增多的核苷類有1 個，顯著降低的核苷類有4個。腺嘌呤、鳥嘌呤和鳥苷是核酸RNA 和DNA 有關的前體物質[28]，噻蟲嗪處理組中，腺嘌呤、鳥嘌呤和鳥苷顯著上升。5'-單磷酸腺苷和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸均與能量代謝有關，而在兩種農藥處理下，兩種物質均顯著降低，其可能與植物響應農藥脅迫有關。

脂質不僅是提供細胞膜結構完整性和能量來源的必不可少的生物分子，而且對于細胞信號傳導也至關重要[29-30]。本試驗中共檢測到9 個差異變化脂質，與對照組比，噻蟲嗪處理組亞油酸顯著增加，戊唑醇處理組葉片中棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸均顯著增加。亞麻酸、亞油酸為不飽和脂肪酸，自由基會影響細胞膜中的不飽和脂肪酸，導致脂質過氧化等一系列連鎖反應并使細胞膜產生損傷[29]。亞麻酸和亞油酸具有顯著的抗氧化活性，并且可以調節(jié)細胞膜的流動性，植物細胞可以使用亞麻酸來合成信號分子茉莉酸，從而激活植物抵抗昆蟲傷害和許多病原體的防御能力并調節(jié)植物的生長[31]。以上結果表明，青菜響應農藥脅迫產生不飽和脂肪酸，提高植物對農藥的防御能力。

圖3 熱圖分析不同處理組顯著變化的差異代謝物Figure 3 Heatmap analysis of metabolites with significant differences vegetable shoots

植物會產生大量多樣的次級代謝產物，這些代謝產物介導了植物與其生物和非生物環(huán)境的相互作用。植物次生代謝途徑主要有苯丙烷代謝途徑、異戊二烯代謝途徑和生物堿合成途徑等[32]。酚酸和類黃酮是苯基丙酸途徑的重要合成物質。本試驗中共檢測到28個差異變化次級代謝產物。與對照組相比，噻蟲嗪處理組中顯著增多的次級代謝產物有17 個，顯著降低的次級代謝產物有5 個；而戊唑醇處理組中顯著增多的次級代謝產物有10 個，顯著降低的次級代謝產物有7 個。在噻蟲嗪的脅迫下，黃酮類物質顯著積累，其中異鼠李素、山奈酚、楊梅苷和異鼠李素3,4'-二葡萄糖分別顯著上調2.35，1.47，1.82，1.67 倍；在戊唑醇脅迫下，異鼠李素、楊梅苷和異鼠李素3,4'-二葡萄糖苷分別上調1.12，1.24，1.34 倍，而山奈酚顯著下調0.68 倍。黃酮類化合物的變化，表明兩種農藥脅迫對青菜產生了氧化應激。此外，在葉片中也檢測到了苯丙烷生物合成途徑中的衍生物（酚類物質）發(fā)生了顯著變化（圖3）。酚類化合物是強大的抗氧化劑，可作為自由基清除劑和還原劑[33]。在噻蟲嗪脅迫下，奎寧酸、阿魏基奎寧酸和芥子酸上調1.29，1.16，1.23 倍，有利于清除自由基，增強植物防御能力；在戊唑醇脅迫下，芥子酸和阿魏基奎寧酸顯著下調（0.77倍和0.85倍），對青菜造成了一定的氧化損傷。

硫代葡萄糖苷是植物中一類富含氮、硫元素的次生代謝產物，當植物受到脅迫時，會分配物質用于生產更多的次生代謝產物來應對脅迫[34]。非生物脅迫如缺磷脅迫、殺蟲劑污染以及CO2脅迫會通過促進甲硫氨酸等氨基酸的代謝促進硫代葡萄糖苷的合成[35-37]。本試驗中共檢測到11 個硫代葡萄糖苷。與對照組相比，噻蟲嗪處理組中顯著增多的硫代葡萄糖苷有3個，顯著降低的硫代葡萄糖苷有6個；而戊唑醇處理組中顯著增多的硫代葡萄糖苷有3 個，顯著降低的硫代葡萄糖苷有5 個。其中吲哚甲基硫代葡萄糖苷在兩種農藥處理下均顯著減少，有文獻報道重度脅迫會導致植物中硫代葡萄糖苷分解來合成生長必需物質以抵御脅迫傷害或造成植物死亡[38]。吲哚類硫代葡萄糖苷在酶的水解下會產生吲哚3-甲醇、吲哚-3-乙酰睛等化合物，這些化合物具有一定的生物活性，能夠抑制微生物的生長并對某些昆蟲和草食動物具有威懾作用。通過以上分析可以發(fā)現，農藥噴施可以顯著影響植物硫代葡萄糖苷代謝[39]。

圖4 差異代謝富集的代謝通路Figure 4 Metabolic pathway analysis based on the metabolites with significnat difference

3 結論

本研究以殺蟲劑噻蟲嗪和殺菌劑戊唑醇為例，研究農藥噴施對上海青生理代謝影響。試驗結果表明，兩種農藥噴施均對青菜造成一定脅迫響應，致使抗氧化酶活性水平及膜脂過氧化提高。基于代謝組學分析，發(fā)現兩種農藥均可以影響青菜指紋代謝圖譜，共鑒定出98個差異代謝物，其中類黃酮、硫代糖苷、有機酸、氨基酸等物質種類最多，其中兩種農藥均可以促進葉片中類黃酮含量增加，其可能與青菜抵御農藥脅迫有關；噻蟲嗪導致大部分氨基酸、酚酸含量累積，而戊唑醇處理組則相反；戊唑醇可以增加葉片中不飽和脂肪酸（亞麻酸和亞油酸）含量增多，而降低糖類組分（松三糖和棉子糖）含量。此外，兩種農藥還影響青菜葉片中有機酸、核苷、硫代糖苷等組分代謝。