姚 濤，徐植紅，姚紀(jì)友，夏 雨，陸敏強(qiáng)，蘭 天，劉 冰

1 廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣州 510006；2 華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院/廣州市第一人民醫(yī)院 肝膽二科，廣州 510180

盡管手術(shù)、放/化療、免疫治療和靶向治療部分提高了肝細(xì)胞癌(HCC)的臨床療效，但HCC仍是全球癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織[2]預(yù)測(cè),到2030年將有超過(guò)100萬(wàn)患者死于HCC。HCC形成的具體發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚[3]。近年來(lái)研究[4]證明巨噬細(xì)胞在腫瘤的惡性生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用，巨噬細(xì)胞功能異常調(diào)節(jié)與HCC有關(guān)，M2型巨噬細(xì)胞對(duì)包括HCC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用[5]。最近研究[6]表明，腫瘤免疫微環(huán)境中的M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)了HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。但現(xiàn)有研究多集中于巨噬細(xì)胞如何調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，而對(duì)腫瘤細(xì)胞馴化巨噬細(xì)胞的機(jī)制尚未明確，阻礙了靶向巨噬細(xì)胞抗腫瘤策略的發(fā)展。

外泌體是一種能夠在細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息交流的胞外囊泡。癌細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞之間的串?dāng)_已被廣泛研究，然而，腫瘤細(xì)胞如何激活M2型巨噬細(xì)胞的機(jī)制在HCC中仍不清楚。因此，本研究通過(guò)超速離心的方法提取外泌體，研究來(lái)源于HCC細(xì)胞的外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，探討其在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系 Hep G2細(xì)胞株、L02細(xì)胞株、人源單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞(THP-1)購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)中心。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 DMEM、RPMI 1640(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；TSG101、CD63(英國(guó)Abcam公司)；Arg-1、CD163(美國(guó)CST公司)；佛波酯(美國(guó)Sigma公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔、抗鼠二抗(美國(guó)Promega公司)；β-actin抗體(北京TransGen Biotech公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；SYBR Green Supermix(美國(guó)Bio-Rad公司)；TAKALA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TAKALA公司)。

1.2.2 主要儀器 LC480熒光定量PCR儀(型號(hào)：Roche LC 48032qw，瑞士Roche公司)；超凈工作臺(tái)(型號(hào)：BCM-1000A，美國(guó)AIRTECH公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：4111，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；高速離心機(jī)(型號(hào)：Beckman Optima L-100XP，美國(guó)Beckman Coulter公司)；高速離心管(批號(hào)：P00128MPI，美國(guó)Beckman Coulter公司)；微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(型號(hào)：PowerPac Basic，美國(guó)Bio-Rad)；化學(xué)發(fā)光儀(型號(hào)：3300029-7Q，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；納米激光粒度儀(型號(hào)：Litesizer 500，奧地利Anton Paar公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程都嚴(yán)格在超凈臺(tái)無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)條件：溫度37 ℃，CO2含量5%以及飽和濕度培養(yǎng)箱環(huán)境。Hep G2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，THP-1細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3.2 外泌體提取分離 采用超速離心法從Hep G2細(xì)胞培養(yǎng)基中分離出外泌體。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Hep G2細(xì)胞平鋪在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁過(guò)夜后去除含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并使用無(wú)血清培養(yǎng)基維持細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基。采用差速離心法依次以1000×g離心10 min，3000×g離心20 min，10 000×g離心30 min取上清，用0.22 μm的膜過(guò)濾。最后，將上清液置于固定角轉(zhuǎn)子中，以4 ℃ 100 000×g離心70 min，棄去上清，PBS重懸備用。

1.3.3 HCC細(xì)胞來(lái)源外泌體表征

1.3.3.1 透射電子顯微鏡(TEM)檢測(cè) 用1%戊二醛固定外泌體，將20 μL含外泌體的上清液滴在銅網(wǎng)上，室溫下放置5 min，用濾紙條吸取銅網(wǎng)一側(cè)多余液滴。取2%的磷鎢酸溶液10 μL滴于臘盤上，將銅網(wǎng)放置于染液表面靜置5 min后用濾紙將多余的染料溶液吸收并丟棄。在室溫下干燥后，將銅網(wǎng)放在樣品槽中，在TEM下觀察并拍照。

1.3.3.2 納米激光粒度儀分析外泌體粒徑 將外泌體用適量PBS稀釋置于比色皿，納米激光粒度儀Litesizer 500分析外泌體粒徑。

1.3.3.3 蛋白免疫印跡 加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液重懸外泌體，提取總蛋白進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。將提取蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。TSG101和CD63一抗在 4 ℃ 冰箱中孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法顯色拍照。

1.3.4 HCC細(xì)胞外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化

1.3.4.1 巨噬細(xì)胞模型的構(gòu)建 在小皿種植密度為7.5×105個(gè)/皿THP-1細(xì)胞，加入15 ng佛波酯(PMA)誘導(dǎo)24 h貼壁后實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)CD68表達(dá)。

1.3.4.2 qRT-PCR檢測(cè)CD68表達(dá) CD68引物序列，上游引物：5′-CACGCAGCACAGTGGACATTCT-3′，下游引物：5′-TGGGGCAGGAGAAACTTTGCC-3′；GAPDH引物序列，上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′均由廣州銳博公司設(shè)計(jì)與合成。按照常規(guī)Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定提取總RNA濃度，按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，條件:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保持。逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；變性(95 ℃，28 s)，復(fù)性(55 ℃，28 s)，延伸(74 ℃，35 s)反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，CD68表達(dá)水平采用 2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3.4.3 外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 將PMA誘導(dǎo)的人單核巨噬細(xì)胞，分別用PBS和正常肝細(xì)胞分泌的外泌體(L02-Exo)作為陰性對(duì)照，Hep G2細(xì)胞分泌的外泌體(Hep G2-Exo)低(10 μg)、中(20 μg)、高(30 μg)劑量和陽(yáng)性對(duì)照IL-4+IL-13 20 ng/mL分別孵育誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞，檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1、CD163。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8和Image J軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的表征

2.1.1 外泌體形態(tài)特征 通過(guò)TEM對(duì)超速離心法提取到的外泌體進(jìn)行鑒定，Hep G2和L02細(xì)胞來(lái)源外泌體均拍到了圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)，電鏡下囊泡大小為100 nm左右(圖1)。

注：a，Hep G2-Exo；b，L02-Exo。

2.1.2 外泌體粒徑分布 通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射粒度儀對(duì)外泌體進(jìn)行粒徑大小的檢測(cè)，超速離心法提取得到的外泌體其粒徑大小為(172.65±2.34)nm (圖2)，該結(jié)果符合外泌體的正常粒徑大小。

圖2 外泌體粒徑分布圖

2.1.3 外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101表達(dá)水平 CD63和TSG101均在所提外泌體中表達(dá)，且表達(dá)豐度較高，而在超速離心后的上清液中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)，說(shuō)明經(jīng)提取后上清液已不含外泌體，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法能從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中高效提取外泌體(圖3)。

注：EDS，超速離心分離外泌體后的上層液體。

2.2 PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的CD68表達(dá)水平 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞標(biāo)志物CD68的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，經(jīng)PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中CD68表達(dá)水平顯著增加(6.67±0.98 vs 1.00±0.25，t=11.20,P<0.001)。

2.3 標(biāo)志蛋白Arg-1、CD163的表達(dá)水平 通過(guò)HCC細(xì)胞來(lái)源的外泌體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞模型(M0)，并檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組(L02來(lái)源外泌體)，HCC細(xì)胞來(lái)源外泌體(低、中、高3種劑量)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M0后，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1、CD163表達(dá)均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖4)。

圖4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg-1、CD163表達(dá)

3 討論

HCC是一種原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，是目前全球第四大常見的癌癥相關(guān)死亡原因，發(fā)病率不斷上升，預(yù)后不良。由于現(xiàn)有的治療方法有限，因此迫切需要開發(fā)新的治療方法。

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)外環(huán)境，由細(xì)胞成分和非細(xì)胞成分構(gòu)成，細(xì)胞成分包括腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞成分，非細(xì)胞成分主要是指細(xì)胞外基質(zhì)以及各種細(xì)胞因子[7]。巨噬細(xì)胞作為組成腫瘤微環(huán)境的主要細(xì)胞成分之一，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖發(fā)揮重要的作用[8]。巨噬細(xì)胞可在多種細(xì)胞因子的作用下分化成不同亞型[9]。它可以分泌促血管生成因子和各種細(xì)胞因子介質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和腫瘤相關(guān)的血管生成。

外泌體是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外環(huán)境粒徑為30～200 nm的小膜泡[10]，首次被Harding和Pan等發(fā)現(xiàn)[11-12]。此外，外泌體參與了細(xì)胞間的通訊，通過(guò)向鄰近的細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)移信號(hào)調(diào)節(jié)微環(huán)境和免疫系統(tǒng)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)正?；虍惓５纳镞^(guò)程[13-14]。外泌體不僅能啟動(dòng)目標(biāo)細(xì)胞的下游信號(hào)，而且還能將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到下游細(xì)胞，為細(xì)胞間的交流提供了新的機(jī)制[12]。

此前，針對(duì)腫瘤治療和預(yù)后評(píng)估的思路大多局限在腫瘤細(xì)胞本身。近年來(lái)，腫瘤微環(huán)境尤其是巨噬細(xì)胞在腫瘤治療和預(yù)后評(píng)估等臨床行為中的價(jià)值受到了越來(lái)越多的關(guān)注?，F(xiàn)有研究也表明，腫瘤來(lái)源的外泌體通過(guò)激活巨噬細(xì)胞的M2極化而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Qian等[15]發(fā)現(xiàn)，低氧膠質(zhì)瘤來(lái)源的外泌體中的miRNA-1246可以通過(guò)STAT3和NF-κB途徑靶向TERF2IP，進(jìn)而誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞的極化。低氧環(huán)境下，HCC細(xì)胞來(lái)源外泌體促進(jìn)了腫瘤的增殖、遷移和侵襲[16]。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤來(lái)源的外泌體中的miRNA-934能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2的極化，促進(jìn)結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。外泌體與HCC的發(fā)生發(fā)展有著重要聯(lián)系，F(xiàn)ang等[18]發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞來(lái)源的miRNA-1247-3p外泌體靶向作用于B4 GALT3，促進(jìn)成纖維細(xì)胞激活并分泌 IL-6和IL-8等促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展和HCC的肺轉(zhuǎn)移。此外，外泌體也具有成為藥物載體以及治療靶點(diǎn)的潛能。Lou等[19]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以明顯提高HCC細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性。因此，研究HCC外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，有助于闡明HCC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)HCC的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。

外泌體的提取分離方法有多種，包括超速離心法、超濾法、尺寸排斥色譜法和基于微孔板的磁免疫捕獲法，其中超速離心法被認(rèn)為是外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)[20]。本研究通過(guò)超速離心法提取外泌體，并經(jīng)由TEM、動(dòng)態(tài)光散射分析儀和蛋白免疫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了外泌體的鑒定。通過(guò)上述方法提取的外泌體呈現(xiàn)典型“茶托樣”杯形或類圓形囊泡結(jié)構(gòu)；其粒徑分布于30～200 nm，符合外泌體的粒徑分布標(biāo)準(zhǔn)；免疫印跡結(jié)果顯示外泌體標(biāo)志蛋白CD63和TSG101表達(dá)陽(yáng)性，進(jìn)一步證明了該提取方法科學(xué)有效。

在研究外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響中，筆者采用PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的方法[21]構(gòu)建巨噬細(xì)胞模型(M0)，巨噬細(xì)胞模型標(biāo)志物的qRT-PCR分析表明模型誘導(dǎo)成功，將提取的外泌體刺激M0型巨噬細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)與L02細(xì)胞外泌體對(duì)照組(L02-Exo)相比，HCC來(lái)源的外泌體誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)識(shí)蛋白CD163和Arg-1表達(dá)顯著提高，綜合上述證據(jù)可以明確HCC外泌體能有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化。以往的研究大多集中于癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體與M2型巨噬細(xì)胞之間的串?dāng)_，但腫瘤細(xì)胞如何激活巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化的機(jī)制在HCC中仍不清楚。而在本研究中，發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化，可能是HCC發(fā)生發(fā)展的一種新機(jī)制。這不僅加深了對(duì)HCC外泌體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的認(rèn)識(shí)，也揭示了HCC細(xì)胞與天然免疫之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。但是受限于本研究中采用的體外研究方法，仍需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一作用，以及HCC外泌體中的哪些基因參與巨噬細(xì)胞調(diào)控，還有待進(jìn)一步研究。加強(qiáng)對(duì)HCC外泌體的基本特征及其對(duì)巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的了解，有助于今后更好地闡明HCC的發(fā)病機(jī)制，為其臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：姚濤、徐值紅參與課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；姚紀(jì)友、夏雨參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉冰、蘭天、陸敏強(qiáng)負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)資料分析，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。