畢亭亭，侯思慧，劉 巖

東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院 a.消化內(nèi)科，b.普外科，江蘇 徐州 221009

胰腺癌是一種來(lái)源于胰腺腺管上皮細(xì)胞，惡性水平非常高的消化道腫瘤。近年來(lái)，胰腺癌患病人數(shù)逐漸增多，在美國(guó)惡性腫瘤致死人數(shù)排名中高居第4位[1],在我國(guó)居第6位[2]。據(jù)報(bào)道[3-4]，2020年美國(guó)預(yù)計(jì)有57 600例新發(fā)胰腺癌病例，且因胰腺癌死亡的人數(shù)達(dá)到4705例。預(yù)計(jì)至2030年，胰腺癌將超過(guò)乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌，升至惡性腫瘤致死率排名第2位，僅低于肺癌。目前，手術(shù)切除仍然是胰腺癌治療的主要手段，但根治術(shù)后5年存活率僅15%～25%[5]，且復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率很高。由于耐藥高發(fā)，亦導(dǎo)致化療效果大打折扣[6]。因此，探索胰腺癌發(fā)生進(jìn)展機(jī)制，尋找敏感治療靶點(diǎn)尤為重要。神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白4-1(neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4-1，NEDD4-1)在真核生物的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)泛素化的活化水平而發(fā)揮多種生物學(xué)功效。研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，NEDD4-1在60%的乳腺癌組織中呈高表達(dá)，在80%的非小細(xì)胞肺癌患者中呈高表達(dá)，在晚期胃癌患者中顯著上調(diào)且與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等緊密相關(guān)。但NEDD4-1在胰腺癌中的表達(dá)水平及臨床意義尚未明確，本研究旨在分析NEDD4-1在胰腺癌組織中的表達(dá)及與多種臨床病理特點(diǎn)和疾病預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月—2019年12月于徐州市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的58例胰腺癌患者及其中42例對(duì)應(yīng)的胰腺癌旁組織，病理學(xué)檢查均確診為胰腺導(dǎo)管腺癌。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療或新型輔助治療。其中，男31例，女27例；≤60歲20例，>60歲38例；高中分化腺癌26例，低分化腺癌32例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移31例；遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移21例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移37例；參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第八版胰腺癌TNM分期指南[10]，TNMⅠ/Ⅱ期31例，Ⅲ/Ⅳ期27例。

1.2 免疫組化及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 胰腺癌組織標(biāo)本脫蠟水化，使用DAB顯色及蘇木紫染色方案進(jìn)行：1∶300抗NEDD4-1抗體一抗孵育過(guò)夜，1∶5000二抗反應(yīng)30 min，最后使用顯微鏡進(jìn)行觀察評(píng)判。染色結(jié)果判定：NEDD4-1蛋白陽(yáng)性染色主要集中在細(xì)胞質(zhì)中。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色計(jì)0分；微弱染色(表現(xiàn)為淡黃色)計(jì)1分；中等染色(表現(xiàn)為棕黃色)計(jì)2分；強(qiáng)染色(表現(xiàn)為棕褐色)計(jì)3分。陽(yáng)性染色比例評(píng)分：陽(yáng)性染色細(xì)胞占比0～5%計(jì)0分；6%～30%計(jì)1分；31%～50%計(jì)2分；51%～70%計(jì)3分；≥71%計(jì)4分。染色結(jié)果判定總分=染色強(qiáng)度分值×陽(yáng)性染色比例分值?？偡譃?分者計(jì)為陰性表達(dá)；1～2分者計(jì)為弱陽(yáng)性表達(dá)；3～6分者計(jì)為中陽(yáng)性表達(dá)；>6分者計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 收集處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常胰腺導(dǎo)管上皮HPDE6-C7細(xì)胞及胰腺癌SW1990、BxPC-3、PANC-1細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中的蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，10% SDS分離膠電泳分離總蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉處理后分別孵育NEDD4-1及GAPDH一抗，使用二抗孵育后進(jìn)行顯色。最終取得的條帶采用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 NEDD4-1在胰腺癌組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 在58例胰腺癌組織中，28例呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，12例呈中陽(yáng)性表達(dá)，6例呈弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)79.31%；在對(duì)應(yīng)的42例胰腺癌旁組織中，7例呈弱陽(yáng)性表達(dá)，1例呈中陽(yáng)性表達(dá)，34例呈陰性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率僅為19.05%。與胰腺癌旁組織相比，胰腺癌組織中NEDD4-1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高(χ2=35.614，P=0.001)(圖1)。Western Blot結(jié)果顯示，NEDD4-1在胰腺癌細(xì)胞株SW1990 (1.18±0.14)、BxPC-3(1.40±0.21)及PANC-1(1.29±0.15)內(nèi)的蛋白相對(duì)表達(dá)水平相較于正常胰腺導(dǎo)管上皮HPDE6-C7(0.61±0.09)細(xì)胞明顯上升(t值分別為0.004、0.004、0.003，P值均<0.01)(圖2)。

注：a，陰性表達(dá)；b，弱陽(yáng)性表達(dá)；c，中陽(yáng)性表達(dá)，d，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

2.2 NEDD4-1表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 胰腺癌組織中NEDD4-1表達(dá)水平與胰腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期相關(guān)(P值均<0.05)(表1)。

表1 胰腺癌組織內(nèi)NEDD4-1表達(dá)水平患者的臨床病理特征比較

2.3 NEDD4-1表達(dá)和胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性 本研究末次隨訪時(shí)間為2020年6月，若患者死亡則隨訪結(jié)束。Kaplan-Meier曲線顯示，胰腺癌患者總體生存時(shí)間為(15.45±1.00)個(gè)月，中位生存時(shí)間為(15.00±0.91)個(gè)月。NEDD4-1陽(yáng)性表達(dá)患者平均存活(13.61±0.95)個(gè)月，中位生存時(shí)間為(13.00±0.92)個(gè)月；NEDD4-1陰性表達(dá)患者平均存活時(shí)間可達(dá)到(22.22±2.20)個(gè)月，中位生存時(shí)間為(19.00±5.20)個(gè)月。與NEDD4-1陰性表達(dá)患者相比，NEDD4-1陽(yáng)性表達(dá)患者平均存活時(shí)間明顯短縮(χ2=10.348，P=0.001)(圖3)。

圖3 不同NEDD4-1表達(dá)組胰腺癌患者Kaplan-Meier曲線

2.4 影響胰腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 單因素Cox分析結(jié)果顯示，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、NEDD4-1表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度與胰腺癌的預(yù)后相關(guān)(P值均<0.05)。多因素Cox分析結(jié)果顯示，NEDD4-1表達(dá)、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P值均<0.05)(表2)。

表2 影響胰腺癌患者預(yù)后的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

3 討論

目前，胰腺癌全球患病率逐年遞增[11]。我國(guó)胰腺癌患病人數(shù)、死亡率也呈上升趨勢(shì)[12]，且這種趨勢(shì)將隨著多種因素繼續(xù)上升[13]。胰腺癌的早期臨床診斷較難，雖然越來(lái)越多的科研人員針對(duì)胰腺癌的病理學(xué)、診斷學(xué)開(kāi)展積極研究探索，但目前臨床上仍缺乏靈敏度、特異度高的診斷標(biāo)志物，被廣泛認(rèn)可的診斷指標(biāo)仍只有CA19-9[14]。因此，亟需探明胰腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)特異性分子標(biāo)志物，以指導(dǎo)靶向藥物的開(kāi)發(fā)，提升臨床治療水平。

泛素連接酶E3作為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄、降解細(xì)胞中錯(cuò)誤表達(dá)的蛋白并穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)的膜蛋白等重要生物學(xué)功能，同時(shí)還具有抑制惡性腫瘤病程進(jìn)展的特異性作用[15]。NEDD4家族是目前研究最多、最清楚的一類E3連接酶，且NEDD4-1作為NEDD4家族中重要的成員之一，同樣也具備上述一系列功能。既往NEDD4-1相關(guān)研究多關(guān)注于細(xì)胞膜鈉離子通道狀態(tài)的調(diào)控和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育等方面，如調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、T淋巴細(xì)胞的功能、神經(jīng)肌肉接頭處的成熟發(fā)育、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育及軸突傳導(dǎo)等[16]。近段時(shí)間以來(lái)，NEDD4-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用受到越來(lái)越多的學(xué)界關(guān)注[17]。NEDD4-1作為一種原癌基因，被發(fā)現(xiàn)在人類多種惡性腫瘤(如結(jié)腸癌、肺癌)的組織中呈異常的表達(dá)上調(diào)，還可作為前列腺癌、乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，有望成為一種新的腫瘤治療靶點(diǎn)[18]。Weng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NEDD4在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯上調(diào)且與細(xì)胞的侵襲遷移能力密切相關(guān)。然而，目前尚未見(jiàn)有NEDD4-1在人胰腺癌組織中的表達(dá)及其與病程發(fā)生發(fā)展關(guān)系的報(bào)道。本研究證實(shí)了胰腺癌組織中NEDD4-1的表達(dá)水平較癌旁組織明顯升高，且胰腺癌細(xì)胞株中NEDD4-1的表達(dá)相較于正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞明顯上調(diào)；組織內(nèi)NEDD4-1表達(dá)改變與胰腺癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及腫瘤TNM 分期緊密相關(guān)；NEDD4-1表達(dá)升高可影響胰腺癌患者的存活率，且與胰腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān)，其或可作為胰腺癌預(yù)后的一個(gè)預(yù)測(cè)因子。

本研究的不足之處在于納入樣本量有限，且病理類型較為單一，希望后續(xù)開(kāi)展多中心、更大樣本量的研究證實(shí)相關(guān)結(jié)論。

綜上所述，NEDD4-1在胰腺癌中高表達(dá)，且可能成為評(píng)判胰腺癌預(yù)后的潛在標(biāo)志物，進(jìn)一步探究NEDD4-1可能為揭示胰腺癌病程進(jìn)展及預(yù)后所涉及的相關(guān)分子機(jī)制提供一定的推進(jìn)作用，也將為胰腺癌的診治提供一個(gè)新的思路。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2020年2月20日經(jīng)由徐州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，批號(hào)：2020倫審026號(hào)。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：畢亭亭、劉巖負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)研究思路，論文撰寫(xiě)；畢亭亭、侯思慧負(fù)責(zé)收集臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析；劉巖負(fù)責(zé)論文最終定稿。