梁 猛

鼻咽癌是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的腫瘤，具有明顯的區(qū)域分布特征，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多途徑、多遺傳變異、多機(jī)制積累的復(fù)雜過程，涉及一系列癌基因、抑癌基因及信號(hào)通路相關(guān)因子改變，尋找影響鼻咽癌發(fā)生相關(guān)基因，并研究其作用機(jī)制，對(duì)于鼻咽癌診療具有重要意義[1-2]。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是一個(gè)重要的凋亡抑制蛋白，具有明顯凋亡抑制作用，有研究[3-4]表明，抑制XIAP表達(dá)可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。鼻咽癌中XIAP表達(dá)升高，但其對(duì)癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響研究尚未明確[5]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種細(xì)胞因子，參與細(xì)胞凋亡、免疫應(yīng)答等多種途徑的調(diào)控[6]。已有研究[7-8]表明，TNF-α可誘導(dǎo)包括鼻咽癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞凋亡。因此，本研究通過RNAi技術(shù)抑制鼻咽癌細(xì)胞XIAP表達(dá)，并用TNF-α處理細(xì)胞，旨在研究抑制XIAP表達(dá)是否可促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡及降低免疫抑制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人鼻咽癌5-8F細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco；人重組TNF-α購(gòu)自美國(guó)R&D；MTT試劑盒和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Sigma；流式凋亡檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD；XIAP、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、Cleaved caspase3、Bax、NF-κB p65和 Ikkβ 抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo。siRNA序列由上海生工設(shè)計(jì)合成。XIAP siRNA sense：5′-GGA GAU ACC GUG CGG UGC UdT dT-3′，anti-sense：5′-AGC ACC GCA CGG UAU CUC CdT dT-3′；陰性對(duì)照組siRNA sense：5′-ACA ACT GCC TGG TTG GCA A-3′，anti-sense：5′-TTG CCA ACC AGG CAG TTG T-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 5-8F細(xì)胞用含10% FBS的改良型RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 分組及siRNA轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為空白組(細(xì)胞不經(jīng)特殊處理)、TNF-α組(10 ng/mL的外源性TNF-α處理5-8F細(xì)胞12 h)、si-XIAP組(si-XIAP轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞48 h)和TNF-α+si-XIAP組(si-XIAP轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞48 h后，使用10 ng/mL的外源性TNF-α處理細(xì)胞12 h)。陰性對(duì)照siRNA(NC)及XIAP特異性siRNA(si-XIAP)轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書。轉(zhuǎn)染前1 d以3×105/孔接種5-8F細(xì)胞于6孔板，使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞達(dá)60%～70%融合，將制備的Lipo2000-siRNA復(fù)合物加入6孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育6 h，更換含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞XIAP表達(dá)。

1.4 Western blotting 適量RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，總蛋白加上樣緩沖液100 ℃煮5 min變性，每孔道上樣40 μg，經(jīng)10%～12%的SDS-PAGE分離，電泳后276 mA轉(zhuǎn)膜2.5 h，取出膜，加5%脫脂奶粉，室溫條件封閉1 h，TBST洗膜，加一抗(稀釋比例均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白與GAPDH灰度值比值為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 以5×103/孔接種5-8F細(xì)胞于96孔板，37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)孵育過夜，按照1.3實(shí)驗(yàn)分組用TNF-α和si-XIAP單獨(dú)或聯(lián)合處理5-8F細(xì)胞，處理后的每孔細(xì)胞加MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸去培養(yǎng)上清，每孔加DMSO 200 μL，搖床低速震蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm的吸光度值(A490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 以5×105/孔接種5-8F細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育過夜，按照1.3實(shí)驗(yàn)分組用TNF-α和si-XIAP單獨(dú)或聯(lián)合處理5-8F細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌處理后，胰酶消化細(xì)胞，離心，收集細(xì)胞，加1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，之后加5 μL Annexin V-FITC，混勻后再加5 μL PI，混勻，室溫避光孵育5～15 min，1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 抑制XIAP表達(dá)可增加TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞活力抑制 XIAP siRNA轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞48 h，Western blotting檢測(cè)XIAP蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，si-XIAP組XIAP 相對(duì)表達(dá)量為0.097±0.010，明顯低于空白組的0.602±0.057(t=15.11，P<0.01)(見圖1)。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，TNF-α組和si-XIAP組細(xì)胞活力均低于空白組(P<0.05)，TNF-α+si-XIAP組細(xì)胞活力低于TNF-α組和si-XIAP組(P<0.05)(見表1)。

表1 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞活力抑制的影響

2.2 抑制XIAP表達(dá)可促進(jìn)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞凋亡 TNF-α組和si-XIAP組5-8F細(xì)胞凋亡率均高于空白組(P<0.05)，TNF-α+si-XIAP組細(xì)胞凋亡率高于TNF-α組和si-XIAP組(P<0.05)(見圖2、表2)。

表2 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞凋亡的影響

2.3 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 TNF-α組和si-XIAP組Cleaved caspase3和Bax表達(dá)均高于空白組(P<0.05)，TNF-α+si-XIAP組Cleaved caspase3和Bax表達(dá)均高于TNF-α組和si-XIAP組(P<0.05)(見圖3、表3)。

表3 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞Cleaved caspase3和Bax表達(dá)的影響

2.4 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞VEGF和COX-2表達(dá)的影 TNF-α組VEGF和COX-2表達(dá)均高于空白組(P<0.05)，si-XIAP組VEGF和COX-2表達(dá)均低于空白組(P<0.05)；TNF-α+si-XIAP組VEGF和COX-2表達(dá)均低于TNF-α組，高于si-XIAP組(P<0.05)(見圖4、表4)。

表4 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞VEGF和COX-2表達(dá)表達(dá)的影響

2.5 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響 TNF-α組NF-κB p65和 Ikkβ 表達(dá)均高于空白組(P<0.05)，si-XIAP組NF-κB p65和 Ikkβ 表達(dá)均低于空白組(P<0.05)；TNF-α+si-XIAP組NF-κB p65和 Ikkβ 表達(dá)均低于TNF-α組，高于si-XIAP組(P<0.05)(見圖5、表5)。

表5 抑制XIAP表達(dá)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的5-8F細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

3 討論

研究[9]證實(shí)，腫瘤發(fā)生發(fā)展及演進(jìn)過程伴有抑癌基因失活、原癌基因激活及參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的信號(hào)途徑失調(diào)等?；蛑委熣轻槍?duì)這些特點(diǎn)，將正?；蚧蛴兄委焹r(jià)值的其他基因引入腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。因此，尋找影響鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的基因，并研究其機(jī)制具有重要意義。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是一類內(nèi)在的凋亡抑制因子，可通過阻斷細(xì)胞凋亡所必需依賴的caspases蛋白活性，從而起到細(xì)胞凋亡抑制作用，在多種腫瘤中IAPs呈現(xiàn)過表達(dá)[10-11]。XIAP是IAPs家族成員之一，已有研究證實(shí)XIAP是唯一一個(gè)與caspase3、caspase9和caspase7直接結(jié)合的凋亡抑制蛋白[12]。且多項(xiàng)研究表明XIAP與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如microRNA-137可通過調(diào)控XIAP促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡[13]，XIAP可通過調(diào)控Bcl-2家族損傷腎癌凋亡過程中線粒體功能[14]。XIAP在鼻咽癌中高表達(dá)，提高XIAP表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞凋亡[7]。TNF-α是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡、分化、炎癥等多種重要功能的調(diào)控，已被公認(rèn)為重要的前凋亡因子，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。有研究[16]證實(shí)，一些基因可促進(jìn)或抑制TNF-α誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，如沉默RIPK4基因表達(dá)可增加TNF-α誘導(dǎo)的骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡敏感性。若XIAP基因可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞凋亡，這將給鼻咽癌治療提供很大幫助。本研究通過RNAi技術(shù)抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞XIAP表達(dá)，并用TNF-α處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)XIAP表達(dá)抑制可增加TNF-α對(duì)5-8F細(xì)胞活力抑制及凋亡促進(jìn)作用。提示XIAP同樣可增強(qiáng)TNF-α對(duì)鼻咽癌凋亡誘導(dǎo)作用，可能是一個(gè)有效的鼻咽癌治療靶點(diǎn)。

NF-κB有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，活化的NF-κB因子在癌癥發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[17]。有實(shí)驗(yàn)[18-20]證明，在鼻咽癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤等多種實(shí)體腫瘤中都可檢測(cè)到NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)高度活化狀態(tài)。有研究顯示，抑制NF-κB信號(hào)通路可通過對(duì)凋亡及免疫相關(guān)因子調(diào)控，從而影響腫瘤細(xì)胞凋亡及免疫，如阻斷皮膚鱗癌細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路，可下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)及提高caspase活性[21]；TNF-α在HepG2細(xì)胞中能上調(diào)凋亡抑制因子VEGF表達(dá)，而黃連素能下調(diào)由其誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)，可能是通過NF-κB信號(hào)通路所介導(dǎo)[22]；黃芩素可抑制TNF-α誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞NF-κB信號(hào)及其下游靶基因免疫抑制因子COX-2表達(dá)[23]。腫瘤細(xì)胞對(duì)TNF-α的反應(yīng)主要由NF-κB來(lái)介導(dǎo)，TNF-α可激活NF-κB信號(hào)通路，而活化的NF-κB信號(hào)可拮抗TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[24]。有研究[25]顯示，抑制XIAP可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡及下調(diào)NF-κB信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，抑制XIAP表達(dá)可上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞Bax、Cleaved caspase3表達(dá)，下調(diào)VEGF、COX-2、NF-κB p65和IκBα表達(dá)。提示抑制XIAP表達(dá)可通過下調(diào)NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡及降低免疫抑制。

綜上所述，下調(diào)XIAP基因表達(dá)可增強(qiáng)TNF-α誘導(dǎo)的鼻咽癌5-8F細(xì)胞凋亡及降低VEGF和COX-2表達(dá)，機(jī)制與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。該研究提示XIAP可能是鼻咽癌診療的有效靶點(diǎn)之一。