陳秀清，汪文華，何恩銘

（1.揚州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化工學(xué)院，江蘇 揚州 225127；2.福建省亞熱帶植物研究所／福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門 361006）

黃芩作為中藥，主要利用唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）的干燥根。在春季或秋季采挖，除去須根和泥沙，曬后撞去粗皮，曬干。黃芩味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、除熱安胎功能[1]。黃芩中含有多種生理活性成分，主要有黃酮類化合物、甾醇、氨基酸、生物堿和微量元素等[2]。其中最主要的4 種成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和漢黃芩苷[3]。近年來，隨著對其活性成分黃芩苷及黃芩素研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)這些化合物具有抗癌、護肝、抗病毒等多種藥理作用[4-6]，黃芩及其兩種活性成分黃芩苷和黃芩素還可以預(yù)防新陳代謝綜合癥[7]，因此，開發(fā)和利用黃芩及其活性成分作為藥物的研究不斷增加[8]。且國家也不斷出臺相關(guān)文件促進中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展。傳承精華、守正創(chuàng)新，利用生物技術(shù)保護黃芩野生資源，提高黃芩生產(chǎn)效率，能夠滿足市場需求及實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，具有廣闊前景。

1 黃芩組織培養(yǎng)

組織培養(yǎng)技術(shù)在人工種子制備、植株快速繁殖、無毒幼苗培養(yǎng)及次級代謝產(chǎn)物富集等方面取得了較好的成效，黃芩組織培養(yǎng)研究也不斷深入。

1.1 黃芩人工種子

目前黃芩已經(jīng)成為常用中藥，為大宗中藥材，其需求量不斷增大，野生的黃芩資源根本不能滿足市場需求，必須依靠人工種植。因此，對黃芩規(guī)范化種植、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種植、機械化、無害化栽培生產(chǎn)研究不斷深入[9,10]。葛人杰等主要依據(jù)黃芩種子發(fā)芽率和種子活力，參考種子千粒質(zhì)量、形態(tài)大小、含水量、飽滿度等，制定了的黃芩種子質(zhì)量三級分類標(biāo)準[11]，為黃芩種子的質(zhì)量評價和黃芩人工栽培提供參考和指導(dǎo)。俄羅斯專利（RU2415928C1）中將黃芩的根中部切成厚度為2～3 mm 橫切片，這些切片段被包封封裝在一個含海藻酸鹽無激素的涂層，涂層為加入claforan 抗生素的Gamborg 營養(yǎng)成分，claforan 的濃度為300～550 mg/L，制成人工種子，見圖1。采用該方法培養(yǎng)，一年半內(nèi)無細菌感染跡象，與儲存的黃芩根相比，具有較高的生長活性和原黃酮濃度[11]。

圖1 黃芩人工種子Fig.1 Artificial seeds of Scutellaria baicalensis

1.2 黃芩快速繁殖

李博鳳等嘗試黃芩幼莖、幼葉和葉柄3種外植體，以幼莖（莖段）為佳，在MS＋0.5 mg/LBA＋0.5 mg/L NAA 培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)和再生芽分化培養(yǎng)。然后再在1/2MS+0.1 mg/L IBA 進行生根培養(yǎng)，黃芩根及須根生長均較多，且顏色與形態(tài)都正常，同時生根率達到70.3%，待再生苗的根長度長到2 cm 左右時，即可進行煉苗處理，再生苗見圖2，可為黃芩種苗培養(yǎng)和育種提供參考[13]。

圖2 黃芩再生苗Fig.2 Regenerated seedlings of Scutellaria baicalensis

吳思婧等采用組織培養(yǎng)法和枝條扦插法對縉云黃芩進行誘導(dǎo)和繁殖[14]。組織培養(yǎng)通過對縉云黃芩莖段外植體進行化學(xué)消毒,在MS＋2.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LIAA 培養(yǎng)基上進行黃芩不定芽誘導(dǎo)。50 mg/LIAA 能較好地刺激不定芽生根，其生根率能達到75.0%。這樣通過組織培養(yǎng)和扦插可以實現(xiàn)快速繁殖，圖3為縉云黃芩插穗生根情況，再將縉云黃芩扦插苗移栽到原來的發(fā)現(xiàn)地，觀察30～90 d，存活率達到100%，為縉云黃芩資源保護奠定了基礎(chǔ)。

圖3 插穗生根情況Fig.3 Rooting of cuttings

張靜等以狹葉黃芩的莖段為外植體，用0.1%的HgCl2消毒5min，誘導(dǎo)腋芽培養(yǎng)基為MS+1mg/L 6-BA+1mg/L NAA，誘導(dǎo)率可達73.66%，誘導(dǎo)愈傷最佳培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+1mg/L 2,4-D，誘導(dǎo)率為91.33%；愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+1mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，分化率為44.71%。芽增殖的最佳培養(yǎng)基同愈傷組織分化培養(yǎng)基，其芽增殖倍數(shù)為5.85；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/LIBA，生根率可達到74.07%；試管苗移栽到3號基質(zhì)時，存活率達到79.24%，同時3號基質(zhì)配方中園土占60%，遠高于20%蛭石或珍珠巖，成本較低，植株健壯生長旺盛，見圖4。建立的狹葉黃芩再生體系，可為狹葉黃芩野生資源在妥善保護的基礎(chǔ)上進行開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論支持[15]。

圖4 組培苗移栽Fig.4 Transplanting of tissue culture seedlings

2 黃芩細胞培養(yǎng)

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

通過培養(yǎng)愈傷組織獲得植物次級代謝產(chǎn)物，具有不受自然條件影響、培養(yǎng)時間短、次級代謝產(chǎn)物含量高、效率高等優(yōu)點。侯云亮選取繼代培養(yǎng)長勢良好的黃芩愈傷組織，在不添加聚乙二醇-6000 的MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～35 d，愈傷組織達到穩(wěn)定生長期，根據(jù)生物生長量確定25℃為愈傷組織培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)溫度。通過高效液相色譜法測定愈傷組織中黃芩苷含量，發(fā)現(xiàn)其在25℃下培養(yǎng)，愈傷組織細胞中黃芩苷積累最多，黃芩苷積累溫度和最佳愈傷組織培養(yǎng)溫度一致。水分也影響黃芩細胞次級代謝產(chǎn)物的合成，聚乙二醇是常見的滲透劑，用聚乙二醇模擬土壤控水效果。在培養(yǎng)基中添加高濃度聚乙二醇，愈傷組織細胞合成黃芩苷會受到抑制，濃度越高其抑制作用越明顯。但是愈傷組織培養(yǎng)到第15 d 時，抑制效果會開始減弱，黃芩苷含量增高，具體表現(xiàn)為：對照組＞5%＞10%＞20%＞15%，黃芩苷積累量與含量表現(xiàn)不同為：對照組＞20%＞5%＞10%＞15%。根據(jù)研究表現(xiàn)，確定黃芩愈傷組織培養(yǎng)積累黃芩苷控制溫度控制在25℃，培養(yǎng)基不添加聚乙二醇[16]。

2.2 細胞懸浮培養(yǎng)

利用黃芩細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)可獲得富含黃芩苷活性成分的黃芩細胞。韓淑蘭首先用黃芩種子種植黃芩苗2 個月，得到黃芩的盆栽實生苗。然后將黃芩徑段外植體培養(yǎng)在添加1.5 mg/L6-BA 和0.5 mg/LNAA 的MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出黃芩愈傷組織。最后對黃芩愈傷組織進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)三代后，獲得質(zhì)地疏松的黃芩愈傷組織細胞。研究表明黃芩主要次級代謝產(chǎn)物黃芩苷在懸浮培養(yǎng)20 d 時獲得了最高的產(chǎn)量，達到78.31 mg/g。在培養(yǎng)基中添加一定量的誘導(dǎo)子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高含量的黃芩次級代謝產(chǎn)物黃芩苷，研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加150 umol/L 茉莉酸甲酯，懸浮培養(yǎng)達72 h，不但能促進黃芩細胞的生長，而且能夠誘導(dǎo)黃芩懸浮培養(yǎng)細胞產(chǎn)生更高含量的黃芩苷。黃芩細胞的生長率與對照組相比，提高了67%，黃芩苷含量達184.62 mg/L[17]。

3 黃芩毛狀根培養(yǎng)

通過發(fā)根農(nóng)桿菌等誘導(dǎo)黃芩外植體產(chǎn)生黃芩毛狀根，毛狀根能夠在不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基上快速生長，并產(chǎn)生黃芩次級代謝產(chǎn)物。張東向等通過單因素試驗確定黃芩狀根培養(yǎng)最適的培養(yǎng)時間范圍為15～25 d，最適的培養(yǎng)溫度范圍為26℃～28℃，最適宜的轉(zhuǎn)速為110～130 r/min，最適的宜接種量為0.3～0.5 g，然后用響應(yīng)面法對黃芩毛狀根培養(yǎng)時間、溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量相互影響進行分析并進行驗證試驗，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)時間25d、溫度27.4℃、搖床轉(zhuǎn)速123 r/min、接種量0.5 g 條件下，黃芩毛狀根鮮質(zhì)量在（9.2±0.2）g，為黃芩毛狀根的進一步培養(yǎng)富集黃芩苷提供一定的依據(jù)[18]。王淑芳等培養(yǎng)粘毛黃芩毛狀根，獲取黃酮類化合物。培養(yǎng)條件為：30 g/L 蔗糖、pH5.8 的1/2MS 培養(yǎng)基最適合毛狀根生長，但總黃酮合成最高則在pH6.4，外源植物生長調(diào)節(jié)劑赤霉素可促進粘毛黃芩毛狀根生長及黃酮類化合物生物合成，毛狀根干質(zhì)量達到（1.188 9±0.112 8）g/搖瓶，總黃酮含量為（37.048 6±1.776 1）mg/搖瓶[19]。

施春陽設(shè)計改制了10 L鼓泡式培養(yǎng)器，通氣量在20～40 L/h，溶氧可維持在20%～50%，在改良的MS培養(yǎng)基上進行三級發(fā)酵培養(yǎng)，在黃芩毛狀根發(fā)酵的第20 d 時，對其進行補料，補料添加1/5的生產(chǎn)培養(yǎng)基（Ⅱ），分階段控制通氣量，再發(fā)酵培養(yǎng)30 d，黃芩毛狀根的生物量達到10.21 g/L，毛狀根中黃芩苷含量達到12.3%。然后利用LX-22大孔吸附樹脂提取黃芩毛狀根中黃芩苷，其動態(tài)吸附量達113 mg/g，黃芩苷回收率超過82%。動態(tài)吸附分離得到的黃芩苷含量為85.6%，再將其經(jīng)硅膠G色譜柱層析純化，黃芩苷的純度能夠達到98%[20]。

郭雙雙利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)黃芩產(chǎn)生毛狀根，研究不同條件下黃芩毛狀根中黃芩苷，發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)溫度的升高，黃芩苷含量逐漸增加，在黑暗條件下有利于黃芩毛狀根中黃芩素的積累，光照條件下有利于黃芩毛狀根中黃芩苷的積累。除了不斷優(yōu)化黃芩毛狀根培養(yǎng)條件，提高毛狀根中次級代謝產(chǎn)物含量的同時，采用基因工程手段，先提取黃芩毛狀根中的RNA，再利用RT-PCR 技術(shù)克隆葡萄糖醛酸水解酶基因，克隆的葡萄糖醛酸水解酶基因在毛狀根中表達出葡萄糖醛酸水解酶，其將黃芩苷水解成黃芩素，降低了次級代謝產(chǎn)物黃芩苷對毛狀根生長的抑制作用，毛狀根中黃芩苷含量與葡萄糖醛酸水解酶的酶活性和基因表達量呈反比例關(guān)系[21]。

Solov'Eva 等研究了黃芩內(nèi)源性β-葡萄糖醛酸酶活性與體外培養(yǎng)分化的關(guān)系。通過研究比較在固體和液體培養(yǎng)基上生長的分化和未分化體外培養(yǎng)物中黃芩主要黃酮的含量與內(nèi)源性b-葡萄糖醛酸酶（sGUS）活性之間的關(guān)系，結(jié)果表明sGUS 活性與培養(yǎng)物生物量的增加無關(guān)，但取決于組織分化。在液體和固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的毛狀根比未分化培養(yǎng)的毛狀根高10倍。在培養(yǎng)周期中，苷元形式在總黃酮含量中所占的份額取決于生長條件，在瓊脂培養(yǎng)基上顯著高于液體培養(yǎng)基，sGUS 活性與總苷元含量以及黃芩素含量之間的相關(guān)性僅在液體中生長的毛狀根中觀察到[22]。

4 黃芩內(nèi)生真菌培養(yǎng)

內(nèi)生真菌是一種真菌，其能生活在正常植物組織內(nèi)部，但不會引起植物病害，與植物一同生長代謝，同時可產(chǎn)生與共生植物組織相同的次級代謝產(chǎn)物。這樣通過單獨培養(yǎng)內(nèi)生真菌，能夠從培養(yǎng)液中分離純化出植物活性成分。李青連等用含氯霉素的PDA 培養(yǎng)基（0.4～0.5）g/L 從野生黃芩的根、莖、葉分離純化出黃芩內(nèi)生真菌，采用冷、熱、光和水處理誘導(dǎo)內(nèi)生真菌產(chǎn)生孢子，對其進行鑒定，黃芩生長成熟階段產(chǎn)生較多種類的內(nèi)生真菌。用枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、深紅酵母等14種微生物作為指示菌，對內(nèi)生真菌進行抗菌活性試驗，發(fā)現(xiàn)95.8%的菌株對一種或多種指示菌具有抑菌作用，即可以從黃芩內(nèi)生真菌中篩選具有抗菌成分的藥物，并對其代謝產(chǎn)物進行進一步研究[23]。

魏希穎等[24]用PDA 固體培養(yǎng)基，并加入青霉素50 mg/L，鏈霉素50 mg/L，從藥用植物黃芩根、莖、葉和花中分離得到17 株內(nèi)生真菌，分離到的內(nèi)生真菌中12 株至少對一種指示菌（蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等）有抑菌活性。將分離得到的內(nèi)生真菌在馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基進行發(fā)酵，對發(fā)酵液和菌絲體分別進行黃苷提取，首先采用薄層色譜法定性分析發(fā)酵液或菌絲體是否含有黃芩苷，經(jīng)初檢發(fā)現(xiàn)菌株J1 和H3 的液體發(fā)酵菌絲提取物中含有黃芩苷或其類似物，該菌絲提取物的Rf值和黃芩苷標(biāo)準品的一樣，發(fā)酵培養(yǎng)黃芩內(nèi)生真菌可以獲得黃芩苷或其類似物。但是采用高效液相色譜法對提取物進行黃芩苷含量定量檢測，內(nèi)生真菌菌絲提取物中黃芩苷或其類似物含量偏低，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成本較高。目前通過內(nèi)生真菌培養(yǎng)富集獲取黃芩苷或其類似物仍然處于研究階段，需要進一步優(yōu)化內(nèi)生真菌培養(yǎng)條件和構(gòu)建基因工程菌，為內(nèi)生真菌工業(yè)化發(fā)酵富集黃芩苷或其類似物奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)語

黃芩生物技術(shù)的利用一方面可以改善黃芩品質(zhì)、提高黃芩栽培效率，另一方面可以直接利用黃芩細胞或內(nèi)生真菌，改善黃芩細胞或內(nèi)生真菌發(fā)酵條件，以期富集高濃度的黃芩苷或其類似物。黃芩細胞培養(yǎng)選擇不同種類的植物激素，并配制不同比例及濃度的植物激素，誘導(dǎo)培養(yǎng)出黃芩愈傷組織，進一步進行黃芩幼苗分化或直接進行細胞懸浮培養(yǎng)。采用轉(zhuǎn)基因方法可以避免使用植物生長調(diào)節(jié)劑，如直接進行黃芩毛狀根培養(yǎng)以期獲得黃芩活性成分。采用內(nèi)生真菌培養(yǎng)獲取活性成分更能縮短培養(yǎng)周期，提高生產(chǎn)效率。在此基礎(chǔ)上利用基因工程手段進行代謝調(diào)控，能夠促進代謝產(chǎn)物的積累。