方圣杰 章軼立 朱嘉 宋慶慧 王旭 劉寧 李秋月* 魏戌*

1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102

2.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結合學院，江蘇 南京 210023

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是骨科常見的疾病之一，骨量低、骨組織微結構退化和骨強度降低是OP的主要特征[1]，OP主要分為原發(fā)性與繼發(fā)性兩類，其中糖皮質激素(glucocorticoid，GC)誘導的OP為最常見的繼發(fā)性OP，有學者[2]對3 136例使用GC治療風濕病患者時導致骨量減少、骨質疏松發(fā)病情況進行多中心調查，研究顯示存在骨量減少或骨質疏松患者高達90%, 其中骨質疏松的發(fā)生率為41.4%。相關機制研究證實，過量的GC會影響成骨細胞的分化和成熟，導致其數量和功能下降，并促進成骨細胞凋亡，從而進一步減少骨形成[3]。為進一步更好的研制出療效顯著、價格低廉的治療GC性骨質疏松癥藥物，建立可靠穩(wěn)定的糖皮質激素性骨質疏松癥模型(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)并闡明GC誘導的OP的病理機制成為當前首要任務[4]。

最近研究表明，GC能抑制骨髓間充質干細胞進行成骨分化，引導其分化成脂肪細胞，同時，減少肥大軟骨細胞中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達，使得成骨細胞和血流量減少[5]。Leptin作為脂肪因子的一種，存在于脂肪細胞中，相關機制研究闡明，Leptin能夠通過激活Akt調控成骨細胞的增殖、促進成骨細胞分化[6]，同時，其在脂肪細胞中分泌后，釋放到血液中進行循環(huán)[7]，能夠引起強烈的血管生成反應，Leptin水平增加能夠促進VEGF表達，與VEGF具有相互依賴性，因此被定義為促血管生成因子[8-10]。另外，骨修復過程是否受到VEGF水平影響？已有學者通過研究確證VEGF分泌能夠促進骨修復，加快骨愈合，對骨缺損修復過程效果顯著，因此VEGF對骨修復及成骨細胞分化有著重要作用，該觀點也在醫(yī)學不同領域均有報道[11-15]，基于此，本文通過GIOP模型探究GC誘導OP過程中Leptin、VEGF蛋白表達情況，闡述GC誘導OP潛在病理機制，為后續(xù)進一步科學研究及臨床治療以GIOP為代表的繼發(fā)性骨質疏松癥提供可靠依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

相關試劑：蛋白提取液(來源：MDL，批號：MDL91201)；蛋白酶抑制劑(來源：MDL，批號：MD912893)；BCA 蛋白濃度測定 kit(來源：MDL，批號：MD913053)；SDS-PAGE 預制膠套裝 kit(來源：MDL，批號MD911919)；中等蛋白分子量 marker(來源：Thermo，批號：26617)；Leptin(來源：Bioss，批號：bs-0409R)；VEGF [來源：VEGF(C-1) sc-7269，批號：BA 0533]；二抗(來源：MDL，批號：MD912577)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)；PBS 緩沖液(來源：艾普希隆生物，批號：G0002)

1.2 主要實驗儀器

微量加樣器(Gilson 公司，法國)；電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設備廠，型號：HWS-24)；脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，型號：TS-100)；電泳儀(北京百晶生物技術有限公司，型號：T BG-subMIDI)；低溫離心機(Sigma，德國，型號：3-30K)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國，型號：GelDoc-It310)；ChemiDoc MP 化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國，型號：170-8280)；病理切片機 (上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)。

1.3 實驗動物

SPF級SD雌性大鼠，購自北京維通利華實驗動物中心技術有限公司，每只體重220 g左右，7周齡，共32只，飼養(yǎng)于SPF級實驗室，濕度48%左右，溫度25 ℃左右，自由進食、進水，定時更換墊料。

1.4 分組與造模、取材

將大鼠隨機分為SHAM、DEX 2.5 mg/kg組、DEX 5 mg/kg組、DEX 7.5 mg/kg組，每組各8只。將大鼠適應性喂養(yǎng)1周后開始造模，我們將地塞米松注射液(dexamethasone，DEX)分為2.5、5.0、7.5 mg/kg三種劑量，分別對相應組別大鼠選取左、右大腿內側肌肉交替進行肌肉注射，連續(xù)注射8周。在造模8周末，采用戊巴比妥依據大鼠體重進行腹腔注射麻醉處死，取大鼠右側脛骨和右側股骨。

1.5 檢測指標

1.5.1骨密度檢測：選用雙能X線骨密度測量儀進行骨密度檢測，采用Osteocore3骨密度分析軟件進行骨密度值的分析，選取右側脛骨樣本的脛骨骨干部進行骨密度值的采集。

1.5.2病理組織學檢測：取右側脛骨在4%甲醛中固定12 h，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，進行HE常規(guī)染色，在顯微鏡下觀察、拍照記錄。

1.5.3免疫組織化學檢測：選用右側脛骨，進行免疫組化檢測。具體步驟：先將組織切片置于盛滿 EDTA 抗原修復緩沖液(PH9.0)中進行抗原修復，使用PBS洗滌3次，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，過夜，然后將玻片置于 PBS(pH 7.4)中洗滌 3 次后加二抗覆蓋組織，DAPI 復染細胞核，最后封片，鏡檢，記錄。

1.5.4蛋白免疫印跡：將股骨組織浸入液氮勻漿、離心、裂解、提取蛋白，進行蛋白濃度測定，根據蛋白定量結果，在電壓80 V下使樣品通過濃縮膠與分離膠至適當位置后轉印至PVDF膜，將封閉后的膜分別加入對應的一抗工作液中，4 ℃反應過夜，使用1×TBST洗滌3次，洗凈未結合的一抗，在室溫、避光條件下放入二抗工作液中作用60 min，洗去二抗后進行顯色與成像。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 骨密度檢測

DEX 2.5 mg/kg組、DEX 5 mg/kg組、DEX 7.5 mg/kg組右側脛骨骨密度較SHAM組骨密度均降低，DEX 2.5 mg/kg組較其他兩組降低更為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

2.2 病理組織學檢測

病理組織學檢測發(fā)現(xiàn)，SHAM組骨小梁較厚，排列緊密，分布均勻，未有斷裂，與SHAM組相比DEX 2.5 mg/kg組、DEX 7.5 mg/kg組骨小梁變薄，排列較為稀疏，分布不均勻且有骨小梁斷裂，DEX 2.5 mg/kg組變化較其他組最為顯著。結合骨密度和病理組織學檢測結果，我們認為DEX 2.5 mg/kg為地塞米松注射液誘導繼發(fā)性骨質疏松的最佳造模劑量，后續(xù)實驗將以這個劑量為造模最佳劑量進行研究。見圖2。

2.3 免疫組織化學檢測

采用免疫組織化學對SHAM組、DEX 2.5 mg/kg組的Leptin、VEGF蛋白表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，與SHAM組相比，DEX 2.5 mg/kg組大鼠Leptin、VEGF蛋白的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 蛋白免疫印跡

蛋白免疫印跡結果顯示，與SHAM組相比，DEX 2.5 mg/kg組大鼠Leptin、VEGF蛋白的表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

GC的攝入是OP常見的繼發(fā)原因，也是該病常見的醫(yī)源性原因，其具體機制尚不清楚，有研究[16-17]表明，GC主要是通過抑制成骨細胞活性，延長破骨細胞壽命，減少骨形成，最終誘導OP的形成。在祖國醫(yī)學中并沒有GIOP病名，GIOP屬于祖國醫(yī)學中“骨痿”“骨痹”等范疇，《素問·痿論》提出“腎主身之骨髓…腎者，水臟，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不住身，發(fā)為骨痿”。《素問·逆調論》認為“腎不生則髓不能滿?！蹦I精不足致使骨髓生化乏源，形成骨痹。說明了腎虛可為骨痿、骨痹的發(fā)病原因，《黃帝內經》記載，腎為先天之本，在體為骨，主骨生髓；肝為魂之處，血之藏，筋之宗，若肝血不足，隨之腎精虛損最終肝腎俱虛；脾為氣血生化之源，后天之本，開竅于口，在體合肉，主四肢肌肉，若脾胃虛弱，氣血化生乏源，則精血不足，無以養(yǎng)髓，繼而肢體疼痛、痿弱，而最終導致OP，同時，現(xiàn)有研究顯示，肌肉含量與OP發(fā)病率具有密切關系[18]，遂肝脾腎三臟均與GIOP密切相關[19]。此外，祖國醫(yī)學認為GC為“藥邪”，其性屬陽，為辛溫發(fā)散之物，易傷陰液，陰虧無以生陽，陰損及陽，陰陽失衡。因此藥邪傷腎, 腎精虧虛是GIOP發(fā)生的根本病機[20]。并且長期攝入GC后，OP骨折風險也相應提高，停用糖皮質激素2～6個月后，骨折風險比繼續(xù)使用者低29%[21]。

Leptin是一種能作用于局部和全身的、具有多種功能的激素，不僅能控制飽腹感，與骨量和礦物質密度有密切關系。有研究[22]表明，Leptin能夠激活JAK/STAT信號與BMP-9發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進骨髓間充質干細胞成骨分化。Bartell等[23]體內實驗研究闡明給與大鼠皮下注射Leptin后能夠促進骨生長，同時對血清OPG、骨鈣素劑量的依賴性增加，也確證瘦素對骨的代謝作用使得骨生長增加。除能夠促進成骨分化外，Leptin抑制人外周血單核細胞培養(yǎng)物中破骨細胞的生成，減少破骨細胞壽命[24-25]。

VEGF因誘導新血管生成已受到醫(yī)學各科廣泛關注，血管為骨組織提供氧氣、營養(yǎng)、生長因子和激素，在骨形成中起著至關重要的作用，與骨修復關系是不可分割的。在OP領域VEGF與骨細胞的相互作用已成為大家關注的熱點問題，Street等[26]通過實驗分別從抑制成骨細胞凋亡、促進骨形成、修復骨損傷3個方面證實VEGF與骨形成之間的關系。此外Leptin從脂肪細胞分泌到血液系統(tǒng)，激活VEGF參與骨形成，促進成骨細胞分化已得到證實[9-10]。

本研究采用GIOP模型通過骨密度及病理組織學檢測確證了DEX 2.5 mg/kg劑量組為造模的最佳有效劑量，為后續(xù)的實驗探究奠定了堅實基礎。在后續(xù)研究中我們采用免疫組織化學及蛋白免疫印跡檢測SHAM組和DEX 2.5 mg/kg劑量組的股骨，從組織形態(tài)學及蛋白水平闡明DEX 2.5 mg/kg組較SHAM組Leptin、VEGF蛋白表達顯著下降，證實了GC誘導的OP過程是通過抑制Leptin、VEGF蛋白表達，抑制血管生成及成骨分化發(fā)揮作用的。本研究為后續(xù)治療GIOP藥物的開發(fā)提供了可靠證據和新的思路，為糖皮質激素性骨質疏松的防治提供理論基礎和科學依據。