顧恰敏，趙傳欣，劉敏,3*，陳高云，李丹

（1.陸軍防化學(xué)院，北京 102205；2.66072部隊(duì)，北京 100041；3.國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205）

神經(jīng)性毒劑對(duì)人類(lèi)和社會(huì)有極大的危害，沙林作為經(jīng)典的神經(jīng)性毒劑，殺傷速度快、致死率高，尋找到能夠高效降解神經(jīng)性毒劑尤其是降解沙林的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。有機(jī)磷水解酶（Organophosphorus Hydrolase，OPH）廣泛用于生物降解有機(jī)磷神經(jīng)毒劑和生物技術(shù)洗消有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。OPH是一種最初從黃桿菌屬和缺陷假單胞菌中分離純化得到的酯酶[1-2]。OPH由有機(jī)磷水解酶基因（opd）編碼，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有較寬的底物范圍，能夠斷裂P-O、P-S、P-F和P-CN等化學(xué)鍵[3]。這種酯酶可以水解包括有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑（如沙林、梭曼等）和對(duì)氧磷、對(duì)硫磷、甲基對(duì)硫磷等廣泛使用的殺蟲(chóng)劑在內(nèi)的有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物。傳統(tǒng)降解有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物多采用化學(xué)法，即利用“三合二”等強(qiáng)氧化性物質(zhì)催化水解。此類(lèi)化合物大多具有強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性，腐蝕性高，不適用于環(huán)境和精密儀器的洗消。酶類(lèi)水解有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物反應(yīng)條件溫和、無(wú)二次污染，對(duì)環(huán)境污染修復(fù)和保障人員健康具有重大意義。有機(jī)磷水解酶是一種公認(rèn)的在處理有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物方面很有前景的酶。但野生的有機(jī)磷水解酶活性不高、分泌表達(dá)不理想，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。本文通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)設(shè)計(jì)改良有機(jī)磷水解酶的結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式，尋找更加高效、廣譜、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的降解有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物的手段。

本文選用枯草芽孢桿菌表達(dá)體系分泌表達(dá)有機(jī)磷水解酶，以解決其在天然生物體中存在的產(chǎn)量低、純化困難等問(wèn)題。枯草芽孢桿菌是一種安全性高、遺傳背景清晰、便于基因工程改造的革蘭氏陽(yáng)性研究模式菌[4]，其無(wú)密碼子偏愛(ài)性[5]，多種外源基因都可以高效翻譯表達(dá)[6]，且對(duì)培養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、操作方便。通用的大腸桿菌表達(dá)體系易形成無(wú)活性的包涵體[7]，而枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力，可以將外源性的蛋白直接分泌到胞外且具有生物活性，這對(duì)蛋白質(zhì)的后期純化與實(shí)際使用有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌RIK1285（Bacillus subtilis）、載體pBE-S、有機(jī)磷水解酶基因及突變體，防化學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室保存；沙林（Sarin，GB）純品，防化學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。

質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、NdeⅠ內(nèi)切酶、PstⅠ內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker及蛋白Marker，均采購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)，購(gòu)自中科森輝微球技術(shù)（蘇州）有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1000II超凈工作臺(tái)，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；SynergyHTX/2/H1多功能微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；2720型PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；LX-B立式壓力蒸汽滅菌器，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本日立有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基（1 L）：氯化鈉10 g，酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，pH值為7.4（加2%瓊脂即為固體培養(yǎng)基）。

10×最低鹽溶液（100 mL）：14 g K2HPO4，6 g KH2PO4，2 g (NH4)2SO4，1 g檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O），0.2 g MgSO4·7H2O。

SPⅠ培養(yǎng)基：2 mg/mL L-色氨酸2.5 mL，10%酵母溶液1 mL，5%水解酪蛋白溶液0.4 mL，50%葡萄糖溶液1 mL，1×最低鹽溶液95 mL。

SPⅡ 培 養(yǎng) 基：2 mg/mL L-色 氨 酸 0.5 mL，0.5 mol/L MgCl2溶液0.5 mL，0.1 mol/L CaCl2溶液0.5 mL，10%酵母溶液0.04 mL，5%水解酪蛋白溶液0.08 mL，50%葡萄糖溶液1 mL，1×最低鹽溶液97.5 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建蛋白表達(dá)質(zhì)粒pBE-S-opd

根據(jù)載體pBE-S圖譜，選擇酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)His標(biāo)簽在C端的引物，擴(kuò)增野生型有機(jī)磷水解酶基因（opd）和含有H254R-H257Y-L303T突變位點(diǎn)的有機(jī)磷水解酶基因（RYT-opd）。引物序列片段見(jiàn)表1。

表1 引物序列片段

1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段。雙酶切載體pBE-S和擴(kuò)增產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳后，回收酶切的質(zhì)粒和目的基因片段。用T4連接酶將目的基因片段連接到pBE-S中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α后，涂板含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取陽(yáng)性單克隆，用含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基平板，搖12 h后，提取質(zhì)粒，對(duì)連入的目的基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保存測(cè)序正確的單克隆質(zhì)粒。

我把習(xí)慣上課回頭的學(xué)生請(qǐng)到身邊，告訴他我的所見(jiàn)：“我總是看到你上課扭過(guò)頭來(lái)，后面的人并不理你啊，怎么回事呢？”我以為他會(huì)說(shuō)課聽(tīng)不進(jìn)去，想跟后面的人講話。結(jié)果他說(shuō)：“啊？我不知道，可能是習(xí)慣了。”扭頭只是他的慣性動(dòng)作，他潛意識(shí)里壓根兒不知道自己扭頭了。

1.2.2 轉(zhuǎn)化B. subtilis RIK1285感受態(tài)細(xì)胞

在LB平板上劃線活化RIK1285，放入37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取活化的菌斑到2 mL液體LB培養(yǎng)基，28 ℃搖培16 h。取50 μL菌液到5 mL的SPⅠ培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)至菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期。將pBE-S-opd質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到RIK1285感受態(tài)細(xì)胞剛穩(wěn)定期。取0.5 mL的菌體到4.5 mL SPⅡ培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)90 min。加入50 μL的100 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸在37 ℃搖培5～10 min。將培養(yǎng)基按300 μL/支分裝至10 mL圓底離心管。加入1 μg質(zhì)粒DNA至1支分裝的感受態(tài)細(xì)胞中，在30 ℃搖培90 min，然后涂板含10 μg/mL的卡那霉素（Ka）LB培養(yǎng)基，放入37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆，37 ℃搖菌后，保存菌種，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 OPH的分泌表達(dá)和收集

將轉(zhuǎn)化后的RIK1285-pBE-S-opd株從-80 ℃冰箱取出，在LB+Ka（10 μg/mL）的平板劃線，放入37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上長(zhǎng)好的單克隆，至600 mL LB液體培養(yǎng)基（1 L三角瓶，加入終濃度為10 μg/mL的Ka抗生素），放入37 ℃，180 r/min的搖床培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的菌液倒入500 mL離心瓶中（分2個(gè)離心瓶收集，每瓶250 mL菌液），配平后，8 000 r/min、25 ℃離心15 min，小心地將上清倒入干凈的1 L三角瓶中，將沉淀?xiàng)壍?。OPH分子量約為36 kD，將上清液用截留分子量為10 kD的超濾濃縮管在4 ℃，4 000 r/min離心濃縮至150 mL。

1.2.4 分泌蛋白的鎳柱純化

將總?cè)莘e為20 mL的蛋白純化柱固定在鐵架臺(tái)后，將NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)從4 ℃冰箱中取出顛倒混勻，取出5 mL NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)，加入蛋白純化柱柱底，取下柱子下方的止水塞，將NTA金屬螯合親和層析介質(zhì)中的乙醇沿重力自然流干，沿柱面輕輕加入15 mL裂解緩沖液，沿重力流干，然后再重復(fù)一次。分次將裂解的上清蛋白液輕輕沿柱面加入，重力過(guò)柱；沿柱面輕輕加入15 mL沖洗緩沖液1，沿重力流干；分別使用15 mL沖洗緩沖液2沖洗2次，15 mL沖洗緩沖液3沖洗2次；沿柱面分3次，輕輕加入15 mL洗脫緩沖液，收集流出液，即為純化的蛋白。用ddH2O將截留分子量為10 kD的蛋白超濾濃縮管清洗2次，然后將蛋白加入到超濾管中，4 000 r/min、4 ℃離心約30 min，將蛋白濃縮至1.5 mL。

1.2.5 純化蛋白濃度測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)法：將2 mg/mL的BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后，向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品中加入1 mL考馬斯亮藍(lán)蛋白濃度測(cè)定液；同樣取20 μL待測(cè)樣品，加入1 mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻后，吸出200 μL至平底透明96孔板中，檢測(cè)595 nm下的吸光值。

1.2.6 重組有機(jī)磷水解酶的活性測(cè)定

沙林標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：稱取100 μg/mL的沙林標(biāo)準(zhǔn)液 0 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 和250 μL，分別加入 0.01 mol/L PBS 溶液至 500 μL，再依次加入125 μL丙酮、125 μL 0.5%聯(lián)苯胺水溶液和500 μL 0.25%過(guò)硼酸鈉水溶液。測(cè)定406 nm處的吸光值。

聯(lián)苯胺定量法檢測(cè)酶活：過(guò)硼酸鈉在堿性水中分解出過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫與G類(lèi)毒劑作用生成過(guò)氧磷酸，此過(guò)氧磷酸有強(qiáng)的氧化能力，能氧化聯(lián)苯胺生成有色的偶氮染料，并在波長(zhǎng)406 nm處有特異吸收峰，檢測(cè)樣品在406 nm處的吸光值，進(jìn)而計(jì)算剩余沙林的含量和酶的活性。

反應(yīng)體系（1.25 mL）：0.01 mol/L PBS溶液稀釋酶液使蛋白質(zhì)濃度一致；取250 μL稀釋后酶液加入250 μL 100 μg/mL沙林，室溫反應(yīng)5 min后，依次加入125 μL丙酮、125μL 0.5%聯(lián)苯胺水溶液和500 μL 0.25%過(guò)硼酸鈉水溶液，測(cè)定吸光值并計(jì)算剩余沙林含量和酶的活性。將每分鐘每毫克蛋白酶降解的沙林毫克數(shù)定義為有機(jī)磷水解酶的酶活單位。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

BIOVIA Discovery Studio 2020 蛋白模擬軟件。由NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查找野生型OPH結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入BIOVIA Discovery Studio后，修改OPH關(guān)鍵位置氨基酸，建模有機(jī)磷水解酶突變體結(jié)構(gòu)，生成結(jié)構(gòu)示意圖，分析有機(jī)磷水解酶突變體的性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含有機(jī)磷水解酶基因的枯草芽孢桿菌

根據(jù)1.2.1及1.2.2構(gòu)建含有機(jī)磷水解酶基因的枯草芽孢桿菌重組菌株，所獲得的菌株提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定其基因序列與預(yù)期一致。質(zhì)粒利用NdeⅠ和PstⅠ水解酶雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 質(zhì)粒雙酶切凝膠電泳圖

2.2 有機(jī)磷水解酶蛋白濃度

根據(jù)1.2.5繪制蛋白曲線并確定純化后的有機(jī)磷水解酶濃度。根據(jù)表2可得，蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.764 6x+0.002 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

表2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液吸光度

純化后野生型有機(jī)磷水解酶的蛋白濃度為0.461 mg/mL，含有H254R-H257T-L303Y突變位點(diǎn)的有機(jī)磷水解酶突變體的蛋白濃度為0.429 mg/mL。

2.3 有機(jī)磷水解酶水解沙林活性測(cè)定

根據(jù)1.2.6方法繪制沙林標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)表3可得，沙林的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.003 2x+0.061 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.995。

表3 沙林標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度

根據(jù)1.2.6測(cè)試枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)的有機(jī)磷水解酶水解沙林的酶活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。5 min時(shí)，野生型有機(jī)磷水解酶對(duì)沙林的水解率為42.72%，酶活為 0.407 mg/（min·mg）。含有 H254R-H257YL303T突變位點(diǎn)的有機(jī)磷水解酶突變體對(duì)沙林的水解率為82.88%，酶活為0.790 mg/（min·mg），酶活提高了94.1%。實(shí)驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌所分泌表達(dá)的有機(jī)磷水解酶具有較好的酶活性，并且H254RH257Y-L303T三個(gè)突變位點(diǎn)聯(lián)合突變，顯著提高了有機(jī)磷水解酶降解沙林的能力。

表4 野生型有機(jī)磷水解酶和突變體水解沙林的能力

2.4 有機(jī)磷水解酶結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)BIOVIA軟件對(duì)有機(jī)磷水解酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。發(fā)現(xiàn)H254R-H257Y-L303T突變體的能量低于野生型有機(jī)磷水解酶，推測(cè)突變體的蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這對(duì)有機(jī)磷水解酶的儲(chǔ)存、活性保持和熱穩(wěn)定性均有著積極的意義，是一種理想的突變方式。

圖3 含H254R-H257Y-L303T突變位點(diǎn)的有機(jī)磷水解酶

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)有機(jī)磷水解酶的表達(dá)體系，將有機(jī)磷水解酶基因插入pBE-S載體后轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中。重組枯草芽孢桿菌表達(dá)體系培養(yǎng)48 h，通過(guò)超濾濃縮和鎳柱純化后，有機(jī)磷水解酶濃度為0.4 mg/mL。本研究構(gòu)建的枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)體系使得有機(jī)磷水解酶的獲得和純化更為簡(jiǎn)易快捷，為后續(xù)有機(jī)磷水解酶的實(shí)際應(yīng)用和工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的基礎(chǔ)。

本研究在分泌表達(dá)野生型有機(jī)磷水解酶的基礎(chǔ)上，選擇了一種含有H254R-H257Y-L303T三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變的有機(jī)磷水解酶突變體進(jìn)行表達(dá)，并比較了突變體和野生型水解神經(jīng)性毒劑沙林的水解效果。結(jié)果表明，5 min時(shí)，含有H254R-H257Y-L303T突變位點(diǎn)的有機(jī)磷水解酶突變體對(duì)沙林的水解率為82.88%，酶活為0.790 mg/（min·mg），比野生型有機(jī)磷水解酶的酶活提高了94.1%。H254R-H257YL303T三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變是本課題組在前期單點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上構(gòu)建的新突變組合。其中，H254和H257位點(diǎn)處于OPH的活性中心大疏水口袋（H254、H257和L271），通過(guò)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將極性帶正電荷且親水的組氨酸突變?yōu)榫彼岷蜆O性不帶電荷且疏水的酪氨酸，這可能改變了疏水口袋的電荷情況并使疏水口袋的疏水性得到加強(qiáng)，促進(jìn)了該口袋結(jié)構(gòu)與底物分子取代基的作用。303位點(diǎn)處于小疏水口袋（M317、G60、I106、L303和S308），雖然在前期實(shí)驗(yàn)中，L303位點(diǎn)非極性的亮氨酸突變?yōu)闃O性的蘇氨酸后，水解酶的水解能力受到抑制，但當(dāng)H254R-H257Y與L303T聯(lián)合突變，水解酶的水解能力得到了明顯促進(jìn)作用，這可能是因?yàn)镠254R-H257Y與L303T聯(lián)合突變同時(shí)改變了大小口袋，促進(jìn)沙林水解鍵位的斷裂和官能團(tuán)的去除。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)有機(jī)磷水解酶的表達(dá)體系并驗(yàn)證了所表達(dá)的有機(jī)磷水解酶具有良好的活性。分泌表達(dá)了含有H254R-H257YL303T三點(diǎn)突變的有機(jī)磷水解酶突變體，一定程度提高了野生型有機(jī)磷水解酶水解沙林的能力，表明改變有機(jī)磷水解酶的活性中心位點(diǎn)的氨基酸種類(lèi)能夠有效的影響其酶活性。后續(xù)研究中，可以結(jié)合蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分析，篩選出更多的影響較大的活性位點(diǎn)和更加合理的突變氨基酸種類(lèi)，以期找到更優(yōu)的重組型和分泌表達(dá)體系。隨著科研探索的逐漸深入，期望獲得性能優(yōu)良、底物范圍廣、實(shí)用價(jià)值高的水解酶，并能夠?qū)⑦@些新型降解工具從實(shí)驗(yàn)室向?qū)嶋H應(yīng)用推廣，為降解神經(jīng)性毒劑和殺蟲(chóng)劑等有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物提供一個(gè)高效、經(jīng)濟(jì)、綠色、環(huán)保的新手段。