劉月蘋

（1.唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北唐山 063004；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110866）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是引起人類腸胃炎的一種致病菌，常存在于人們食用的貝類產(chǎn)品及魚類中，其主要致病機(jī)理是該菌可產(chǎn)生溶血毒素，包括耐熱性溶血毒素（TDH）、耐熱性溶血毒素相關(guān)的溶血毒素（TRH）及不耐熱溶血毒素（TLH），其中TDH和TRH是副溶血性弧菌的主要致病因子。近幾年來(lái)，副溶血性弧菌已超過(guò)沙門氏菌成為危害性最大的食源性病原菌，其引起的食源性致病案例更是呈明顯上升趨勢(shì)。因此，研究開(kāi)發(fā)可快速檢測(cè)致病性的副溶血性弧菌的方法至關(guān)重要。

傳統(tǒng)檢測(cè)方法大多要經(jīng)過(guò)增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)反應(yīng)等過(guò)程，操作時(shí)間長(zhǎng)，步驟煩瑣，檢出率也較低。宋晶玲[1]利用神奈川試驗(yàn)與PCR檢測(cè)183株O3：K6血清型副溶血性弧菌毒力基因時(shí)發(fā)現(xiàn)神奈川試驗(yàn)存在部分trh基因的漏檢，而采用實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR）、基因芯片與脈沖場(chǎng)電泳（PFGE）等方法檢測(cè)副溶血性弧菌的技術(shù)含量高，使用設(shè)備價(jià)格昂貴[2]。

因此，本研究采用種特異性基因tlh和毒力基因trh為模板進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，在確定副溶血性弧菌種屬的基礎(chǔ)上進(jìn)行trh毒力基因的檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行雙重PCR的靈敏度及人工污染靈敏度的檢測(cè)，初步建立了準(zhǔn)確檢測(cè)攜帶致病基因trh的副溶血性弧菌的雙重PCR技術(shù)，并且提高了檢測(cè)靈敏度和特異性，避免了神奈川試驗(yàn)假陽(yáng)性的干擾，節(jié)約時(shí)間和材料成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

標(biāo)準(zhǔn)菌株：副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)菌株：微生物生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的非副溶血性弧菌，包括李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、創(chuàng)傷弧菌、熱帶假絲酵母、傷寒沙門氏菌和芽孢桿菌。

1.1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer和6×Loading Buffer，TAKARA公司；EB，Sigma公司；DL 2 000 marker，上海生工生物工程公司；瓊脂糖，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

UV-10000型凝膠成像儀，驥輝分析儀器(上海)有限公司；T100型PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司；721型紫外分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由TAKARA公司合成，如表1所示。

表1 tlh和trh基因的引物序列

反應(yīng)體系：3.75 pmol/μL的tlh引物對(duì)各1 μL，3.75 pmol/μL的trh引物對(duì)各4 μL，2.5 μL的10×buffer（ 含 Mg2+），2.0 μL 的 2.5 mmol/L 的 dNTP，4 μL的 DNA 模板，0.2 μL 的 Taq酶（5 U/μL），補(bǔ)水至反應(yīng)體系25 μL。

反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，1 min；退火 55 ℃，1 min；延伸 72 ℃，2 min；循環(huán) 29次；最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸10 min。雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，成像系統(tǒng)成像。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

取4 ℃保存的斜面菌種進(jìn)行活化，挑取生長(zhǎng)菌一環(huán)，接種到盛有50 mL培養(yǎng)基的三角瓶中37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，所用培養(yǎng)基為胰胨肉湯。

1.2.2 模板DNA的提取

取0.6 mL對(duì)數(shù)期菌懸液與0.6 mL的2×TZ細(xì)胞裂解液混勻，使TZ工作濃度為2.0%的Triton X-100，2.5 mg/mL的疊氮化鈉，0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液，pH 8.0。沸水浴10 min后冷卻到室溫，15 000 r/min離心10 min，取上清（含DNA）備用。

1.2.3 PCR體系優(yōu)化及產(chǎn)物分析

在確定了反應(yīng)體系為25 μL后，通過(guò)多次試驗(yàn)先確定了影響較小的因素：10×Buffer（含Mg2+），2.5 μL；2.5 mmol/L 的 dNTP，2.0 μL；Taq 酶 0.2 μL，DNA模板4 μL。對(duì)影響較大的引物濃度和退火溫度進(jìn)行調(diào)試，其中退火溫度調(diào)試范圍為在50.8～59.2 ℃；trh和tlh的引物濃度均為3.75 pmol/μL，由于之前做單重PCR檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)引物trh用量為4 μL時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶亮度很亮，所以本試驗(yàn)采用trh引物用量為4 μL，tlh的引物用量范圍為0.5～4.0 μL。PCR反應(yīng)條件同1.1.2。

1.2.4 PCR反應(yīng)特異性檢測(cè)

采用TZ法分別提取副溶血性弧菌ATCC17802和7株非副溶血性弧菌的DNA，并利用優(yōu)化的雙重PCR體系進(jìn)行DNA理論擴(kuò)增反應(yīng)與電泳檢測(cè)分析。

1.2.5 驗(yàn)證雙重PCR檢測(cè)體系

活化試驗(yàn)室保存的利用傳統(tǒng)方法從海產(chǎn)品中篩選出的副溶血性弧菌菌株，用雙重PCR進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 PCR靈敏度檢測(cè)[3]

取對(duì)數(shù)期副溶血性弧菌懸液10 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，用生理鹽水在8 000 r/min，3 min條件下洗滌2次后，用生理鹽水進(jìn)行稀釋，測(cè)定其600 nm吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定菌濃度為2.0×107CFU/mL，之后用生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，分別取稀釋菌液0.5 mL抽提DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 人工模擬樣品檢測(cè)

取菌濃度1.45×108CFU/mL的副溶血性弧菌0.5 mL，分別接入經(jīng)檢測(cè)無(wú)副溶血性弧菌的5 g碎牡蠣肉、碎蝦肉、碎海鲇魚肉及魚鰓和魚腸中，胰胨肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、160 r/min增菌10 h，抽提DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 人工污染靈敏度檢測(cè)

取經(jīng)檢測(cè)無(wú)副溶血性弧菌的黃花魚肉5 g，無(wú)菌操作下剪碎，分別放入盛有45 mL胰胨肉湯培養(yǎng)液的9個(gè)三角瓶中，取經(jīng)過(guò)生理鹽水稀釋，菌濃度為1.0×108CFU/mL副溶血性弧菌進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取0.5 mL稀釋液放于三角瓶中，37 ℃、160 r/min培養(yǎng)10 h，從液面取0.5 mL增菌液進(jìn)行DNA提取，雙重PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR體系優(yōu)化及產(chǎn)物分析

影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的因素很多，其中兩個(gè)重要參數(shù)就是退火溫度和引物濃度[4]。首先利用PCR儀優(yōu)化退火溫度（圖1），在最佳的退火溫度下根據(jù)PCR擴(kuò)增條帶的亮暗調(diào)整引物濃度，以便使用較少的引物達(dá)到最佳的效果。

圖1 退火溫度優(yōu)化

由圖1可知，退火溫度在50.8～59.2 ℃內(nèi)，擴(kuò)增片段為450 bp的條帶亮度都很強(qiáng)，300 bp的條帶亮度隨著退火溫度的降低亮度變強(qiáng)，而降低退火溫度可以提高PCR擴(kuò)增效率，因此選擇55 ℃為最佳退火溫度。

由圖2可知，在固定trh引物用量、變化tlh引物用量的情況下，擴(kuò)增片段300 bp的條帶亮度都很弱，引物用量超過(guò)1.0 μL后亮度無(wú)法滿足檢測(cè)要求；而擴(kuò)增片段為450 bp的條帶亮度隨用量的增加而增加。在3.75 pmol/μL的tlh引物對(duì)各1.0 μL，與3.75 pmol/μL的trh引物對(duì)各4 μL時(shí)，雙重PCR條帶亮度能夠達(dá)到檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 引物濃度優(yōu)化

2.2 特異性分析

采取TZ法對(duì)各種待測(cè)菌株進(jìn)行DNA的抽提，之后分別加入兩種引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增（圖3）。

圖3 雙重PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果

由圖3可知，利用優(yōu)化的雙重PCR對(duì)兩株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802的DNA進(jìn)行擴(kuò)增可獲得大小為450 bp和300 bp的兩條清晰的目的條帶，而非副溶血性弧菌沒(méi)有特異性條帶產(chǎn)生。說(shuō)明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)體系具有極好的特異性和穩(wěn)定性。

2.3 驗(yàn)證雙重PCR檢測(cè)體系

由圖4可知，雙重PCR方法與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果一致。5株經(jīng)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)與生化鑒定為副溶血性弧菌的菌株進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)，所有菌株均擴(kuò)增出tlh特異性條帶，而有些副溶血性弧菌還擴(kuò)增出trh毒力基因。說(shuō)明tlh可作為PCR鑒定副溶血性弧菌的菌屬特異性基因，該雙重PCR方法能夠準(zhǔn)確地鑒定出攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌。

圖4 雙重PCR檢測(cè)5株傳統(tǒng)方法檢測(cè)出的副溶血性弧菌

2.4 雙重PCR靈敏度分析

濃度為2.0×108CFU/mL的副溶血性弧菌培養(yǎng)液以十倍稀釋法稀釋，進(jìn)行PCR檢測(cè)。擴(kuò)增條帶的亮度隨著菌液濃度的減小而減弱；菌濃度為2.0×104CFU/mL時(shí)，450 bp和300 bp的目的片段都可擴(kuò)增出來(lái)；菌濃度為2.0×103CFU/mL、2.0×102CFU/mL和2.0×10 CFU/mL時(shí)，只有條帶亮度很弱的450 bp片段；濃度2.0 CFU/mL時(shí)雙重PCR擴(kuò)增條帶均消失（圖5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙重PCR對(duì)攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌的純菌菌液靈敏度可達(dá)到2.0×104CFU/mL，此靈敏度可滿足樣本增菌后的檢測(cè)要求。

圖5 雙重PCR的靈敏度分析

2.5 人工污染樣品檢測(cè)

取濃度為1.45×108CFU/mL的副溶血性弧菌，接種于盛有5 g碎牡蠣肉、碎蝦肉、碎鲇魚肉及魚鰓和魚腸的三角瓶中，增菌10 h后進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)。結(jié)果4種樣品都擴(kuò)增出了特異性條帶（圖6），試驗(yàn)證明該雙重PCR對(duì)海產(chǎn)品中存在的副溶血性弧菌有很好的特異性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，4種樣品特異性擴(kuò)增條帶亮度不一樣，碎魚肉的擴(kuò)增條帶亮度最亮?？赡苁遣煌．a(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分不同，供細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境也不相同，使含相同菌量的海產(chǎn)品在相同的增菌時(shí)間內(nèi)獲得的菌體數(shù)不同。

圖6 海產(chǎn)品中雙重PCR檢測(cè)結(jié)果

2.6 人工污染靈敏度分析

不同菌濃度的副溶血性弧菌污染黃花魚肉后，增菌10 h，雙重PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。PCR條帶亮度隨著污染用菌濃度的減小而減弱，在1.0×103CFU/mL時(shí)，擴(kuò)增出450 bp和300 bp的目的片段，而小于該菌濃度時(shí)，只有450 bp的目的片段且其亮度逐漸減弱至沒(méi)有。因此，人工污染試驗(yàn)中檢測(cè)攜帶trh毒力基因副溶血性弧菌的靈敏度為1.0×103CFU/mL，即黃花魚肉中攜帶trh毒力基因的副溶血性弧菌含量為100 CFU/g時(shí)，增菌10 h該檢驗(yàn)方法可檢出。

圖7 人工污染黃花魚肉中雙重PCR靈敏度分析

3 結(jié)論

目的基因的選擇對(duì)于多重PCR檢測(cè)技術(shù)的特異性尤為重要，關(guān)于副溶血性弧菌目的基因的選擇，很多研究報(bào)道采用了不同的基因。強(qiáng)世龍等[5]與岳友宏等[2]采用tlh與tdh基因進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)，林佳琪等[6]采用tlh、tdh、tox R、trh基因進(jìn)行四重PCR檢測(cè)。tlh基因作為其種屬鑒定基因是所有副溶血性弧菌都攜帶的，trh基因可用于其trh毒性的鑒定。除了trh基因外，副溶血性弧菌的溶血毒素還包括耐熱性溶血毒素（TDH），也是副溶血性弧菌的主要致病因子，在臨床腹瀉患者分離的副溶血性弧菌菌株中90%以上攜帶tdh和（或）trh基因。但trh基因在其他弧菌中有交叉現(xiàn)象，與其他弧菌存在約93%～96%的同源性[7]，同時(shí)在副溶血性弧菌神奈川試驗(yàn)為陰性時(shí)也含有致病基因trh[5]，因此本試驗(yàn)采用trh基因與種特異性基因tlh設(shè)計(jì)引物進(jìn)行雙重PCR的擴(kuò)增。

在雙重PCR試驗(yàn)過(guò)程中，任何一個(gè)條件不符合，都很容易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物或者擴(kuò)增失敗。退火溫度是影響PCR反應(yīng)特異性的重要因素之一，較低的退火溫度會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度增高，增大引物與模板錯(cuò)配機(jī)會(huì)，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，造成涂抹帶或者片狀帶。較高的退火溫度，會(huì)使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度降低，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果[4]。同時(shí)，引物濃度對(duì)雙重PCR擴(kuò)增也有較大的影響，PCR反應(yīng)中，引物一般最適濃度為0.1～1.0 mol/L[8]。過(guò)低的引物濃度會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)法完成30個(gè)循環(huán)，使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低；過(guò)高的引物濃度會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，在電泳結(jié)果中出現(xiàn)雜帶[4]。針對(duì)這些情況，本研究通過(guò)多次試驗(yàn)確定退火溫度為55 ℃，tlh引物濃度為1.875～14.000 μmol/L，trh引物濃度為14.000 μmol/L，比一般的單重PCR所用引物濃度要低。試驗(yàn)中沒(méi)有形成大量的引物二聚體，擴(kuò)增效果極好，建立了穩(wěn)定的雙重PCR反應(yīng)體系。

本研究人工污染靈敏度為1.0×103CFU/mL，與純菌菌液靈敏度相比要高，分析原因可能是黃花魚肉的主要成分蛋白大大促進(jìn)副溶血性弧菌的生長(zhǎng)。通過(guò)計(jì)算，此雙重PCR檢測(cè)污染黃花魚肉樣品檢出限為100 CFU/g，比強(qiáng)世龍[5]報(bào)道的雙重PCR檢測(cè)模擬污染紅螺樣品檢出限10 CFU/g要低一個(gè)數(shù)量級(jí)。