王亞瓊，鐘水生，張華鋒，周堅，薛滿

作者單位：蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇 蘇州215104

多環(huán)芳烴是有機物不完全燃燒時產(chǎn)生的分子中含有2 個或2 個以上苯環(huán)稠合而成的揮發(fā)性碳?xì)浠衔铩Ｔ缭?0世紀(jì)，多環(huán)芳烴的致癌作用就被研究者們關(guān)注，15種多環(huán)芳烴在1976年被國際癌癥研究中心列為化學(xué)致癌物，脂溶性的致癌物對中藥水煎劑的風(fēng)險較低，但對注射液的影響極大［1-2］。多環(huán)芳烴是具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變作用的重要環(huán)境和食品污染物。多年來，大氣、土壤、水體中多環(huán)芳烴的濃度受到廣泛關(guān)注。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品中污染物的限量》中規(guī)定有食品中苯并（a）芘的限量。歐盟在2015年10月27 日修改了多環(huán)芳香烴在部分產(chǎn)品中的最高限量，其中涉及干的草藥苯并（a）芘、苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽總和的限量。而國內(nèi)目前尚無中藥來源樣品中多環(huán)芳烴的限量要求。

多環(huán)芳烴的分析方法包括液相色譜法［3］、液質(zhì)聯(lián)用法［4］、氣相色譜法［5］、氣質(zhì)聯(lián)用法［6］等，多見于環(huán)境和食品專業(yè)的報道［7-17］。近年來，中藥材中多環(huán)芳烴污染也逐漸受到中藥安全性研究者們的關(guān)注，天花粉、大黃、葛根等藥材中均檢出多環(huán)芳烴的殘留［6，18］。本研究以平時抽檢工作中收集的多來源中藥樣品為研究對象，采用環(huán)境污染監(jiān)測國際通用的16 種多環(huán)芳烴為指標(biāo)，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GCMS/MS）測定中藥材中多環(huán)芳烴的殘留，為今后中藥中多環(huán)芳烴殘留量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料超細(xì)勻漿機AS145S-P（上海昂尼儀器儀表有限公司，China），高速打粉機（Asone，Japan），電子天平AG245（METTLER，Swiss），超聲儀（HU615 OF，China）。氣相質(zhì)譜（GC-MS）系統(tǒng)（GC：Agi?lent6890N 氣相色譜儀，配Agilent7683B 自動進樣器；MS：Agilent7000c，USA）。氣相毛細(xì)管柱（DB-5MS，0.25μm，30 m×0.25 mm，J&W Scientific，USA）。16 種多環(huán)芳烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（2 000 ng/μL in Acetone/Benzene，Germany），4 種氘代同位素內(nèi)標(biāo)（CDN ISO?TOPES，Canada）（表1），乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷（HPLC，Honeywell 農(nóng)殘級別，USA）。SPE 小柱（200 mg/3 mL，Agilent，USA），QuEChERS SPE（SHIMAD?ZU-GL，Japan）。實驗樣品：根類藥材34 份、木類藥材8 份、果實種子類藥材8 份、花類藥材31 份（其中金銀花25份）、皮類藥材6份、菌類藥材4份、動物類藥材4 份、寄生類藥材4 份、葉類藥材3 份及全草類藥材7 份，共計109 份樣品來自日常檢驗工作中的對照藥材、抽檢及送檢。所有樣品照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢驗結(jié)果均符合規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1色譜及質(zhì)譜條件 氣相升溫程序：初始溫度75 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升溫至150 ℃，再以3 ℃/min 升溫至300 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min 升溫至320 ℃，保持1 min。載氣為高純氦，流速1.5 mL/min。進樣口溫度：310 ℃，不分流脈沖進樣。離子源為EI，電子能量：70 eV。四級桿溫度：180 ℃，離子源溫度：310 ℃。16 種及4 種氘代同位素內(nèi)標(biāo)多環(huán)芳烴質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（MRM）模式具體選擇離子見表1。

表1 16種及4種氘代同位素內(nèi)標(biāo)多環(huán)芳烴質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（MRM）模式具體選擇離子

1.2.2 樣品提取 精密稱取藥材細(xì)粉2 g，加含4 種同位素內(nèi)標(biāo)（10 μg/L）乙腈溶液10 mL，靜置24 h 后超聲提取10 min，過濾，即得。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 將測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入Agilent Mass?Hunter Quantitative Analysis 進行定量分析，采用基質(zhì)標(biāo)曲內(nèi)標(biāo)法計算。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢出限及基質(zhì)效應(yīng) 用乙腈將16 種多環(huán)芳烴標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一定濃度的貯備液，逐步稀釋，進樣，S/N=3 時為檢測限，S/N=10時為定量限，根據(jù)定量限的結(jié)果我們加入內(nèi)標(biāo)溶液逐級稀釋成多環(huán)芳烴質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、25、50、100、150、200 μg/L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為20 μg/L。以待測物相對濃度為橫坐標(biāo)（x），待測物與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積相對響應(yīng)為縱坐標(biāo)（y），用Agilent MassHunter Quantitative Analysis進行分析，可得內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，同時用空白基質(zhì)樣品（目標(biāo)物低于檢出限）配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，制備有基質(zhì)的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，進行分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限、定量限及相關(guān)系數(shù)R2具體結(jié)果見表2。由空白標(biāo)準(zhǔn)曲線與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比較得知目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)較低，基本對測定無影響，滿足痕量測定要求。

表2 16種多環(huán)芳烴分析用內(nèi)標(biāo)物及標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.4.2 重復(fù)性、穩(wěn)定性 重復(fù)性樣本取金銀花樣品6份，按“1.2.2”方法分別提取后進樣，計算目標(biāo)物相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）。穩(wěn)定性樣本提取后室溫放置0、2、4、8、16、32、48 h 進樣，計算目標(biāo)物在所有時間段的總RSD。結(jié)果見表3。結(jié)果可見目標(biāo)測定物的重復(fù)性及穩(wěn)定性均較好。

表3 16種多環(huán)芳烴的重復(fù)性、穩(wěn)定性/%

1.2.4.3 精密度 取標(biāo)準(zhǔn)曲線高、中、低（150μg/L，40μg/L，2μg/L）3個濃度點樣品分別進樣6次，計算RSD。結(jié)果見表4。

表4 16種多環(huán)芳烴的精密度/%

1.2.4.4 回收率 參考國內(nèi)外多數(shù)法定標(biāo)準(zhǔn)采用苯并（a）芘不得超過5 μg/kg 的限量標(biāo)準(zhǔn)，進行3 水平添加實驗［6］。取空白基質(zhì)樣品分別添加高濃度25μg/kg、中濃度5μg/kg、低濃度1μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平平行測定3 份，計算回收率及RSD，結(jié)果見表5。

表5 16種多環(huán)芳烴的回收率/%

2 結(jié)果

本次實驗分析方法學(xué)滿足痕量分析要求，個別多環(huán)芳烴單體基質(zhì)效應(yīng)影響較大，因此所有樣品采用基質(zhì)標(biāo)曲計算濃度。109 份樣品均檢出多環(huán)芳烴污染物，多環(huán)芳烴單體濃度范圍為未檢出至548.3μg/kg，16 種多環(huán)芳烴之和的濃度范圍為27.5～2 409.4 μg/kg。2-4 環(huán)的多環(huán)芳烴檢出率較高，5 環(huán)及以上的檢出率較低。樣品中以小分子多環(huán)芳烴為主。從各類樣品平均檢出總濃度看，花類>葉類>動物類>果實種子類>皮類>根類>菌類>全草類>木類>寄生藤類。花類樣品對多環(huán)芳烴富集濃度最高，葉類、動物類、根類等次之。

3 討論

（1）毒性當(dāng)量因子評價：國際上對苯并（a）芘的研究最早，且具有很強的致癌性，常以其作為多環(huán)芳烴污染的標(biāo)志物，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017《食品中污染物的限量》中規(guī)定食品中苯并（a）芘在谷物、肉類和水產(chǎn)動物產(chǎn)品中限量為5 μg/kg。參考該限量指標(biāo)，利用毒性當(dāng)量因子［19］計算樣品中16種多環(huán)芳烴總毒性當(dāng)量濃度（toxic equivalent con?centration，TEC），即相對于苯并（a）芘的濃度，用于進行風(fēng)險評估。109 份樣品中11.8%的根類、12.5%的果實種子類、9.7%的花類結(jié)果超限。

（2）點評估法評價：采用點評估法，以金銀花樣本為例，對多環(huán)芳烴攝入暴露風(fēng)險進行研究，美國環(huán)境保護署（EPA）點評估模式，急性點評估和慢性點評估的暴露量模型分別按公式（1）和（2）計算。

EXPa=LP×HR/bw…（1），

式（1）中：EXPa 為急性膳食暴露量（acute di?etaryexposure portion），LP 為金銀花日消費最大量97.5 百分位點值（kg/d），根據(jù)《中國藥典》2015 年版金銀花項下日用量為6～15 g 的規(guī)定，取0.015 kg 作為日消費最大量；HR 為金銀花中檢出的多環(huán)芳烴最大值（mg/kg）；bw為平均體質(zhì)量（kg），以60 kg計。

EXPc=I×R/bw…（2），

式（2）中：EXPc 為慢性膳食暴露量（chronic di?etary exposure portion），I為人參的平均日消費量（kg/d），依據(jù)《中國藥典》取值為0.001 kg；R 為金銀花中多環(huán)芳烴（μg/kg）平均值。每日允許攝入量（accept?able daily intake，ADI）值以5 μg/kg 為參考計算，風(fēng)險評估采用EXPa 和EXPc 與ADI 值比值評價急性、慢性攝入風(fēng)險，即急性風(fēng)險商和慢性風(fēng)險商。當(dāng)比值≤1時，認(rèn)為該危害物產(chǎn)生的風(fēng)險是可接受的；當(dāng)≥1 時，認(rèn)為該危害物產(chǎn)生的風(fēng)險超過可接受的限度，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險管理措施。經(jīng)計算EXPa=6.4×10-6，EXPc=0.3×10-6，急性風(fēng)險商為5.1 和慢性風(fēng)險商為0.34，從結(jié)果可看出，金銀花中多環(huán)芳烴的EX?Pc 顯著低于ADI 值，慢性風(fēng)險商遠(yuǎn)低于1，說明慢性風(fēng)險較小。而急性暴露風(fēng)險，急性風(fēng)險商明顯高于1，超過臨界值，急性暴露風(fēng)險較高，需要進行控制，急需制定相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)進行控制。

本研究對10 種類別109 份中藥樣本中16 種多環(huán)芳烴的殘留量進行GC-MS/MS 內(nèi)標(biāo)法的含量測定，以25 份金銀花樣本為例，采用點評估法進行風(fēng)險評估。發(fā)現(xiàn)中藥中多種來源的樣本均存在多環(huán)芳烴的污染，按食品及歐盟的標(biāo)準(zhǔn)，多環(huán)芳烴超標(biāo)率較高，存在一定的風(fēng)險。建議盡快制定控制中藥中多環(huán)芳烴殘留量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，保障中藥的安全使用。