劉璐，溫海楠，李婧，王惠，謝守軍，梁悅怡，劉焱超，孫啟玉(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北承德 067000)

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)檢出率不斷上升，已成為當(dāng)前公共健康領(lǐng)域嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)之一。CRE主要的耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，產(chǎn)碳青霉烯酶也是引起CRE流行和暴發(fā)的主要機(jī)制[1]。同時(shí)，產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE(carbapenemase producing carbapenem-resistant Enterobacterales，CP-CRE)感染患者的病死率比非產(chǎn)碳青霉烯酶CRE(non-carbapenemase producing carbapenem-resistant Enterobacterales，non-CP-CRE)感染患者的病死率高[2]，兩類患者用藥也明顯不同[3]。因此，快速精準(zhǔn)地檢測(cè)出占主導(dǎo)地位的CP-CRE，對(duì)臨床用藥及治療至關(guān)重要。近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜( matrix-assisted laser desorption /ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)廣泛用于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室，其通過(guò)分析細(xì)菌核糖體蛋白能夠快速、準(zhǔn)確、低成本地鑒定細(xì)菌[4]。而其在細(xì)菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用尚在研究中[5]，如何使用質(zhì)譜檢測(cè)CRE是一個(gè)新的挑戰(zhàn)。目前研究者們正深入探索如何將MALDI-TOF MS快速、準(zhǔn)確的鑒定能力應(yīng)用于檢測(cè)碳青霉烯酶[4]。本研究擬通過(guò)亞胺培南與待測(cè)菌株共孵育，利用Vitek 質(zhì)譜(Vitek mass spectrometry，Vitek MS)儀分析亞胺培南及其水解產(chǎn)物的變化，建立一種快速檢測(cè)CP-CRE的方法，并用前瞻性研究驗(yàn)證此方法檢測(cè)效果。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2018年12月至2020年10月臨床微生物室分離的52株非重復(fù)CRE菌株和36株碳青霉烯類敏感腸桿菌目細(xì)菌(CSE)，共88株；收集同期承德市中心醫(yī)院分離的40株非重復(fù)CRE菌株。陽(yáng)性對(duì)照菌株3株，分別為blaKPC-2基因陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌、blaKPC-2和blaNDM基因陽(yáng)性的大腸埃希菌、blaNDM基因陽(yáng)性的大腸埃希菌，均為上?？股匮芯克?zèng)送，并經(jīng)PCR測(cè)序驗(yàn)證；陰性對(duì)照菌株2株，分別為大腸埃希菌 ATCC 8739、大腸埃希菌ATCC 25922，購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心。

將承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院88株試驗(yàn)菌株和承德市中心醫(yī)院40株試驗(yàn)菌株分為2組：A組包括承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院CRE菌株1～52號(hào)、CSE菌株K1～K20號(hào)和E1～E10號(hào)，共82株，用于建立基于酶水解法的Vitek MS檢測(cè)CP-CRE的方法；B組包括承德市中心醫(yī)院CRE菌株53～92號(hào)和我院CSE菌株K21～K23號(hào)、E11～E13號(hào)，共46株，用于前瞻性研究驗(yàn)證上述方法的檢測(cè)效果。

1.1.2主要試劑與儀器 亞胺培南和美羅培南藥敏紙片(英國(guó)Oxoid公司)，2×Taq PCR Master mix(北京天根公司)，Vitek MS CHCA Matrix(法國(guó)Biomerieux公司)；注射用亞胺培南-西司他丁鈉(美國(guó)Merck Sharp&Dohme公司)，亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品(北京索萊寶公司)。Vitek 2.0全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、Vitek MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(法國(guó)Biomerieux公司)，DNA Engine Peltier熱循環(huán)儀(美國(guó)MJ Research公司)，細(xì)胞電泳儀(北京六一儀器廠)，紫外凝膠透射儀(北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所)。

1.1.3引物序列 碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP和blaOXA-48引物序列參考文獻(xiàn)[6]，見表1。引物由上海生工生物公司合成。

表1 碳青霉烯酶基因檢測(cè)引物及其產(chǎn)物大小

1.2方法

1.2.1菌株復(fù)蘇及藥敏復(fù)核 將保存于-80 ℃的試驗(yàn)菌株取出，置室溫下恢復(fù)15 min后接種于血平板，35 ℃溫育過(guò)夜。取復(fù)蘇后的新鮮單菌落，用紙片擴(kuò)散法復(fù)核亞胺培南和美羅培南的藥敏結(jié)果，抑菌圈的判讀標(biāo)準(zhǔn)參照2021年CLSI M100-S31文件。

1.2.2Vitek MS鑒定 以大腸埃希菌ATCC 8739作為質(zhì)控菌株，通過(guò)Vitek MS對(duì)試驗(yàn)菌株進(jìn)行鑒定。鑒定操作參考Vitek MS標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

1.2.3碳青霉烯酶基因檢測(cè) 采用PCR方法對(duì)A組和B組菌株進(jìn)行blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM和blaOXA-48碳青霉烯酶基因擴(kuò)增，其中A組先進(jìn)行PCR基因檢測(cè)，后進(jìn)行酶水解試驗(yàn)。B組先進(jìn)行酶水解試驗(yàn)，后進(jìn)行PCR基因檢測(cè)。煮沸法提取試驗(yàn)菌株DNA。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×Taq PCR Master mix 12.5 μL，10 mmol/L正向引物和反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。blaKPC、blaVIM和blaIMPPCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。blaNDM和blaOXA-48PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳(110 V，45 min)后，于紫外凝膠透射儀下觀察結(jié)果并記錄。

1.2.4基于酶水解法的Vitek MS檢測(cè)CP-CRE 參考文獻(xiàn)[7-11]并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)最終設(shè)計(jì)酶水解法過(guò)程為：取血平板上過(guò)夜溫育的新鮮單菌落，加4.5 g/L NaCl配制成0.5 McFarland菌懸液，吸取配制好的菌懸液1 mL加入EP管中，12 000×g離心3 min，棄上清液，留菌沉淀備用。將亞胺培南-西司他丁鈉粉劑加緩沖液[NH4HCO350 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L(pH 6.8),4.5 g/L NaCl，pH 7.0]配制成0.5 mg/mL的亞胺培南溶液，取50 μL亞胺培南溶液加入上述菌沉淀中混勻，35 ℃振蕩溫育，時(shí)間分別為5 min、10 min、20 min和30 min。溫育結(jié)束后立即12 000×g離心3 min。取1 μL上清液加入靶板點(diǎn)位，再加入1 μL基質(zhì)液混勻，待自然干燥后用Vitek MS的RUO系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)譜儀采用正線性離子模式在200～600 m/z的質(zhì)量范圍內(nèi)記錄光譜。Vitek MS RUO系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置如下：離子源20 kV，離子源透鏡6 kV，脈沖離子引出時(shí)間210 ns，激光頻率62 Hz。檢測(cè)采用手動(dòng)模式，在一個(gè)光譜的5個(gè)不同位置上共獲取500張圖片。采用α-氰基-4-羥基肉桂酸([M+Na]+=212.032 m/z，[2M+H]+=379.093 m/z)和亞胺培南標(biāo)準(zhǔn)品([M+H]+=300.4 m/z)進(jìn)行校準(zhǔn)。質(zhì)譜圖像經(jīng)過(guò)基線校正、去平滑。

設(shè)定A組菌株為酶水解法實(shí)驗(yàn)組，3株陽(yáng)性對(duì)照菌為陽(yáng)性對(duì)照，2株陰性對(duì)照菌為陰性對(duì)照，另設(shè)不加菌懸液的亞胺培南空白對(duì)照。以上每份樣本均加樣3個(gè)點(diǎn)位，亞胺培南水解產(chǎn)物峰強(qiáng)度和亞胺培南峰強(qiáng)度值取平均值，建立檢測(cè)CP-CRE的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5LogRQ值的計(jì)算和cut-off值的設(shè)置 本試驗(yàn)采用logRQ值[7]和cut-off值判斷亞胺培南是否被碳青霉烯酶水解。logRQ=log(亞胺培南水解產(chǎn)物峰強(qiáng)度/亞胺培南峰強(qiáng)度)。將PCR檢測(cè)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合logRQ值繪制不同溫育時(shí)間的受試者工作曲線(ROC曲線)，選擇曲線下面積(AUC)最大的ROC曲線計(jì)算相應(yīng)的cut-off值作為結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)。若logRQ值≥cut-off值，則水解試驗(yàn)陽(yáng)性，說(shuō)明試驗(yàn)菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，為CP-CRE菌株；反之，若logRQ值

1.2.6前瞻性研究對(duì)酶水解法的驗(yàn)證 選取B組菌株作為前瞻性研究樣本。根據(jù)單盲原則，采用“1.2.4”中基于酶水解法的Vitek MS檢測(cè)B組試驗(yàn)菌株，每份樣本加樣1個(gè)點(diǎn)位，并結(jié)合“1.2.5”中選擇的診斷界值(cut-off值)判斷標(biāo)本是否為CP-CRE菌株。最后采用PCR檢測(cè)試驗(yàn)菌株的blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM和blaOXA-48碳青霉烯酶基因，Vitek MS結(jié)果和PCR結(jié)果作一致性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1Vitek MS鑒定結(jié)果和藥敏試驗(yàn)結(jié)果 Vitek MS鑒定結(jié)果顯示，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院52株CRE包括肺炎克雷伯菌37株、大腸埃希菌9株、陰溝腸桿菌陰溝亞種4株、產(chǎn)酸克雷伯菌2株，36株CSE菌株包括23株肺炎克雷伯菌和13株大腸埃希菌；承德市中心醫(yī)院40株CRE菌株均為肺炎克雷伯菌。藥敏復(fù)核結(jié)果顯示，保存的所有CRE菌株均對(duì)亞胺培南和(或)美羅培南耐藥，CSE菌株均對(duì)亞胺培南和美羅培南敏感。

2.2碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院52株CRE均檢測(cè)出1種或1種以上的碳青霉烯酶基因，其中單blaKPC陽(yáng)性32株、blaKPC和blaNDM同時(shí)陽(yáng)性的菌株1株、單blaNDM陽(yáng)性18株、單blaIMP陽(yáng)性1株；36株CSE均未檢出碳青霉烯酶基因。承德市中心醫(yī)院40株CRE菌株均檢測(cè)出1種或1種以上的碳青霉烯酶基因，其中blaKPC陽(yáng)性39株，blaKPC和blaVIM同時(shí)陽(yáng)性的菌株1株。部分菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

注：1～4為陽(yáng)性對(duì)照菌株，5～6為試驗(yàn)菌株。1，肺炎克雷伯菌blaKPC-2陽(yáng)性(菌株：陽(yáng)性對(duì)照1)；2，大腸埃希菌blaKPC-2陽(yáng)性(菌株：陽(yáng)性對(duì)照2)；3，大腸埃希菌blaNDM陽(yáng)性(菌株：陽(yáng)性對(duì)照2)；4，大腸埃希菌blaNDM陽(yáng)性(菌株：陽(yáng)性對(duì)照3),5，肺炎克雷伯菌blaKPC-2陽(yáng)性；6，大腸埃希菌blaKPC-2陽(yáng)性；7，肺炎克雷伯菌blaIMP陽(yáng)性；8，肺炎克雷伯菌blaKPC-2陽(yáng)性；9，肺炎克雷伯菌blaNDM陽(yáng)性；10，肺炎克雷伯菌blaKPC-2陽(yáng)性。

2.3亞胺培南及其水解產(chǎn)物特征峰 亞胺培南空白對(duì)照在(300±0.55)m/z處有此藥的特征峰，并伴有微小的亞胺培南水解產(chǎn)物特征峰(254±0.1)m/z；52株CRE經(jīng)過(guò)與亞胺培南共同溫育后，均顯示亞胺培南特征峰(300±0.55)m/z消失且亞胺培南水解產(chǎn)物特征峰(254±0.1)m/z無(wú)明顯增長(zhǎng)，與3株陽(yáng)性對(duì)照的圖譜一致，說(shuō)明菌株產(chǎn)碳青霉烯酶，為CP-CRE；30株CSE圖譜顯示在(300±0.55)m/z處的亞胺培南特征峰仍存在，且峰強(qiáng)度無(wú)明顯改變，同時(shí)亞胺培南水解產(chǎn)物特征峰(254±0.1)m/z也未出現(xiàn)明顯變化，與陰性對(duì)照菌株的圖譜一致，說(shuō)明菌株不產(chǎn)碳青霉烯酶，為non-CP-CRE或CSE。見圖2。

注：A，不加菌懸液的亞胺培南空白對(duì)照；B，陽(yáng)性對(duì)照菌；C，碳青霉烯酶陰性；D，碳青霉烯酶陽(yáng)性。圖中標(biāo)灰位置為亞胺培南水解產(chǎn)物[C11H17N3O2S，(254±0.1) m/z]對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰和亞胺培南[C12H17N3O4S，(300±0.55) m/z]對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰。

2.4LogRQ值的計(jì)算和cut-off值的設(shè)置 計(jì)算82株試驗(yàn)菌株與亞胺培南共溫育5 min、10 min、20 min和30 min后的logRQ值，繪制散點(diǎn)圖，見圖3。繪制不同溫育時(shí)間logRQ值的ROC曲線，見圖4。觀察圖4可知在溫育30 min時(shí)，曲線下面積(AUC)最大，為1.000(95%CI：1.000～1.000，P<0.001)，相應(yīng)cut-off值為-0.678，此時(shí)檢測(cè)出CP-CRE菌株52株，其logRQ值為0.996±0.184；non-CP-CRE或CSE 30株，其logRQ值為-1.419±0.187；檢測(cè)敏感性和特異性最高，均為100%，見表2。在cut-off值為-0.678時(shí)判斷不同溫育時(shí)間下亞胺培南的水解情況：logRQ值≥-0.678時(shí)亞胺培南已被細(xì)菌水解，logRQ值<-0.678時(shí)亞胺培南未被細(xì)菌水解，見圖3，因此可知菌株與亞胺培南經(jīng)5 min、10 min、20 min和30 min共溫育后，細(xì)菌水解亞胺培南的敏感性分別為32.69%(17/52)、80.77%(42/52)、90.38%(47/52)、100%(52/52)，特異性均為100%。

注：▲，亞胺培南已被細(xì)菌水解；○，亞胺培南未被細(xì)菌水解；logRQ=log(亞胺培南水解產(chǎn)物峰強(qiáng)度/亞胺培南峰強(qiáng)度)。

圖4 利用logRQ值檢測(cè)CP-CRE的受試者工作特征(ROC)曲線

表2 不同孵育時(shí)間logRQ值的受試者工作特征(ROC)曲線統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.5前瞻性研究結(jié)果 使用已建立的基于酶水解法的Vitek MS對(duì)B組菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示46株細(xì)菌中有40株細(xì)菌其logRQ值>-0.678，為CP-CRE；6株細(xì)菌其logRQ值<-0.678，為non-CP-CRE或CSE。與PCR檢測(cè)結(jié)果相比，Kappa系數(shù)為1.0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明2種方式檢測(cè)一致性極強(qiáng)，2種檢測(cè)方式的符合率為100%。見表3。

表3 酶水解法與PCR檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

目前，MALDI-TOF MS技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定，而利用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測(cè)CRE尚在探索階段。2011年，Hrabák等[12]發(fā)現(xiàn)利用MALDI-TOF MS技術(shù)與酶水解法結(jié)合可以有效地檢測(cè)腸桿菌科和銅綠假單胞菌中產(chǎn)生的碳青霉烯酶。自此，MALDI-TOF MS與酶水解法聯(lián)合檢測(cè)碳青霉烯酶的相關(guān)研究不斷增多。目前該類研究主要集中在布魯克公司的Microflex LT質(zhì)譜儀[7,9]等，應(yīng)用梅里埃Vitek質(zhì)譜儀的研究較少[13]，國(guó)內(nèi)更是罕見。而本研究將Vitek質(zhì)譜儀與酶水解法結(jié)合，檢測(cè)碳青霉烯酶。

相關(guān)研究表明亞胺培南特征峰為(300±0.55) m/z，且亞胺培南水解產(chǎn)物只有1個(gè)特征峰(254±0.1) m/z[10]。因此，本研究通過(guò)對(duì)比純亞胺培南的質(zhì)譜圖和細(xì)菌與亞胺培南共溫育5 min、10 min、20 min、30 min后獲得的質(zhì)譜圖，建立logRQ值對(duì)亞胺培南和其水解產(chǎn)物的特征峰強(qiáng)度變化進(jìn)行量化，并得出當(dāng)細(xì)菌與亞胺培南共溫育30 min后，logRQ值≥-0.678時(shí)待測(cè)菌產(chǎn)碳青霉烯酶，此方法的敏感性和特異性均為100%。經(jīng)前瞻性研究表明，本研究結(jié)果與PCR結(jié)果符合率100%。相比PCR技術(shù)，本研究的檢測(cè)方法成本更低也更加快速(總流程約45 min)，而且可檢測(cè)出少見的碳青霉烯酶類型。

目前酶水解法檢測(cè)碳青霉烯酶常見的溫育時(shí)間為1～2.5 h[14-15]。本研究亞胺培南與細(xì)菌共溫育20 min時(shí)有47株細(xì)菌的logRQ值≥-0.678，僅5株需延長(zhǎng)溫育時(shí)間到30 min，當(dāng)溫育30 min時(shí)Vitek MS檢測(cè)CP-CRE的敏感性與特異性均達(dá)100%。本方法不僅縮短了溫育時(shí)間，而且改進(jìn)了細(xì)菌的取樣方式。相比Lasserre等[10]和謝小芳等[15]取1 μL接種環(huán)菌落或用接種針直接挑取菌落的取樣方式，本研究選擇0.5 McFarland菌懸液使標(biāo)本的選取更加標(biāo)準(zhǔn)化。此外，相比馮麗娜等[11]、Knox等[16]用“肉眼觀察亞胺培南特征峰的完全消失”來(lái)主觀判斷菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶，計(jì)算logRQ值以定量的形式分析特征峰強(qiáng)度的變化，使結(jié)果的判讀更客觀?！八幬锾卣鞣逑宜幬锼猱a(chǎn)物峰出現(xiàn)”表示發(fā)生水解反應(yīng)，即細(xì)菌產(chǎn)生能水解藥物的酶。本試驗(yàn)與Knox等[16]的研究結(jié)果顯示：細(xì)菌與亞胺培南共溫育后亞胺培南特征峰[(300±0.55) m/z]消失，未出現(xiàn)亞胺培南水解產(chǎn)物特征峰[(254±0.1) m/z]的顯著增加。但Kempf等[17]可以觀察到亞胺培南水解脫羧產(chǎn)物特征峰的增加?？赡茉蚴蔷彌_液成分和pH的不同，導(dǎo)致亞胺培南脫羧產(chǎn)物(C11H17N3O2S)分子基團(tuán)穩(wěn)定性出現(xiàn)差異，脫羧產(chǎn)物與鈉離子結(jié)合的穩(wěn)定性亦出現(xiàn)差異。不過(guò)，因?yàn)楸狙芯縧ogRQ值的設(shè)定，所以即使有亞胺培南水解產(chǎn)物峰增加，也不影響本研究方法中Vitek MS檢測(cè)CP-CRE的可行性。因?yàn)樗猱a(chǎn)物峰增大，logRQ值也相應(yīng)增大，logRQ值≥-0.678的趨勢(shì)不會(huì)改變，所以并不影響結(jié)果判斷。

本研究的不足之處在于，檢測(cè)CRE時(shí)該方法僅能檢測(cè)碳青霉烯酶活性，而不能檢測(cè)其他機(jī)制所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥，容易使CRE中占比例較少的non-CP-CRE誤判為CSE。另外，菌株選擇時(shí)未涵蓋例如枸櫞酸桿菌、沙雷菌屬等常見腸桿菌目細(xì)菌。此外，Microflex LT質(zhì)譜儀可自動(dòng)計(jì)算logRQ值[7]，而本試驗(yàn)所用Vitek MS尚需其他輔助軟件。在本研究中發(fā)現(xiàn)blaKPC陽(yáng)性的菌株可更快地(10 min)水解亞胺培南，而blaNDM陽(yáng)性菌株最多需30 min才能水解亞胺培南，猜測(cè)酶水解法的溫育時(shí)間與酶的基因型和細(xì)菌種屬可能有關(guān)。但由于樣本較少，不能準(zhǔn)確判斷酶型和細(xì)菌種屬對(duì)水解時(shí)間的影響。后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大菌種范圍，增加樣本量，研究水解時(shí)間與酶型、細(xì)菌種屬的關(guān)系。

MALDI-TOF MS聯(lián)合酶水解法快速檢測(cè)CP-CRE應(yīng)用前景廣泛，本研究進(jìn)一步深入探索使其操作和結(jié)果判斷更加標(biāo)準(zhǔn)化，體現(xiàn)該方法檢測(cè)碳青霉烯酶快速、準(zhǔn)確的潛力?；诿杆夥ǖ腣itek MS有助于醫(yī)生精準(zhǔn)用藥，也有助于防止CRE的流行和傳播。