杜昊忱，劉 侃，袁曉梅，張 微，關永霞，張貴民

（1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006）

脈絡舒通丸主要由黃芪、金銀花、黃柏、蒼術、薏苡仁、玄參、當歸、白芍、甘草、水蛭、蜈蚣、全蝎12味藥材組方，有清熱解毒、化瘀通絡、祛濕消腫功效，用于治療濕熱瘀阻脈絡所致血栓性淺靜脈炎，以及非急性期深靜脈血栓形成所致下肢腫脹、疼痛、膚色暗紅或伴有條索狀物［1］。臨床研究表明，脈絡疏通丸治療血小板減少癥、急性下肢靜脈血栓、濕熱壅滯型混合痔術后水腫等有顯著療效［2-5］。水蒸氣蒸餾法是中藥揮發(fā)油提取的常用方法，簡單易操作，可避免有機溶劑污染，綠色環(huán)保，適合工業(yè)化大生產［6-8］?？刂茡]發(fā)油的質量（穩(wěn)定均一）是其發(fā)揮療效的關鍵［9］。揮發(fā)油出油率不僅受藥材飲片外觀性狀、成分種類及主要成分含量影響，更受液料比、浸泡時間、提取時間等提取工藝因素影響［10-12］。故本研究中采用水蒸氣蒸餾法提取藥材中當歸、白芍、玄參、金銀花、蒼術5味揮發(fā)性成分，采用正交試驗法優(yōu)選其最佳提取工藝，并采用氣相色譜串聯(lián)質譜（GC-MS）法對揮發(fā)油進行化學成分分析和鑒定，為中藥揮發(fā)油的開發(fā)及其質量標準的建立提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo TRACE 1310-IQS型氣相色譜質譜儀（賽默飛世爾科技公司）；XS204型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Agilent-G9-UV型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；JY-15型超聲波清洗機（鼎泰生化科技設備制造有限公司）。

1.2 試藥

白芍藥材（安徽人民中藥飲片有限公司，批號為190601），蒼術藥材（安國市宇通藥材有限公司，批號為190626），當歸藥材（山東民瑞中藥飲片有限公司，批號為5191003），玄參藥材（隴西千金藥材有限公司，批號為W006-1908059），金銀花藥材（山東民瑞中藥飲片有限公司，批號為5190810），均經中藥制藥共性技術國家重點試驗室范建偉高級工程師鑒定為正品；綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753-201716，含量為96.8%）；高效液相色譜用試劑均為色譜純，分析用試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 揮發(fā)油測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Thermo HP-5 MS石英毛細管色譜柱（30.0 m×0.25 mm，1.0μm）；程序升溫：初始溫度為60℃并保持3 min，以4℃/min的速率升至200℃并保持5 min，以10℃/min的速率升至280℃；進樣口溫度：280℃；分流比：20∶1；進樣量：0.5μL；載氣：氦氣（≥99.999%）；流速：1.0 mL/min。

2.1.2 質譜條件

電子轟擊（EI）離子源，電子能源70 eV，傳輸線溫度為280℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃；全掃描檢測方式，掃描范圍為40～650 amu。

2.1.3 檢測方法

按脈絡舒通丸0.4倍處方量稱取蒼術、當歸、白芍各166.8 g，玄參、金銀花各333.2 g，置圓底燒瓶中，加水適量，浸泡，連接揮發(fā)油測定器與回流冷凝管，置電熱套中加熱至沸騰，并保持微沸，收集揮發(fā)油，測定揮發(fā)油提取量，并對揮發(fā)油氣相色譜-質譜圖中15種主要成分（相對含量＞0.7%）進行鑒別。結果見圖1和表1。

表1 脈絡疏通丸揮發(fā)油化學成分氣相色譜-質譜分析結果Tab.1 Analysis results of chemical components of volatile oil in Mailuo Shutong Pills by GS-MS

圖1 脈絡疏通丸揮發(fā)油氣相色譜-質譜圖Fig.1 GS-MS chrotograms of volatile oil in Mailuo Shutong Pills

2.2 綠原酸提取率

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取綠原酸對照品25 mg，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇制成質量濃度為250μg/mL的溶液，即得對照品貯備液；精密吸取10 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，即得對照品溶液。取2.1.3項下提取揮發(fā)油殘液1 mL，置50 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，密塞，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，加50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別取2.2.2項下對照品溶液、供試品溶液各10μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數按綠原酸峰計不低于15 000，分離度均大于2。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Chlorogenic acid A.Reference solution B.Test solutionFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：精密移取2.2.2項下對照品貯備液0，1.00，2.50，5.00，7.50，10.00 mL，分別置25 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，即得質量濃度為0，10.00，25.00，50.00，75.00，100.0μg/mL的系列標準溶液。按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱坐標、綠原酸質量濃度（C，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=16.778 52C+8.329 96（r=0.999 9，n=6）。結果表明，綠原酸質量濃度在0～100.00μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

檢測限和定量限確定：精密吸取對照品溶液適量，分別以稀釋至信噪比（S/N）為1∶3和1∶10時的質量濃度為檢測限和定量限，結果兩者分別為0.035 59μg/mL和0.118 6μg/mL。

精密度試驗：取同一對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果的R SD為3.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，室溫下分別于0，2，4，6，12，24，48 h時按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的R S D為2.85%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一供試品溶液6份，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的R SD為3.22%（n=6），表明方法的重復性良好。

加樣回收試驗：分別取已知綠原酸含量的提取液6份，分別按低、中、高濃度比例加入綠原酸對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 測定方法

量取揮發(fā)油提取殘液，測定綠原酸含量，計算綠原酸提取率。綠原酸提取率（%）=［提取殘液中綠原酸含量（mg/mL）×提取殘液體積（mL）］/［藥材中綠原酸含量（mg/g）×藥材質量（g）］×100%。

2.3 正交試驗優(yōu)化

2.3.1 試驗設計

參考2020年版《中國藥典（一部）》中脈絡疏通丸項下方法，分別以浸泡時間（因素A）、加水量（因素B）、提取時間（因素C）為考察因素，以揮發(fā)油提取量、綠原酸提取率為考察指標，采用L9（34）正交試驗法優(yōu)選當歸、白芍、玄參、金銀花、蒼術5味藥材的揮發(fā)油提取工藝。因素水平見表3。

表3 因素水平表Tab.3 The factor levels

2.3.2 試驗結果

正交試驗結果見表4，方差分析結果見表5和表6。由表4和表5可見，因素A、因素B、因素C對揮發(fā)油的提取量均無顯著影響（P＞0.05），各因素對揮發(fā)油提取的影響強度為C＞B＞A，最佳工藝條件為A1（或A2或A3）B3C3。由表4和表6可見，因素A、因素B、因素C對綠原酸提取率均無顯著影響（P＞0.05），各因素對綠原酸提取率的影響強度為B＞A＞C，最佳工藝條件為A1B3C1。綜合考慮，最佳提取工藝為A1B3C2，即不浸泡，加10倍量水，提取6 h。

表4 L9（34）正交試驗結果（n=9）Tab.4 Results of the L9（34）orthogonal test（n=9）

表5 揮發(fā)油方差分析結果Tab.5 ANOVA results of volatile oil

表6 綠原酸提取率方差分析結果Tab.6 ANOVA results of the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.3 驗證試驗

按正交試驗所得最佳提取工藝，重復提取揮發(fā)油3次，測量揮發(fā)油提取量，計算綠原酸提取率。結果見表7。可見，在最佳提取工藝條件下，揮發(fā)油提取量及綠原酸提取率均穩(wěn)定，表明優(yōu)選的提取工藝可靠。

表7 提取工藝驗證試驗（n=3）Tab.7 Validation test of the extraction process（n=3）

3 討論

揮發(fā)油是許多中藥材的有效成分，除有解熱、抗菌、抗炎等功效外，還可改善心血管功能、提高機體免疫力、調血脂等［13］。目前，艷山姜、高良姜、當歸、川芎、肉桂等中藥揮發(fā)油治療心血管系統(tǒng)疾病受到了廣泛關注［14］。目前揮發(fā)油的提取方法有蒸餾法、浸泡法、壓榨法、溶劑法等傳統(tǒng)方法，以及微波提取、超聲提取等新技術［15-16］。在微波、超聲波、微波-超聲波和常規(guī)加氫蒸餾法提取非洲三葉草揮發(fā)油、茉莉的技術中，微波超聲法提取率最高［17-18］。實際生產中，水蒸氣蒸餾法因簡單、易操作、綠色環(huán)保而成為大生產中揮發(fā)油提取最常用方法，但所得揮發(fā)油成分往往較復雜［19］?；厝鹑A等［20］采用水蒸氣蒸餾法提取6 h后，川椒組分數和提取率下降，說明提取時間對揮發(fā)油提取效果有較大影響。

中藥揮發(fā)油提取工藝是中藥提取的重要步驟，對藥物的療效起關鍵作用。以往的研究中，多數僅關注揮發(fā)油提取率，而忽略了殘液中的有效成分［21］。本研究中選用多指標綜合評價揮發(fā)油提取工藝，并采用正交試驗法優(yōu)選出最佳提取工藝，可為大生產工藝優(yōu)化提供參考。通過GC-MS法對提取的脈絡疏通丸揮發(fā)油進行分析，鑒定出其中15種化合物，占揮發(fā)油總量的76.96%。揮發(fā)油中多數成分為單萜、倍半萜等萜類化合物，含量最高的為Z-藁本內酯，其次為蒼術素（8.28%）和α-蒎烯（7.94%）。含量在1%以上的化合物有10種，查閱文獻［22-24］，發(fā)現(xiàn)萜類化合物主要來源于當歸和蒼術。當歸揮發(fā)油成分中Z-藁本內酯含量最高，其次為α-蒎烯、β-羅勒烯，蒼術揮發(fā)油成分中蒼術素含量最高，其次為蒼術酮、α-水芹烯。其中，5-戊基環(huán)己-1，3-二烯是單味藥材提取所得揮發(fā)油中未出現(xiàn)的成分，其可能是在長時間提取過程中，揮發(fā)性成分發(fā)生了合成、氧化或熱分解等化學反應而形成的，該化合物形成過程和藥理作用還需進一步研究。

綜上所述，優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、效率高，可為工業(yè)化大生產的改良及后續(xù)開發(fā)研究提供參考。