王 森，師俊華，王之盛，胡 瑞，王俊梅，薛 白，彭全輝

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所 動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

牦牛是我國青藏高原及毗鄰地區(qū)農(nóng)牧民重要的生產(chǎn)生活物資，也是我國重要的特色遺傳資源[1]。牦牛作為藏區(qū)重要的養(yǎng)殖畜種之一，為當?shù)厝嗣裉峁┝素S富的肉、乳、毛等重要生活物資。牦牛肉風味獨特，與普通肉牛相比，具有低脂肪、高蛋白、富含多種重要的維生素和礦物質(zhì)等優(yōu)勢[2]，但由于營養(yǎng)條件和品種原因，其生長速度緩慢且脂肪沉積效率低下，造成了牦牛肉嫩度較差，口感粗糙[3]，這也就限制了牦牛肉產(chǎn)品經(jīng)濟效益的提高。牦牛肉中肌內(nèi)脂肪(IMF)含量是影響牦牛肉產(chǎn)品口感的重要因素[4-6]，并且與皮下脂肪(SF)相比，肌內(nèi)脂肪能提供共軛亞油酸和單不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，對降低心血管疾病發(fā)病率、抗動脈粥樣硬化具有一定的益處[7]。因此，研究如何提高牦牛肉中的IMF含量，降低SF含量對提高牦牛肉口感和經(jīng)濟效益具有重要的意義。

動物體內(nèi)脂肪組織的生長主要通過脂肪細胞的肥大和增殖[8]，但成熟的脂肪細胞是有絲分裂之后形成，并不具有分裂能力，因此成熟脂肪細胞的數(shù)量在很大程度上取決于前體脂肪細胞的增殖分化[9]。前體脂肪細胞成熟的過程大概分為兩個階段：第一階段是前體脂肪細胞的增殖；第二階段是前體脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞，即永久性細胞周期停滯的前體脂肪細胞，細胞形態(tài)變?yōu)榍蛐?，攝取營養(yǎng)使其填充為成熟脂肪細胞[10]。體外成熟皮下和肌內(nèi)脂肪細胞來源于皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞的分化，而前體脂肪細胞的分化主要由分化關(guān)鍵因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)和CCAAT 增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)等調(diào)控[11]。脂肪組織的特征和功能存在區(qū)域差異，是由于發(fā)育過程中形成的前體脂肪細胞來源差異造成[12]，這也說明不同部位來源的前體脂肪細胞在分化過程中也可能存在差異。

皮下和肌內(nèi)脂肪細胞的體外模型建立多見于鼠、豬、肉牛、羊等動物，牦牛脂肪沉積率低，因此皮下脂肪模型的建立具有一定的難度，而牦牛肌內(nèi)脂肪細胞體外模型的建立更鮮有報道。因此，本試驗通過優(yōu)化傳統(tǒng)酶消化法消化成年牦牛的皮下脂肪組織以及背最長肌，建立牦牛體外皮下和肌內(nèi)脂肪細胞模型，并進一步檢測兩部位前體脂肪細胞的增殖能力和分化過程中成脂關(guān)鍵基因的表達，對研究牦牛皮下和肌內(nèi)脂肪的形成、特異性育肥以及改善牦牛肉質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試驗試劑

DMEM-F12高糖培養(yǎng)基、無菌PBS購自上海培源生物有限公司；胎牛血清、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、羅格列酮(ROG)購自Sigma公司；青/鏈霉素(雙抗)、地塞米松(DEX)、胰島素、I型和II型膠原酶購自索萊寶公司；油紅O染色試劑盒購自博奧森公司；RNA提取試劑盒購自美基生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄和定量試劑盒購自艾科瑞公司。

1.2 樣品采集及處理

在都江堰輝潤屠宰場采取5頭18～22月齡健康麥洼公牦牛的腹部皮下脂肪組織和背最長肌組織，使用無菌PBS沖洗至表面無血污后，放置到含有5%三抗PBS的無菌袋中帶回無菌細胞房。

1.3 牦牛皮下前體脂肪細胞分離培養(yǎng)

將皮下脂肪組織使用含10%三抗的PBS浸泡3遍，再用含2%三抗的PBS沖洗至干凈，用剪刀剔除血管、筋膜，隨后用剪刀剪成1～3 mm3的組織顆粒，并與I型膠原酶(2 mg·mL-1)混合，37 ℃恒溫氣浴消化40～60 min，消化后的糜狀物用40 μm的細胞篩進行過濾，收集濾液并及時終止消化。將得到的濾液以1 200 r·min-1離心10 min，棄去上清液，得到細胞團，使用紅細胞裂解液重懸細胞，并以相同條件離心；將得到的細胞團用預熱PBS重懸后，再800 r·min-1離心3 min，棄上清并重復上述清洗過程2次，最后將細胞用完全培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)基、2%雙抗、10%胎牛血清)重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至傳代或凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛肌內(nèi)前體脂肪細胞分離培養(yǎng)

將背最長肌組織使用含10%三抗的PBS交替清洗3次，用剪刀剔除肌肉和筋膜，隨后用剪刀剪成1～3 mm3的組織顆粒，與 II型膠原酶(1 mg·mL-1)混合，之后37 ℃恒溫氣浴消化40～60 min，消化后的糜狀物用40 μm的無菌細胞篩進行過濾，收集濾液并及時終止消化。將得到的濾液以1 200 r·min-1離心10 min，棄去上清液，得到細胞團, 使用紅細胞裂解液重懸細胞，并以相同條件離心；將得到的細胞團用預熱PBS重懸后，再800 r·min-1離心5 min，棄上清并重復上述清洗過程2次，最后將細胞用完全培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，通過差速貼壁法純化2 h，隨后在37 ℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至傳代或凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 前體脂肪細胞標記物PREF-1免疫熒光鑒定

將皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞分別接種在6孔培養(yǎng)板中，當細胞匯合達到70%時，棄去培養(yǎng)基，使用PBS輕柔洗滌細胞，每孔加入1.5 mL 4%的多聚甲醛，將細胞固定30 min，PBS洗滌；用濃度為0.5%的Triton X-100使細胞通透60 min，棄去液體，PBS洗滌，使用濃度為5%的山羊血清封閉60 min；棄去封閉溶液，并加入稀釋的兔PREF-1抗體，4 ℃孵育過夜，棄去一抗，加入稀釋的抗兔FITC熒光二抗，37 ℃孵育80 min，棄去二抗后用PBS洗3次，每次3 min。后滴加DAPI避光孵育5 min，用PBS洗4次去除多余的DAPI，每次5 min。最后加入適量PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 前體脂肪細胞增殖能力檢測

將皮下與肌內(nèi)前體脂肪細胞分別接種于96孔板，每孔細胞接種量為6×103個。使用CCK-8法檢測牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞增殖速度差異。每孔加入10%的CCK-8試劑，在37 ℃下孵育2 h，在450 nm波長下讀取OD值。

1.7 不同部位前體脂肪細胞誘導分化

皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞生長融合至90%，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后將完全培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基(添加2%雙抗、1% 注射用卵磷脂、10 μg·mL-1牛胰島素、0.5 mmol·L-1DEX、0.5 mmol·L-1IBMX、1 mmol·L-1ROG)。分化3 d后更換維持培養(yǎng)基(添加2%雙抗、10 μg·mL-1牛胰島素)維持細胞6 d。換分化培養(yǎng)基第1天記為第0天。

1.8 油紅O染色

皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞分化出明顯脂滴后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS輕柔清洗以完全去除培養(yǎng)基成分，每孔加入1.5 mL 10%中性多聚甲醛固定液，室溫固定30 min。隨后用60%異丙醇浸泡細胞，之后棄去異丙醇，每孔加入1.5 mL油紅O工作液，室溫孵育15 min，棄去染色液，用60%異丙醇分色，最后晾干鏡檢。

1.9 RNA提取及成脂分化相關(guān)基因qRT-PCR檢測

使用上述RNA提取試劑盒分別提取牦牛分化第0、3、6、9天的總肌內(nèi)脂肪細胞和皮下脂肪細胞RNA。提取RNA后進行cDNA的合成和實時定量PCR檢測。引物序列見表1，本試驗中，以UXT基因作為參考基因，使用2-△△CT法計算牦牛肌內(nèi)和皮下脂肪細胞成脂分化基因的相對表達量變化。

表1 實時定量PCR引物序列

1.10 數(shù)據(jù)分析

試驗均設置3個重復組，所有數(shù)據(jù)使用 SPASS 軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并通過LSD法進行多重比較，若P<0.05表示差異顯著，說明具有統(tǒng)計學意義，作圖則使用GraphPad Prism 6.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛肌內(nèi)前體脂肪細胞和皮下前體脂肪細胞形態(tài)學觀察

對牦牛背最長肌和皮下脂肪組織進行酶消化處理，分離出的肌內(nèi)前體脂肪細胞和皮下前體脂肪細胞如圖1所示，二者大部分均在原代培養(yǎng)第1天呈現(xiàn)橢圓狀，隨著培養(yǎng)時間的增加，橢圓狀細胞逐漸變?yōu)殚L梭狀，符合前體脂肪細胞形態(tài)。兩個部位前體脂肪細胞均能在第4～5天完成融合。

IMF.肌內(nèi)脂肪細胞；SC.皮下脂肪細胞

2.2 牦牛前體脂肪細胞免疫熒光鑒定

將皮下前體脂肪細胞和肌內(nèi)前體脂肪細胞接種于6孔板內(nèi)，待兩部位細胞生長至70%，對二者細胞PREF-1蛋白的表達進行免疫熒光檢測，鑒定結(jié)果如圖2所示，可以看出皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞TIFC檢測呈陽性，且熒光形態(tài)與長梭形符合，這表明，PREF-1蛋白表達為陽性，PREF-1蛋白作為前體脂肪細胞特異性表達蛋白可以用來鑒定細胞樣本是否為前體脂肪細胞，因此可以看出，本試驗分離出來的細胞均為前體脂肪細胞，且根據(jù)MERGE組合圖可以看出，兩部位分離出的前體脂肪細胞形態(tài)良好，且細胞核顯影與細胞顯影重合度高。

圖2 免疫熒光鑒定(200×)

2.3 牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞生長曲線的繪制

使用CCK-8法測定牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞的生長曲線，從圖3可以看出，牦牛肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞生長曲線均呈現(xiàn)經(jīng)典的“S”型，兩部位細胞均在3 d內(nèi)處于潛伏期，在生長第4天達到對數(shù)生長期，在第6天達到平臺期，符合細胞的生長規(guī)律。并且從兩部位OD值差異對比發(fā)現(xiàn)牦牛皮下前體脂肪細胞在第4天OD值顯著高于肌內(nèi)前體脂肪細胞(P<0.05)，這說明牦牛皮下前體脂肪細胞生長速度在第4天高于肌內(nèi)前體脂肪細胞。

*表示差異顯著(P<0.05)

2.4 牦牛成熟肌內(nèi)脂肪細胞和皮下脂肪細胞形態(tài)學觀察

牦牛肌內(nèi)前體脂肪細胞和皮下前體脂肪細胞完全融合2 d后，棄去原有培養(yǎng)基，換成分化培養(yǎng)基進行誘導分化3 d，如圖4所示，分化3 d后，肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞均由梭形收縮變?yōu)閳A球狀，部分細胞開始出現(xiàn)脂滴，但大部分細胞沒有明顯脂滴出現(xiàn)；6 d后，兩部位脂肪細胞內(nèi)均出現(xiàn)明顯密集的明亮小脂滴，此時能夠看到脂肪細胞內(nèi)脂滴并未聚集為大的圓形脂滴，脂肪細胞尚未成熟；分化9 d后，細胞內(nèi)出現(xiàn)明亮的大圓形脂滴，標志兩部位脂肪細胞均分化成熟。

圖4 前體脂肪細胞分化形態(tài)(400×)

2.5 牦牛肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞分化階段油紅O試驗

對處于分化第3、6、9天3個時間段的牦牛肌內(nèi)和皮下脂肪細胞進行油紅O染色，染色結(jié)果如圖5所示，可以看出，肌內(nèi)和皮下脂肪細胞分化至第3天染色結(jié)果不明顯，說明此階段肌內(nèi)和皮下脂肪細胞脂質(zhì)合成量可能并不高，分化至第6天二者均出現(xiàn)明顯的脂滴，說明分化第6～9天，兩部位的脂肪細胞均出現(xiàn)了大量脂滴。

2.6 牦牛肌內(nèi)和皮下前體脂肪細胞分化階段關(guān)鍵基因表達規(guī)律檢測

成熟脂肪細胞是由前體脂肪細胞分化而來，前體脂肪細胞的分化過程受多種關(guān)鍵因子的調(diào)控。本試驗檢測了脂肪細胞分化關(guān)鍵基因PPARγ、C/EBPα，脂肪合成關(guān)鍵基因脂肪酸合成酶(FASN)、脂肪分解關(guān)鍵基因激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)。從圖6可以看出，以上基因表達水平都隨著前體脂肪細胞分化的進行而發(fā)生變化。SC和IMF的PPARγ基因的相對表達量基本都出現(xiàn)隨時間增加而增加的趨勢，無論是SC還是IMF脂肪細胞在第9天PPARγ表達量顯著高于分化第0、3、6天(P<0.05)。SC和IMF的C/EBPα基因相對表達量均在分化第6天達到峰值，二者C/EBPα基因表達量在第6天顯著高于第0、3、9天(P<0.05)。HSL基因相對表達量也隨分化時間的增加而增加，兩部位HSL基因表達量在分化第9天顯著高于第0、3、6天(P<0.05)，IMF脂肪細胞HSL基因表達量在第3天顯著高于0天(P<0.05)，SC脂肪細胞HSL基因表達量在分化第6天顯著高于0天(P<0.05),第0和3天的表達量差異并不顯著(P>0.05)。FASN基因相對表達量也隨分化時間的增加而增加，兩部位FASN基因表達量在分化第9天顯著高于第0、3、6天(P<0.05)，IMF脂肪細胞FASN基因表達量在第3天顯著高于第0天，SC脂肪細胞FASN基因表達量在分化第6天顯著高于第0天(P<0.05),第0和3天的表達量差異并不顯著(P>0.05)。

3 討 論

脂肪含量是影響肉產(chǎn)品口感、風味和銷量的關(guān)鍵因素[13]，但不同部位脂肪沉積具有不同的效應。皮下脂肪的過度沉積不僅嚴重影響牛肉產(chǎn)品的口感。牛肌內(nèi)脂肪單不飽和脂肪酸、共軛亞油酸以及必須氨基酸含量豐富十分有利于消費者健康[14-15]，并且肌內(nèi)脂肪含量對牛肉品質(zhì)也有明顯的提升[16]。因此建立體外皮下和肌內(nèi)脂肪細胞模型，探究皮下和肌內(nèi)脂肪細胞分化和增殖差異，對牦牛不同部位脂肪特異性沉積具有重要的意義。

本試驗借鑒了張萌萌等[17]和樸政玉等[18]分離松遼黑豬和肉牛前體脂肪細胞的方法，熊靜等[19]發(fā)現(xiàn)，離心力過低會造成細胞收獲量減少，而離心力過高會造成細胞活力下降，蔣斌等[20]試驗表明，離心力過高、時間長和次數(shù)多會造成細胞活力下降，因此本試驗改進了離心步驟，減少了離心力對牦牛前體脂肪細胞的傷害以及通過差速貼壁法純化了牦牛肌內(nèi)前體脂肪細胞，最終成功分離了牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞，通過CCK-8活性檢測，兩部位前體脂肪細胞生長曲線均呈現(xiàn)經(jīng)典“S”型，與多數(shù)試驗報道的前體脂肪細胞生長曲線相似[21-24]。通過對前體脂肪細胞特異性蛋白(PREF-1)進行檢測，免疫熒光結(jié)果表明，本試驗分離的皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞形態(tài)符合長梭形，蛋白表達于細胞膜附近，此結(jié)果與Park和Kim[25]試驗中PREF-1熒光定位相似，并且DAPI和FITC熒光組合圖表明，本試驗分離的皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞純度很高，說明本試驗牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞模型建立成功。

傳統(tǒng)前體脂肪細胞分化方法有油酸誘導法以及經(jīng)典的雞尾酒法[26]，但油酸誘導法多用于家禽的前體脂肪細胞分化[27-28]，而經(jīng)典雞尾酒法又存在分化效率低、成脂量低的缺點[29]，因此本試驗通過改良經(jīng)典雞尾酒法，向分化培養(yǎng)基中添加卵磷脂注射劑，之后對上述兩部位前體脂肪細胞進行誘導分化，分化結(jié)果表明，換成分化培養(yǎng)基后至出現(xiàn)大脂滴，分化成熟經(jīng)過9 d，分化效率高，且脂滴數(shù)量可觀，并且油紅O染色結(jié)果表明，牦牛皮下和肌內(nèi)成熟脂肪細胞分化成功。綜上所述，牦牛皮下和肌內(nèi)成熟脂肪細胞模型建立成功。

PPARγ和C/EBPα是動物脂肪組織生成的主要調(diào)節(jié)因子，并且都在脂肪組織中高表達[30]，二者均可調(diào)節(jié)許多脂質(zhì)合成基因的表達[31]，其中C/EBPα可以誘導脂肪生成并上調(diào)PPARγ表達[32]，而PPARγ是脂肪細胞分化的主要關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過調(diào)節(jié)乙酰輔酶A羧化酶活性促進甘油三酯的形成，最終影響脂肪的沉積[33]，在本試驗中，牦牛SC和IMF脂肪細胞中PPARγ出現(xiàn)相同的上升趨勢，而C/EBPα在6 d后表達量發(fā)生下降。試驗表明，脂肪細胞的PPARγ、C/EBPα的表達量會隨著分化時間的增加出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，與本試驗中SC和IMF脂肪細胞C/EBPα表達量趨勢相似，但本試驗中兩部位脂肪細胞在9 d的分化期內(nèi)PPARγ表達均未見下降，Wang等[34]對豬脂肪細胞分化檢測發(fā)現(xiàn)其PPARγ、C/EBPα的表達在3～4 d內(nèi)回落，而Tokach等[35]試驗表明，肉牛脂肪細胞在分化7 d后其PPARγ表達量也未出現(xiàn)回落，與本試驗結(jié)果相似，而與Wang等[34]在豬細胞上的試驗結(jié)果不符，這可能是因為不同物種脂肪細胞PPARγ的表達規(guī)律存在差異。PPARγ的上調(diào)可以促進SREBP1的表達，Ikeda等[36]試驗表明，SREBP1能夠促進FASN的表達，F(xiàn)ASN是生物體脂質(zhì)生物合成的主要限速酶，張濤[37]試驗發(fā)現(xiàn)，綿羊脂肪沉積與FASN的表達量成正比，Liang等[38]使用葡萄皮提取物和白藜蘆醇抑制FASN可減少脂肪堆積，因此可見FASN在生物體內(nèi)脂肪沉積過程中發(fā)揮著重要的作用。在本試驗中，SC和IMF脂肪細胞PPARγ的表達量趨勢與FASN表達量上升趨勢相同，與Ikeda等[36]的結(jié)果相似，F(xiàn)ASN表達量的上升與脂肪細胞分化成脂的過程相符。HSL是脂肪動員最初的限速酶和關(guān)鍵酶，其作用是將甘油三酯分解為甘油和游離脂肪酸，進而防止體內(nèi)脂肪的沉積，在脂肪分解中具有重要的調(diào)節(jié)作用[39]。劉作華[40]研究發(fā)現(xiàn)，在不同脂肪細胞中HSL表達量會隨著葡萄糖濃度的增加而增加，本試驗中，IMF和SC脂肪細胞在9 d分化期內(nèi)，HSL均呈現(xiàn)上升趨勢，這可能與兩部位前體脂肪細胞分化過程中使用高糖培養(yǎng)基且更換頻繁有關(guān)。值得一提的是，在本試驗中IMF脂肪細胞HSL和FASN的表達量在第3天升高，而SC脂肪細胞卻在第6天升高,這似乎說明牦牛IMF脂肪細胞在體外分化時，脂質(zhì)代謝啟動的速率可能高于SC脂肪細胞。

4 結(jié) 論

本試驗通過改良傳統(tǒng)膠原酶消化法和雞尾酒誘導分化法，成功分離牦牛原代皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞，并且成功誘導牦牛皮下和肌內(nèi)前體脂肪細胞成脂成化。本試驗中，成脂分化關(guān)鍵基因PPARγ、HSL、FASN表達量在9 d分化期內(nèi)均呈現(xiàn)上升趨勢，C/EBPα表達量在分化第6 d后顯著下降。本試驗成功分離了牦牛原代皮下和肌內(nèi)脂肪細胞，改進了誘導分化方法，并初步檢測了前體脂肪細胞分化關(guān)鍵基因的表達規(guī)律，為進一步探究牦牛皮下和肌內(nèi)脂肪細胞的脂質(zhì)代謝以及不同脂肪組織差異提供了良好的模型。