毛林軍，陳 瑩，雷 熙，彭新榮，齊·阿拉達(dá)爾*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011；3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000)

Oct4是迄今人們發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新的關(guān)鍵基因，這種功能遺傳于早期脊椎動(dòng)物Oct4基因的同系物，并在不同種系之間高度保守[1]。Oct4最初在卵母細(xì)胞、早期胚胎和胚胎癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。由于胚胎癌細(xì)胞與來(lái)自胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)的胚胎干細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，被廣泛用作研究胚胎發(fā)育的模型[2]。Oct4主要在受精卵、桑椹胚、卵裂球、囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及著床后胚胎的上胚層和原始生殖細(xì)胞等多能性細(xì)胞中表達(dá)[3]。例如在小鼠中，將Oct4基因敲除，該胚囊正常植入后不能形成多能性的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，因此，不能正常著床而停滯發(fā)育，在著床前期囊胚階段(胚胎發(fā)育3.5～4.5 d)死亡。表明Oct4基因在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中形成多能性細(xì)胞是必要的[4]。在多個(gè)動(dòng)物物種上關(guān)于Oct4基因的文章已報(bào)道過(guò)多篇，而在綿羊上的報(bào)道很少。在牛胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophectoderm，TE)中檢測(cè)到Oct4 mRNA[5-6]，而在小鼠上，Oct4僅在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)上表達(dá)[7]。與小鼠的高繁殖力相比，反芻動(dòng)物如牛羊的繁殖力一直比較低，在牛羊中，大約45%的囊胚會(huì)在胚胎附植和妊娠識(shí)別過(guò)程中丟失[8]。在牛羊胚胎進(jìn)入子宮后，會(huì)經(jīng)歷囊胚擴(kuò)張、孵化、遷移、伸長(zhǎng)、附植，侵潤(rùn)和胎盤(pán)形成等幾個(gè)主要過(guò)程。牛羊等反芻動(dòng)物的囊胚在附植前需要在子宮充分的伸長(zhǎng)[9],這與小鼠有明顯的不同。在小鼠上，對(duì)囊胚發(fā)育的多能基因調(diào)控一直是研究熱點(diǎn)。其中，多能轉(zhuǎn)錄因子Oct4(Pou5f1)的表達(dá)逐漸完全限定在囊胚ICM中隨后限定在上胚層細(xì)胞(epiblast)中表達(dá)[10-11]。內(nèi)細(xì)胞在胚胎植入過(guò)程中分化為上胚層(epiblast，EPI)和下胚層(hypoblas，也稱(chēng)原始內(nèi)胚層，即primitive endoderm，PrE)[12]。Cdx2基因(caudal related homeobox 2 transcription factor，Cdx2)則完全在囊胚分化的滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)[13]，Oct4和Cdx2相互負(fù)調(diào)控，Oct4基因抑制Cdx2的表達(dá)，Berg等[6]研究表明，在牛TE上存在Oct4和Cdx2的共表達(dá)，牛受精卵第6天左右開(kāi)始發(fā)育為囊胚，并進(jìn)入子宮角，牛囊胚TE細(xì)胞中檢測(cè)到Oct4 mRNA，并可以維持到第12～13天，直到孕體開(kāi)始延長(zhǎng)的時(shí)候才在TE中逐漸消失[14-15]，而在小鼠上，Oct4僅在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)上表達(dá)[7]。與小鼠胚胎相比，Oct4下調(diào)對(duì)牛胚胎發(fā)育的影響更為嚴(yán)重。不同于小鼠胚胎，Oct4在牛TE中的表達(dá)不會(huì)消失，即使在完全擴(kuò)張的囊胚階段也是如此[16]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

從烏魯木齊市屠宰場(chǎng)采集阿勒泰綿羊卵巢。將采集的新鮮卵巢在37 ℃恒溫條件下3 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)材料

熒光倒置顯微鏡(Olympus)，固定針(Origio)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，體視鏡(Olympus)，NUNC四孔板培養(yǎng)皿(Becton Dickinson)，35、60 mm培養(yǎng)皿(Becton Dickinson)，玻璃管(BJ-40細(xì)玻管,中國(guó))，15 mL離心管(Corning，USA)，一次性注射器(康福萊醫(yī)療器械有限公司，鄭州，中國(guó))，礦物油(Sigma)，卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液,體外受精液,胚胎培養(yǎng)液。

溶液配方如下：

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液：M199+10% FBS(Gibco)+0.05 IU·mL-1FSH+0.05 IU·mL-1LH+1 μg·mL-1雌二醇+24.2 μg·mL-1丙酮酸鈉+10 ng·mL-1EGF(Gibco)。

體外受精液配方：SOF液+1% NEAA+2% BAA+20% FBS+6 IU·mL-1肝素鈉+100 IU·mL-1慶大霉素。

胚胎培養(yǎng)液配方：SOF液+1% NEAA+2% BAA+100 IU·mL-1雙抗+5 mg·mL-1BSA。

本試驗(yàn)中未注明試劑均購(gòu)自Sigma Aidrich(Saint Louis, USA)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵母細(xì)胞成熟 屠宰場(chǎng)取阿勒泰羊卵巢，用滅菌的生理鹽水洗滌卵巢2～3次后，再抽取直徑為2～8 mm卵泡，用PBS緩沖液稀釋后，在體視顯微鏡下收集形態(tài)正常和結(jié)構(gòu)完整的A、B級(jí)卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞用PBS緩沖液洗3次后，再用卵母細(xì)胞成熟液洗2次，放入預(yù)先平衡好的成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)24 h[4]。培養(yǎng)條件為：38.5 ℃，5% CO2和飽和濕度。

在體視顯微鏡下觀察卵丘細(xì)胞擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)，用0.1%的透明質(zhì)酸酶對(duì)成熟后的卵母細(xì)胞進(jìn)行處理,除去大部分卵丘細(xì)胞,并用受精液洗滌3次后置于裝有0.5 mL受精液的四孔板內(nèi)備用。

1.3.2 卵母細(xì)胞的體外受精 從液氮罐中取薩?？搜虻膬鼍?，40 ℃ 水浴解凍，將解凍后的精液移入3 mL平衡好的獲能液底部，在培養(yǎng)箱中使精子孵育上游30 min，使精子獲能，然后取上清1.5 mL，1 500 r·min1離心5 min，去上清液，底部即為獲能精子，將獲能后的精子用受精液重懸，按照1×105個(gè)·ml-1輕輕加入含有成熟卵母細(xì)胞的四孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中受精24 h[17]。

1.3.3 胚胎培養(yǎng) 體外受精胚胎用胚胎培養(yǎng)液洗3次，然后放入胚胎培養(yǎng)液中，置38.5 ℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，受精48 h后統(tǒng)計(jì)卵裂率，培養(yǎng)168 h后統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.3.4 胚胎免疫熒光染色 胚胎樣品在4%多聚甲醛固定過(guò)夜，PBS洗5 min(3次)，吸去PBS；用5%山羊血清封閉；用含0.2% Triton-100的PBS通透30 min，加入PBS洗5 min(3次)，吸去PBS；加入anti-OCT4一抗(Abcom-19857)或者anti-CDX2(Abcom-227201)一抗，4 ℃ 孵育過(guò)夜，吸去一抗，加入PBS洗5 min(3次)，吸去PBS；加入用Alexa Fluor 488或546(red)標(biāo)記的二抗(Abcom)，室溫孵育60 min，PBS洗3 min(3次)，胚胎細(xì)胞核用DAPI(1 mg·mL-1)染核5 min，加入PBS洗5 min(3次)，吸去PBS，將胚胎用封片劑固定于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察[18]。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊體外囊胚的直徑和細(xì)胞數(shù)

對(duì)體外培養(yǎng)的胚胎進(jìn)行了卵裂率和囊胚率的統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)的阿勒泰羊胚胎卵裂率為79%，卵裂后的胚胎體外培養(yǎng)168 h后，可獲得大量的囊胚，結(jié)果如圖1a和圖1b所示。阿勒泰羊體外胚胎囊胚率為62%。此時(shí)的囊胚包括不同直徑的早期囊胚、擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚(圖1b)。

表1 綿羊卵母細(xì)胞體外受精后卵裂率和囊胚率

胚胎發(fā)育至囊胚期后，出現(xiàn)了細(xì)胞形態(tài)學(xué)上第一次明顯的分化：即分化為外周扁平的TE細(xì)胞和內(nèi)側(cè)團(tuán)狀I(lǐng)CM細(xì)胞(圖1c、1d)，TE細(xì)胞在囊胚外層形成單層球狀結(jié)構(gòu),內(nèi)部包裹ICM和囊胚液，ICM為致密的團(tuán)塊狀[19]。

如圖1a所示，發(fā)育阻滯的胚胎未形成囊胚，其透明帶沒(méi)有擴(kuò)張，胚胎直徑在160 μm以下(結(jié)果未顯示)。對(duì)早期囊胚、擴(kuò)張囊胚和孵化囊胚的直徑分別進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如圖1e所示：綿羊早期囊胚直徑在160 μm以下，此時(shí)透明帶還沒(méi)有明顯的擴(kuò)張；擴(kuò)張囊胚直徑范圍在160 μm～240 μm之間，此時(shí)透明帶明顯變薄，但是胚胎還未從透明帶中孵出。由于囊胚從透明帶孵化后直徑迅速增加，孵化囊胚直徑一般在240～340 μm之間。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)體外獲得的綿羊囊胚開(kāi)始孵化的直徑臨界區(qū)間在200～220 μm。

a.發(fā)育至168 h的綿羊胚胎(40×)；b.發(fā)育至168 h的綿羊胚胎(100×)；c.早期囊胚(200×)；d.擴(kuò)張囊胚(200×)；e.發(fā)育至囊胚階段的胚胎直徑分布圖

為進(jìn)一步分析不同發(fā)育時(shí)期囊胚的細(xì)胞數(shù)，并確定ICM和TE細(xì)胞的形態(tài)和位置，本試驗(yàn)收集了體外培養(yǎng)168 h后的囊胚，對(duì)不同發(fā)育階段的囊胚進(jìn)行DAPI染色，統(tǒng)計(jì)各階段囊胚的總細(xì)胞數(shù)。DAPI是細(xì)胞核熒光染料，表示細(xì)胞核所在位置，結(jié)果如圖2所示：同一時(shí)間發(fā)育至囊胚階段的胚胎不僅在細(xì)胞直徑上有所差異，且在細(xì)胞總數(shù)上有明顯的不同。早期囊胚細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞數(shù)在100以下(圖2a)；擴(kuò)張囊胚一般細(xì)胞數(shù)為200個(gè)以下(圖2b、2c)；同一時(shí)期孵化囊胚細(xì)胞數(shù)可以達(dá)到280個(gè)，結(jié)果表明在同一培養(yǎng)條件下，胚胎分裂增殖速度差異明顯。

a.早期囊胚，總細(xì)胞數(shù)53；b.擴(kuò)張囊胚，總細(xì)胞數(shù)129；c.擴(kuò)張囊胚，總細(xì)胞數(shù)175；d.孵化囊胚，總細(xì)胞數(shù)280，紅色箭頭所示為ICM區(qū)域

2.2 綿羊胚胎的Oct4和Cdx2基因的表達(dá)分析

2.2.1 不同發(fā)育時(shí)期綿羊胚胎Oct4基因的免疫熒光染色 為分析阿勒泰羊早期胚胎不同發(fā)育階段Oct4基因在表達(dá)，分別對(duì)2～8細(xì)胞期，16～32細(xì)胞期和囊胚期胚胎進(jìn)行了Oct4基因的免疫熒光染色，染色結(jié)果表明，阿勒泰羊早期胚胎在2～8細(xì)胞期胚胎內(nèi)均未檢測(cè)到Oct4基因的表達(dá)(結(jié)果未顯示)；在阿勒泰羊16～32細(xì)胞期中Oct4基因出現(xiàn)表達(dá)(圖3A)，由于Oct4基因是轉(zhuǎn)錄因子，主要在細(xì)胞核表達(dá)，因此和DAPI的細(xì)胞核定位染色相互重疊(圖3A)，染色結(jié)果提示：在阿勒泰羊胚胎16～32細(xì)胞期并不是所有的細(xì)胞都檢測(cè)到Oct4基因的表達(dá)，只有部分細(xì)胞表達(dá)Oct4基因(圖3A)。胚胎發(fā)育至囊胚期后，細(xì)胞分化為外圍扁平的TE細(xì)胞和內(nèi)部團(tuán)塊狀的ICM，從免疫熒光染色結(jié)果看，在擴(kuò)張期和孵化期囊胚，Oct4基因不僅在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中表達(dá)(圖3B、3C)，也在大部分TE細(xì)胞中表達(dá)，這與小鼠的Oct4基因表達(dá)模式不同。Oct4基因是多能基因，但是在綿羊上，不僅觀察到Oct4基因在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中表達(dá)，而且在擴(kuò)張囊胚分化的TE細(xì)胞上也有表達(dá)(圖3B)。

2.2.2 囊胚期TE細(xì)胞Cdx2免疫熒光染色 對(duì)囊胚期胚胎Cdx2基因進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖3D所示：作為T(mén)E的標(biāo)記基因，Cdx2基因在囊胚期分化的TE細(xì)胞上表達(dá)。由于囊胚期胚胎為多層球狀體，TE細(xì)胞在外側(cè)包裹著內(nèi)部的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，本試驗(yàn)免疫熒光染色顯示：在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)所在區(qū)域未見(jiàn)明亮的團(tuán)塊狀熒光區(qū)域，Cdx2基因在綿羊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)上不表達(dá)(圖3D)。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：綿羊囊胚期TE細(xì)胞上存在Oct4和Cdx2的共表達(dá)。由于體外培養(yǎng)條件的限制，綿羊胚胎只能培養(yǎng)到囊胚階段，Oct4在綿羊附植前胚胎TE中何時(shí)消失，還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3 討 論

在過(guò)去20年當(dāng)中，利用體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)成功得到了大多數(shù)的家養(yǎng)動(dòng)物的后代[20-24]。然而，當(dāng)前無(wú)論從胚胎形態(tài)還是物質(zhì)代謝方面，體外生產(chǎn)的胚胎在質(zhì)量上都還達(dá)不到體內(nèi)胚胎的水平[25]。體外受精效率的提高不僅要求卵母細(xì)胞成熟和精子獲能的能力，同時(shí)體外培養(yǎng)環(huán)境，包括培養(yǎng)液對(duì)促進(jìn)體外胚胎的生產(chǎn)都具有重要作用[26]。當(dāng)前在綿羊體外受精胚胎生產(chǎn)過(guò)程中，國(guó)內(nèi)外研究者大多參考和借鑒牛體外受精胚胎生產(chǎn)的體系和方法，并在此基礎(chǔ)上加以完善[27]。

本研究應(yīng)用免疫熒光染色對(duì)體外培養(yǎng)的受精卵、卵裂胚、桑葚胚和囊胚進(jìn)行了Oct4蛋白的檢測(cè)。結(jié)果表明：受精卵和早期卵裂胚未檢測(cè)到Oct4蛋白；16～32細(xì)胞期桑葚胚部分細(xì)胞表達(dá)Oct4蛋白表達(dá)。根據(jù)研究結(jié)果推測(cè)：雖然此時(shí)胚胎還未出現(xiàn)真正意義上第一次細(xì)胞分化(分化為外側(cè)的TE和內(nèi)部的ICM)，胚胎細(xì)胞間已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的表達(dá)差異性。小鼠上的研究也證實(shí)：在4細(xì)胞期胚胎的不同卵裂球之間，多能基因Oct4和Cdx2的表達(dá)已經(jīng)出現(xiàn)了明顯差異[6]，本研究提示：Oct4在第一次細(xì)胞分化過(guò)程中可能起到了重要調(diào)控作用。本研究還表明：在阿勒泰綿羊囊胚細(xì)胞中TE和ICM均表達(dá)Oct4。而早表達(dá)Oct4基因的細(xì)胞將發(fā)育為T(mén)E還是ICM,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)免疫熒光染色表明囊胚TE的細(xì)胞核上Oct4持續(xù)表達(dá)，Oct4在TE上與Cdx2存在共表達(dá)。Oct4基因和Cdx2基因互相抑制，Oct4可以負(fù)調(diào)控Cdx2基因的表達(dá)，Cdx2也可以通過(guò)抑制Oct4基因增強(qiáng)子的表達(dá)，而降低Oct4表達(dá)水平[28]。卵裂球中Cdx2分布的高低水平是影響小鼠胚胎進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)分裂次數(shù)和ICM細(xì)胞數(shù)的關(guān)鍵影響因子[6]，升高Cdx2的表達(dá)，可以促進(jìn)TE細(xì)胞分化和增殖，相反，降低胚胎中Cdx2的表達(dá)則促進(jìn)了ICM的數(shù)量。因此，Cdx2和Oct4基因的協(xié)調(diào)表達(dá)決定了胎盤(pán)和胎兒的發(fā)育。

在牛上，TE細(xì)胞中Oct4基因表達(dá)下調(diào)非常緩慢，導(dǎo)致TE中出現(xiàn)Oct4和Cdx2基因的共表達(dá)[29]。在胚胎附植前，干擾素(interferon-tau，IFNT)是母體妊娠識(shí)別過(guò)程最主要的功能蛋白[6]，IFNT由反芻動(dòng)物TE的單核細(xì)胞產(chǎn)生，自發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有三十多年的歷史，但是目前還沒(méi)有好的方法可以調(diào)控IFNT的分泌。Cdx2是IFNT轉(zhuǎn)錄必需的轉(zhuǎn)錄因子[8,16]。此外，Cdx2還可維持IFNT基因處于松散的常染色質(zhì)狀態(tài)，從而有利于IFNT的轉(zhuǎn)錄[30]，促進(jìn)胚胎的附植。IFNT的轉(zhuǎn)錄還需要轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白CREBBP(cAMP-response element binding protein)，AP1和ETS2形成復(fù)合物[31],AP1-CREBBP-ETS2復(fù)合物必須結(jié)合到IFNT基因的上游的啟動(dòng)子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)域，才能啟動(dòng)IFNT的轉(zhuǎn)錄。Oct4基因的POU結(jié)合域可以與ETS2的中央結(jié)合域直接結(jié)合，從而抑制AP1-CREBBP-ETS2復(fù)合物的產(chǎn)生[32]，進(jìn)而不利于TE細(xì)胞轉(zhuǎn)錄IFNT。因此，Oct4可以通過(guò)抑制Cdx2的表達(dá)，間接影響IFNT的轉(zhuǎn)錄，也可以通過(guò)抑制AP1-CREBBP-ETS2復(fù)合物而直接抑制IFNT的轉(zhuǎn)錄，因此，Oct4在胚胎TE中的持續(xù)表達(dá)，可能對(duì)胎盤(pán)發(fā)育及胚胎在子宮附植產(chǎn)生不利的影響。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)獲得了不同發(fā)育時(shí)期的綿羊胚胎，應(yīng)用免疫熒光染色探討了Oct4在早期胚胎的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明：受精卵，早期卵裂胚未檢測(cè)到Oct4蛋白；16～32細(xì)胞期桑葚胚部分細(xì)胞表達(dá)Oct4蛋白；Oct4與Cdx2基因在綿羊囊胚TE中存在共表達(dá)。這一現(xiàn)象在反芻動(dòng)物如牛上也有報(bào)道，證實(shí)了牛早期囊胚TE上存在大量Oct4基因的mRNA，但作者并未通過(guò)熒光染色證實(shí)Oct4蛋白的表達(dá)[6]。作為重要的多能轉(zhuǎn)錄因子，Oct4在TE細(xì)胞中表達(dá)的生物學(xué)意義目前還不清楚。應(yīng)當(dāng)關(guān)注的問(wèn)題是：Oct4基因表達(dá)在牛羊胚胎TE細(xì)胞中如何調(diào)控？能否像小鼠一樣，Oct4是否可以在牛羊TE中迅速消失？Oct4在牛羊TE細(xì)胞迅速消失后，IFNT表達(dá)能否升高，從而提高妊娠率？鑒于牛羊大動(dòng)物胚胎在子宮中伸長(zhǎng)，識(shí)別和附植失敗是導(dǎo)致妊娠率低的主要原因，因此，有必要對(duì)早期胚胎Oct4基因表達(dá)規(guī)律和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入分析，以及找到提高妊娠率的關(guān)鍵靶點(diǎn)。