李祖曦，黃顯斌，馬云濤，詹渭鵬，狐鳴，田宏偉，楊婧

0 引言

惡性腫瘤高死亡率與其發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]，因此針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究也愈來愈多。近些年，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell,CTC）及其表面PD-L1的表達(dá)成為研究熱點(diǎn)。隨著對(duì)CTC的不斷研究，將CTC的概念定義為：由于醫(yī)療操作或自發(fā)地脫離原發(fā)病灶或者轉(zhuǎn)移病灶進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[2]，是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵細(xì)胞。1869年Asworth最早在轉(zhuǎn)移性癌癥患者血液中觀察到CTC[3]。Allen等[4]曾提出CTC可以作為單個(gè)細(xì)胞存在，也可以作為一個(gè)細(xì)胞簇存在于外周血中，并且循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇在血液循環(huán)中似乎有更高的轉(zhuǎn)移潛能和更短的半衰期。絕大多數(shù)CTC會(huì)在血液循環(huán)中死亡，其原因可能與氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的缺乏、機(jī)體免疫細(xì)胞的作用有關(guān)，但少部分存活下來的CTC是引起腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因[5]。在循環(huán)中存活下來的CTC有一部分退出血液開始分裂、定植形成轉(zhuǎn)移灶；另一部分會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)，并最終保留成為轉(zhuǎn)移性病變的能力。PD-1是程序性死亡受體-1，多表達(dá)于活化后的T細(xì)胞表面，而在未活化T細(xì)胞上表達(dá)不明顯。PD-L1是PD-1的配體，兩者的表達(dá)會(huì)降低患者自身免疫力，尤其在腫瘤中的高表達(dá)可能會(huì)嚴(yán)重影響患者預(yù)后[6]。Papadaki等[7]在乳腺癌患者外周血中CTC上檢測(cè)到PD-L1的表達(dá)，證實(shí)了CTC細(xì)胞膜上具有PD-L1蛋白的表達(dá)并且驗(yàn)證了CTC PD-L1檢測(cè)的可行性。近年來，多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)CTC PD-L1表達(dá)水平與療效密切相關(guān)。Jacot等[8]在關(guān)于乳腺癌PD-L1液體活檢與傳統(tǒng)侵入式活檢相關(guān)性的研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC的表達(dá)可能比原發(fā)腫瘤細(xì)胞上PD-L1表達(dá)更好的反應(yīng)預(yù)后，檢測(cè)CTC PD-L1作為液體活檢似乎是一種評(píng)估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的有效方法，它繞過了原發(fā)性腫瘤和各種轉(zhuǎn)移位點(diǎn)之間的生物標(biāo)志物的異質(zhì)表達(dá)。侵入式活檢出現(xiàn)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)高，只能從有限的腫瘤切片中取樣，相比傳統(tǒng)侵入式活檢，CTC PD-L1檢測(cè)具有無創(chuàng)、方便、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)等優(yōu)勢(shì)，在惡性腫瘤患者治療療效評(píng)價(jià)及預(yù)后預(yù)測(cè)方面具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。因此，研究CTC PD-L1的臨床應(yīng)用價(jià)值顯得非常有意義。

1 CTC PD-L1表達(dá)檢測(cè)原理

CTC的檢測(cè)方法有多種，但目前主流的技術(shù)為第三代基于物理或生化特性的微流控芯片技術(shù)。CTC PD-L1富集檢測(cè)原理是基于特異性抗體納米微流控免疫捕獲結(jié)合免疫熒光染色。檢測(cè)分為兩部分，包括CTC的篩選和對(duì)篩選出來的CTC進(jìn)行免疫熒光染色，從而鑒別出PD-L1陽性的CTC。首先對(duì)患者外周血進(jìn)行預(yù)處理，獲得單核細(xì)胞層（PBMCs層），然后對(duì)納米微流控芯片（即CytoNanoChip芯片）進(jìn)行抗體包被，利用CytoSorter 循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析儀，將洗滌后的PBMCs樣本通過SCx螺旋樣品室導(dǎo)入到包被有捕獲抗體的納米微流控芯片中，從而富集到CTC；然后再利用PDL1-CY5、PanCK-FITC、CSV-FITC和CD45-PE，以及Hoechst對(duì)富集到的CTC進(jìn)行染色，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果，根據(jù)染色的情況，篩選出PD-L1+CTC。首先通過生物素標(biāo)記上皮黏附蛋白（EpCAM）和細(xì)胞表面波形蛋白（cell surface vimentin,CSV）抗體結(jié)合微流控納米芯片免疫捕獲系統(tǒng)捕獲上皮間質(zhì)混合型CTC，然后利用熒光顯微鏡成像技術(shù)檢測(cè)PD-L1-CY5、PanCK-FITC、CSV-FITC和CD45-PE，鑒定PD-L1陽性表達(dá)的CTC，見圖1。

2 CTC PD-L1在臨床中的應(yīng)用

免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤患者PD-L1表達(dá)是目前公認(rèn)的最有效的方法，F(xiàn)DA已經(jīng)批準(zhǔn)了四種基于免疫組織化學(xué)（IHC）的分析，作為風(fēng)險(xiǎn)/效益評(píng)估的伴隨診斷。然而，對(duì)于PD-L1 IHC的預(yù)測(cè)價(jià)值仍存在爭(zhēng)議，因?yàn)橐恍㏄D-L1陰性腫瘤患者也可從抗免疫治療中獲益，如轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、鱗狀NSCLC和RCC等，或者在治療反應(yīng)和PD-L1狀態(tài)之間沒有顯著的相關(guān)性。PD-L1表達(dá)界值的變異性大，以及測(cè)試PD-L1表達(dá)的細(xì)胞類型，為PD-L1 IHC在臨床實(shí)踐中的使用提出了重大挑戰(zhàn)[13-16]。此外，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的異質(zhì)性表達(dá)及不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)一步限制了PD-L1 IHC的可行性，因?yàn)樵谀骋粋€(gè)部位的活檢不能代表整個(gè)腫瘤或轉(zhuǎn)移性特征。作為轉(zhuǎn)移驅(qū)動(dòng)的前體，CTC可能具有原發(fā)性腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)移細(xì)胞的特征[17]，因此CTC PD-L1可以更好地代表整個(gè)腫瘤的發(fā)展?fàn)顟B(tài)、提供更全面的信息。另外，CTC PD-L1檢測(cè)不同于腫瘤活組織檢查，血液樣本可以通過較少侵入性和頻繁獲得便于縱向監(jiān)測(cè)。CTC PD-L1檢測(cè)將會(huì)成為未來組織PD-L1檢測(cè)的有效替代方法。通過對(duì)CTC PD-L1表達(dá)含量的檢測(cè)可以為腫瘤的診斷提供可能依據(jù)，為腫瘤患者預(yù)后提供參考價(jià)值和監(jiān)測(cè)，以便能在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移前及時(shí)地干預(yù)治療，還可以為腫瘤患者的化療及免疫治療提供指導(dǎo)，給患者帶來巨大受益。

2.1 早診早篩

CTC的臨床應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)有了大量的研究，美國(guó)FDA也早已批準(zhǔn)將CTC檢測(cè)應(yīng)用于乳腺癌的診斷[18]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CTC在肝癌診斷方面作為新生標(biāo)志物具有重要意義[19]。因此，CTC檢測(cè)可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早診早篩。CTC PD-L1表達(dá)檢測(cè)目前尚無明確應(yīng)用于早期診斷的報(bào)告，其主要應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性腫瘤的疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)后上。因此循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)在早診早篩方面的應(yīng)用價(jià)值有限。

2.2 療效評(píng)估及指導(dǎo)治療

PD-L1是用于PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)阻斷治療的最佳研究和合理的免疫生物標(biāo)志物。Yue等[20]在一項(xiàng)關(guān)于PD-1阻斷治療晚期實(shí)體瘤患者CTC PD-L1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC可作為篩選PD-1/PD-L1阻斷治療患者的預(yù)測(cè)指標(biāo)，測(cè)定CTC PD-L1動(dòng)態(tài)變化可早期提示治療反應(yīng)。Yue等使用PD-1抑制劑IBI308治療晚期胃腸道腫瘤的Ⅰ期試驗(yàn)中納入35例患者，并且分析了CTC PD-L1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PD-L1high+CTC的疾病控制率（disease control rate,DC）更高，基線時(shí)PD-L1high+CTC的豐度對(duì)無進(jìn)展生存期（progression free survival,PFS）有預(yù)測(cè)意義。Tomita等[21]在一項(xiàng)關(guān)于小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)RRx-001（一種新型表觀遺傳調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤的活性）治療后CTC PD-L1表達(dá)量減少與臨床療效呈正相關(guān)，在RRx-001治療小細(xì)胞肺癌過程中監(jiān)測(cè)CTC PD-L1的表達(dá)可達(dá)到預(yù)測(cè)RRx-001癌癥治療反應(yīng)的目的。Nicolazzo等[22]使用PD-1抑制劑尼伏魯單抗治療24例非小細(xì)胞肺癌患者后所有PD-L1-CTC的患者都獲得了臨床效益，而PD-L1+CTC的患者都發(fā)生了疾病進(jìn)展，PD-L1+CTC持續(xù)性表達(dá)反映了一種治療逃逸機(jī)制，因此在疾病發(fā)生過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)患者CTC PD-L1表達(dá)狀況可以知悉腫瘤逃逸機(jī)制和對(duì)免疫治療進(jìn)行療效評(píng)估。大量研究表明動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CTC PD-L1表達(dá)可以對(duì)免疫治療療效進(jìn)行評(píng)估，但同時(shí)部分研究中可評(píng)估的患者數(shù)量有限，缺乏多中心隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)支撐。因此CTC PD-L1的表達(dá)作為腫瘤患者療效評(píng)估指標(biāo)還需要進(jìn)行多中心、大樣本臨床試驗(yàn)研究。

此外，PD-L1+CTC的表達(dá)水平也可作為指導(dǎo)腫瘤患者治療的生物標(biāo)志物。Raimondi等[23]在分析40例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者接受瑞戈非尼治療的療效分析試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC患者接受瑞戈非尼后PFS、OS明顯較長(zhǎng)。因此，CTC PD-L1可以預(yù)測(cè)瑞戈非尼治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的受益人群，從而提供高度個(gè)性化的治療方案。由于并非所有腫瘤患者都能從化療、靶向藥物及免疫治療中獲益，所以根據(jù)患者CTC PD-L1的表達(dá)選擇合適的治療藥物，可進(jìn)一步提高患者生存率。

2.3 預(yù)后判斷

近年來研究表明CTC PD-L1的表達(dá)可以預(yù)測(cè)膀胱癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、尿路上皮癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌等的預(yù)后。因此，CTC PD-L1的表達(dá)可能成為判斷腫瘤患者預(yù)后的新一代重要的“液體活檢”標(biāo)志物。Anantharaman等[24]探討CTC PD-L1表達(dá)對(duì)浸潤(rùn)性膀胱癌患者臨床預(yù)后價(jià)值的臨床試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)PD-L1high+CTC的患者較PD-L1low+CTC的患者的總體生存率低。Strati等[25]在分析PD-L1+CTC是否可用于預(yù)測(cè)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者的治療療效的研究中，發(fā)現(xiàn)治療結(jié)束時(shí)PD-L1+CTC過表達(dá)的患者PFS和總生存期（overall survival,OS）均較短，并且是PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因素。Cheng等[26]在對(duì)41例初治非小細(xì)胞肺癌患者CTC PD-L1檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC的初始治療患者的PFS短于PD-L1-CTC的患者。Dall′Olio等[27]在免疫抑制劑治療39例晚期非小細(xì)胞癌患者的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1+CTC較PDL1-CTC患者OS更長(zhǎng)且CTC PD-L1的表達(dá)與組織PD-L1的表達(dá)無相關(guān)性。Bergmann等[28]分析49例晚期尿路上皮癌患者外周血CTC PD-L1的表達(dá)狀況的研究中，發(fā)現(xiàn)患者自身和患者間存在CTC PD-L1的異質(zhì)性表達(dá)，并且PD-L1+CTC與較差的OS相關(guān)。Jacot等[8]評(píng)價(jià)了72例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者CTC PD-L1與組織內(nèi)PD-L1表達(dá)的臨床病理相關(guān)性和預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC表達(dá)與無進(jìn)展生存期顯著相關(guān)，而組織PD-L1陽性表達(dá)與無進(jìn)展生存期無關(guān)。Tomita等[21]對(duì)14例小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行RRx-001治療前后CTC PD-L1表達(dá)與臨床預(yù)后的Logistic回歸模型ROC分析研究中表明，治療后PD-L1+CTC的表達(dá)降低與較好的臨床結(jié)局相關(guān)。Winograd等[29]在對(duì)87例肝細(xì)胞癌患者CTC PD-L1表達(dá)對(duì)預(yù)后影響的研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC較PD-L1-CTC患者OS明顯較短，CTC PD-L1是獨(dú)立預(yù)后因子。Liu等[30]在對(duì)70例胃癌患者外周血CTC PD-L1表達(dá)的研究中，發(fā)現(xiàn)PD-L1+CTC與OS短、療效差顯著相關(guān)，可以作為胃癌的臨床預(yù)后標(biāo)志物。因此，外周血CTC PD-L1的表達(dá)水平對(duì)臨床預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。綜上所述，由于組織檢測(cè)PD-L1表達(dá)存在局限性，因此PD-L1+CTC可以作為轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、預(yù)后不良的腫瘤患者的潛在生物標(biāo)志物；能夠幫助篩選出免疫治療的獲益人群，可以更精準(zhǔn)地評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后及疾病變化趨勢(shì)。

2.4 免疫治療監(jiān)測(cè)

目前CTC檢測(cè)已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)直腸癌患者的疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)[31],CTC PD-L1的表達(dá)有可能作為監(jiān)測(cè)腫瘤患者免疫治療過程的有效標(biāo)志物。Zhang等[32]在研究30例前列腺癌CTC免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)情況中發(fā)現(xiàn)CTC PD-L1在疾病狀態(tài)間存在異質(zhì)性表達(dá)，并且可以對(duì)前列腺癌患者的免疫治療進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Dhar等[33]在評(píng)價(jià)22例轉(zhuǎn)移性肺癌CTC PD-L1表達(dá)的研究中，發(fā)現(xiàn)對(duì)患者總體CTC計(jì)數(shù)和PD-L1+CTC計(jì)數(shù)的連續(xù)監(jiān)測(cè)可能有助于識(shí)別治療后的變化。因此，CTC PD-L1的表達(dá)可能是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的一個(gè)輔助的生物標(biāo)志物，有助于確定免疫治療的反應(yīng)。CTC PD-L1檢測(cè)在CTC的基礎(chǔ)上必將更好的監(jiān)測(cè)治療過程中疾病變化、預(yù)測(cè)結(jié)局。

3 循環(huán)腫瘤細(xì)胞PD-L1臨床應(yīng)用的局限性

CTC PD-L1表達(dá)的臨床研究在部分實(shí)體腫瘤中已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但這些研究對(duì)于其應(yīng)用于臨床還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。CTC PD-L1表達(dá)在臨床應(yīng)用中還將面臨很多挑戰(zhàn)，最主要的是在各種實(shí)體瘤中表達(dá)程度不一，這可能與檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。其次，臨床上接受免疫治療的絕大部分患者已經(jīng)進(jìn)入晚期，在接受了放、化療療效不佳的情況下才選用免疫治療[34]，因此患者的既往治療方案對(duì)于CTC PD-L1表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果有一定影響。另外，該項(xiàng)檢查的費(fèi)用昂貴及缺乏循證醫(yī)學(xué)的支持也是造成其臨床應(yīng)用受限的因素之一[35]。

4 總結(jié)與展望

CTC PD-L1作為一種無創(chuàng)、簡(jiǎn)便的“液體活檢”技術(shù)在腫瘤的療效評(píng)估、指導(dǎo)化療、免疫治療監(jiān)測(cè)、腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景，尤其在腫瘤患者預(yù)后評(píng)估方面有著重要價(jià)值。目前PD-L1+CTC表達(dá)程度暫無定量標(biāo)準(zhǔn)，如何根據(jù)CTC PD-L1表達(dá)狀況定性定量地評(píng)估療效、指導(dǎo)化療、監(jiān)測(cè)免疫治療及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，將成為我們要解決的主要問題。CTC PD-L1檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展能夠更好地幫助我們進(jìn)一步理解腫瘤的免疫治療及腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素。雖然CTC PD-L1檢測(cè)在臨床上已經(jīng)初步應(yīng)用，但目前尚處于初級(jí)階段，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床試驗(yàn)研究。近年來針對(duì)循環(huán)腫瘤核酸（circulating tumor DNA,ctDNA）[36]、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）[37]及循環(huán)腫瘤細(xì)胞[3]等標(biāo)志物的檢測(cè)、分析是“液體活檢”應(yīng)用于臨床實(shí)踐的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然循環(huán)腫瘤核酸、細(xì)胞外囊泡等也可以反映腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、監(jiān)測(cè)腫瘤的療效和評(píng)估預(yù)后，但是仍缺乏公認(rèn)有效的檢測(cè)手段，循環(huán)腫瘤細(xì)胞較CTC PD-L1缺乏特異性。由于在腫瘤患者中，CTC PD-L1單一檢測(cè)的預(yù)測(cè)作用有限，因此聯(lián)合臨床其他“液體活檢”的指標(biāo)能更加準(zhǔn)確、全面地對(duì)腫瘤進(jìn)行綜合預(yù)測(cè)評(píng)估。