唐鰻秋,夏玙,吳正云,周山大慶,張文學(xué),3*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都,610065)2(明石工業(yè)高等專門學(xué)校 電氣情報(bào)工學(xué)科,日本 兵庫(kù)縣,674-8501)3(四川大學(xué)錦江學(xué)院 白酒學(xué)院,四川 眉山,620860)

清香型小曲酒又稱“川法小曲酒”,是用高粱、玉米等糧谷類原料,以清香型小曲作糖化發(fā)酵劑釀制的白酒，具有風(fēng)格獨(dú)特,清香怡人的特點(diǎn)[1]。邛崍米曲是我國(guó)小曲中的著名曲種之一,傳統(tǒng)邛崍米曲中添加了72味中藥成分,使所釀小曲酒極具特色風(fēng)味。黃酒是我國(guó)歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵酒,與啤酒和葡萄酒并稱為世界3大發(fā)酵酒,其風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富,酒精含量8%～15%[2]。

日本酒主要有日本清酒(sake)、燒酒(shochu)、泡盛(awamori)3大類。日本清酒是借鑒中國(guó)黃酒的釀造法而發(fā)展起來(lái)的日本國(guó)酒,也是一種發(fā)酵酒[3],酒精含量大于15%,富含多種氨基酸和維生素。日本燒酒是一種蒸餾酒,酒精含量通常為25%,典型代表為本格燒酒[4]。米燒酒、紅薯燒酒、黑糖燒酒通常采用米曲,麥燒酒一般用麥曲。日本泡盛酒是日本最古老的蒸餾酒,被稱為日本燒酒的始祖,盛產(chǎn)于沖繩,酒精含量30%～45%,其釀造方法獨(dú)特[5],是將精選泰國(guó)米制成米麴,將米麴和水一次性下料進(jìn)行發(fā)酵,再蒸餾而成。

“曲乃酒之骨”,酒曲中的微生物決定酒曲品質(zhì)。TANG等[6]利用高通量測(cè)序技術(shù)分析了小曲中微生物多樣性,結(jié)果顯示葡萄球菌屬(Staphylococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、根霉屬(Rhizopus)和假絲酵母屬(Candida)為優(yōu)勢(shì)菌屬。唐潔[7]利用變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)分析了清香型小曲微生物群落結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)小曲中主要的細(xì)菌菌屬為乳酸菌屬、芽胞菌屬和葡萄菌屬,主要酵母為扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera),主要霉菌有米根霉(Rhizopusoryzae)和土曲霉(Aspergillusterreus)。目前有關(guān)國(guó)內(nèi)曲酒的研究已有很多,但鮮有與日本酒曲的對(duì)比研究,而且國(guó)內(nèi)酒曲研究較多集中于大曲[8-10]。本研究選取的8種酒曲具有中日酒曲的典型代表性,且均制曲發(fā)酵周期較短,類似于中國(guó)小曲類酒曲,因此很有必要對(duì)其進(jìn)行一個(gè)全面的對(duì)比研究。

宏基因組學(xué)技術(shù)[11]是針對(duì)樣品中全部微生物的總DNA,從基因組文庫(kù)中篩選功能基因或直接進(jìn)行高通量測(cè)序,來(lái)分析微生物多樣性并挖掘功能基因。近年來(lái),宏基因組測(cè)序已廣泛應(yīng)用于泡菜、奶酪、香醋、酒、發(fā)酵香腸等發(fā)酵食品的功能微生物研究[11-12]。本研究采用宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)8種酒曲中微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,旨在解析中日酒曲微生物種群結(jié)構(gòu)的差異,同時(shí)對(duì)8種酒曲進(jìn)行了基因功能預(yù)測(cè),為后續(xù)篩選特定功能微生物,并進(jìn)行功能強(qiáng)化曲制作工藝優(yōu)化,開發(fā)出功能型強(qiáng)化酒曲提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲樣品：邛崍米曲MB,四川省邛崍市某酒廠制曲車間；清香型小曲QX,四川省瀘州市某酒廠制曲車間；黃酒麥曲FHC,四川省南充市某黃酒廠制曲車間；黃酒麥曲TH,浙江省紹興市某黃酒廠制曲車間；日本清酒米曲NP_MS、日本燒酒米曲NP_SJR、日本燒酒麥曲NP_SJW、日本泡盛酒曲NP_SY,均由日本合作高校采集并郵寄。

主要試劑：NaOH、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸、KI、可溶性淀粉、CuSO4·5H2O、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、甲醛溶液(37%～40%),均為分析純,成都科龍化工試劑廠；E.Z.N.A.Soil DNA Kit,美國(guó)Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C酸度計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DYY-5瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一儀器廠；Legend Micro 17R高速冷凍離心機(jī),美國(guó)賽默飛公司；GeneAmp?9700型PCR儀,美國(guó)ABI公司；Illumina Hiseq PE150高通量測(cè)序平臺(tái),美國(guó)Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 中日酒曲制曲工藝

中國(guó)酒曲：邛崍米曲是以大米為原料,經(jīng)浸泡、碾碎、加入曲母和72味中草藥拌曲、制胚、進(jìn)箱培菌、出箱烘干等流程,經(jīng)約90 h發(fā)酵而成的餅曲；清香型小曲是以麩皮、米糠和米粉為原料,經(jīng)碾細(xì)、加入種曲拌和、踩曲、切曲、生火入房、保溫、通氣、關(guān)燒、烘曲等流程,經(jīng)約90 h發(fā)酵而成的散曲；黃酒麥曲是以小麥為原料,經(jīng)過(guò)軋碎、拌水、踩曲、壓制成型、入房堆積等流程,經(jīng)7 d左右發(fā)酵而成的塊曲。

日本酒曲：清酒米曲[13]是以日本米為原料,經(jīng)浸米、蒸米、干燥、冷卻、入室堆置、加入種曲揉碎、搓拌翻轉(zhuǎn)、重疊堆置、調(diào)換曲盤位置、出室放冷等流程,經(jīng)約46 h發(fā)酵而成的散曲；燒酒曲是以日本米或小麥為原料,經(jīng)浸泡、蒸煮、冷卻、配種、恒溫恒濕堆積培養(yǎng)、攤開混勻、再堆積、翻曲、干燥等流程,經(jīng)約40 h發(fā)酵而成的散曲；泡盛酒曲是以泰國(guó)長(zhǎng)粒米為原料,經(jīng)浸泡、蒸米、配種、40 ℃恒溫培養(yǎng)、干燥等流程,經(jīng)約40 h發(fā)酵而成的散曲。

1.3.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]測(cè)定樣品中水分、糖化力、液化力、發(fā)酵力和酸度。還原糖測(cè)定采用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液反滴定的還原糖測(cè)定法[15]。

1.3.3 DNA提取及測(cè)序

采用試劑盒提取酒曲微生物宏基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA完整性,用NanoDrop2000檢測(cè)純度,用Quantus Fluorometer(Picogreen)檢測(cè)濃度。建立宏基因組測(cè)序文庫(kù),送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq PE150。

1.3.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控預(yù)處理,得到有效序列[16],用于后續(xù)分析。使用BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將非冗余基因集分別與NR數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GENES)進(jìn)行比對(duì)[17],然后通過(guò)NR庫(kù)對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得物種注釋結(jié)果,再使用物種對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度,獲取各樣本分別在門、屬和種水平上的分類情況；根據(jù)與GENES的比對(duì)結(jié)果使用KOBAS 2.0(KEGG orthology based annotation system)進(jìn)行功能注釋[18]。用R語(yǔ)言的Vegan軟件包進(jìn)行典型對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis,CCA)并繪圖。使用KO、Pathway、EC、Module對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該功能類別的豐度。使用Origin 2018軟件對(duì)8種酒曲樣品的優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 八種中日酒曲理化指標(biāo)對(duì)比

8種中日酒曲的各理化指標(biāo)情況見表1。酒曲水分含量越低,即其發(fā)酵產(chǎn)生的游離水越多,在一定程度上反映出酒曲發(fā)酵的成熟度越好[19]。8種酒曲的水分含量依次為FHC>NP_SJW>NP_SY>TH>MB>NP_MS> NP_SJR>QX。還原糖由糖化酶酶解淀粉生成,FHC還原糖含量最低,NP_SJW最高。酒曲的酸度主要是由產(chǎn)酸微生物進(jìn)行有機(jī)酸代謝產(chǎn)生的。8種酒曲的酸度由高到低為：NP_SY>FHC>MB>NP_MS>NP_SJW> NP_SJR=QX>TH,說(shuō)明NP_SY內(nèi)部微生物產(chǎn)酸代謝相對(duì)旺盛。糖化力和液化力往往呈正相關(guān),且酒曲的糖化力和液化力越高,其原料利用率和出酒率就越高。NP_SJW、NP_SJR和NP_MS的糖化力和液化力最高,NP_SY和QX的糖化力最低,TH和NP_SY的液化力最低。發(fā)酵力是反映酒曲產(chǎn)酒能力的重要指標(biāo)。酒曲的產(chǎn)酒能力是固態(tài)白酒發(fā)酵、生酯產(chǎn)香的基礎(chǔ)。MB和QX的發(fā)酵力最高,均大于1.40 U,NP_SJR的發(fā)酵力最低,僅為0.04 U?？傮w來(lái)看,日本酒曲的平均糖化力、液化力和還原糖含量均略高于中國(guó)酒曲,中國(guó)酒曲的平均發(fā)酵力略高于日本酒曲。

表1 八種中日酒曲理化指標(biāo)

2.2 八種中日酒曲宏基因組測(cè)序結(jié)果

經(jīng)Illumina平臺(tái)測(cè)序后從8個(gè)樣品中共得到50 155 557 812 bp的原始?jí)A基數(shù)；在原始測(cè)序數(shù)據(jù)中存在著部分低質(zhì)量數(shù)據(jù),為提高后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確可靠,需對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控預(yù)處理。具體測(cè)序及質(zhì)控結(jié)果情況如表2。

表2 原始數(shù)據(jù)及質(zhì)控結(jié)果

2.3 八種中日酒曲的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

由圖1-a可知,在門水平上,MB和QX主要為子囊菌門(Ascomycota,分別為9.29%、8.86%)、厚壁菌門(Firmicutes,分別為3.27%、5.21%)和變形菌門(Proteobacteria,分別為0.22%、1.59%)。TH主要為放線菌門(Actinobacteria,82.66%)、厚壁菌門(2.57%)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota,2.51%)和變形菌門(1.58%)。FHC主要為變形菌門(35.17%)、厚壁菌門(23.58%)、子囊菌門(7.46%)和擔(dān)子菌門(2.48%)。日本酒曲均主要為子囊菌門(均>93%),NP_SJR和NP_SJW還有少量厚壁菌門(分別為6.38%、0.89%)。

由圖1-b可知,在屬水平上,MB和QX主要為根霉屬(分別為81.39%、78.70%)。TH主要為糖多孢菌屬(Saccharopolyspora,59.70%)。陳青柳[12]研究發(fā)現(xiàn),糖多孢菌屬(54.77%)是紹興黃酒麥曲和發(fā)酵中特有的優(yōu)勢(shì)菌屬,與本研究結(jié)果一致,其在黃酒發(fā)酵過(guò)程中的具體作用值得進(jìn)一步研究。FHC物種組成相對(duì)最為豐富,主要有橫梗霉屬(Lichtheimia,25.02%)、葡萄球菌屬(11.33%)、腸桿菌屬(Enterobacter,9.51%)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella,9.37%)和曲霉屬(Aspergillus,7.14%)。4種日本酒曲均主要為曲霉屬(均>91%),NP_SJR還有少量葡萄球菌屬(6.30%)。這與“日本酒神”坂口謹(jǐn)一郎[20]指出的中國(guó)為中心的東亞大陸到東南亞的曲的主要菌為根霉屬和毛霉屬(Mucor),日本酒曲的主要菌為曲霉屬一致。由于曲霉屬等絲狀真菌有利于糖化酶的產(chǎn)生,因此日本酒曲的糖化力總體高于中國(guó)酒曲(表1),與徐巖等[21]的研究結(jié)果一致。

由圖1-c可知,在種水平上,MB和QX主要有戴爾根霉(Rhizopusdelemar,分別為67.11%、65.18%)和小孢根霉(Rhizopusmicrospores,分別為12.11%、11.82%)。TH主要有刺糖多胞菌(Saccharopolysporaspinosa,30.49%)、糖多孢紅霉菌(Saccharopolysporaerythraea,14.62%)和糖多孢菌(Saccharopolysporarectivirgula,14.52%)；FHC主要有橫梗霉(Lichtheimiaramosa,20.80%)、Klebsiellacf.planticolaB43(6.19%)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae,5.94%)和木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosust,5.85%)。NP_MS、NP_SJR和NP_SJW的物種組成類似且較單一,均主要為米曲霉(均>50%)、黃曲霉(均>36%)、Aspergillusnomius(分別為1.87%、1.74%、1.86%)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus,分別為1.84%、1.73%、1.86%)。NP_SY主要為白曲霉(Aspergilluskawachii,44.63%)、琉球曲霉(Aspergillusluchuensis,31.55%)、黑曲霉(Aspergillusniger,18.04%)和米曲霉(1.74%)。這些霉菌能分泌豐富的多糖水解酶,被認(rèn)為是酒曲中重要的糖化微生物[22]。日本酒曲中用于將淀粉原料分解為糖的曲霉主要為黃曲霉、白曲霉和黑曲霉。日本清酒米曲和燒酒酒曲中主要為不產(chǎn)檸檬酸的黃曲霉,而泡盛酒曲則主要為產(chǎn)檸檬酸的白曲霉和黑曲霉,用含酸量高的酒曲制出的酒醪因其他雜菌難以繁殖,具有不易腐敗的特點(diǎn)[23]。

a-門水平；b-屬水平；c-種水平

2.4 八種中日酒曲微生物群落與理化因子的關(guān)聯(lián)分析

典型關(guān)聯(lián)分析(canonical correlation analysis,CCA)[22]是最常用的挖掘數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)關(guān)系的算法之一。選擇8種中日酒曲樣品中相對(duì)豐度前10位的菌屬與水分、糖化力、液化力、發(fā)酵力、還原糖和酸度等理化因子進(jìn)行CCA。由圖2可知,TH和FHC呈正相關(guān),QX和MB呈正相關(guān),4種日本酒曲呈正相關(guān)。糖化力與液化力、酸度、還原糖和水分均呈正相關(guān),與發(fā)酵力呈負(fù)相關(guān),其中發(fā)酵力、液化力和還原糖對(duì)物種的影響程度最大,酸度影響程度最小。曲霉屬與水分、糖化力、液化力、酸度和還原糖呈正相關(guān),與發(fā)酵力呈負(fù)相關(guān)。4種日本酒曲與曲霉屬和葡萄球菌屬呈正相關(guān),TH和FHC與糖多孢菌屬、腸桿菌屬、橫梗霉屬、克雷伯氏菌屬呈正相關(guān),QX和MB與魏斯氏菌屬、寄生霉菌屬(Parasitella)、木霉屬、畢赤酵母屬、根霉屬、酵母屬和威克漢姆酵母屬呈正相關(guān)。由此說(shuō)明,中日酒曲中微生物的種群結(jié)構(gòu)對(duì)其理化指標(biāo)具有顯著影響。

圖2 八種中日酒曲微生物群落和理化因子的CCA分析

2.5 八種中日酒曲KEGG功能注釋及差異分析

如圖3所示,在KEGG一級(jí)代謝中共發(fā)現(xiàn)微生物代謝功能6類：代謝、人類疾病、生物體系統(tǒng)、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過(guò)程。8種中日酒曲均以代謝為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)功能(均>27%),說(shuō)明酒曲內(nèi)部微生物代謝活動(dòng)均較為活躍,為各自風(fēng)味的形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 八種中日酒曲基因表達(dá)的KEGG一級(jí)代謝功能分析

對(duì)代謝子功能進(jìn)行具體分析和差異分析,如圖4,共注釋到12種代謝功能,由其豐度可知,8種中日酒曲中碳水化合物和氨基酸均存在較為旺盛的代謝特征。氨基酸決定了酒的風(fēng)味,在酒的香型及口感形成中起著重要作用[24]。日本酒曲的氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因表達(dá)量均高于中國(guó)酒曲,這可能是由于日本酒曲中主要為絲狀真菌曲霉屬,其具有較強(qiáng)的產(chǎn)糖化酶和蛋白酶能力。8種中日酒曲之間具有顯著性差異的代謝功能有6個(gè),分別為碳水化合物代謝、代謝通路總覽、外源性生物降解和代謝、其他氨基酸代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、萜類和聚酮類代謝,其中中國(guó)酒曲的碳水化合物代謝、代謝通路總覽、萜類和聚酮類代謝的相關(guān)基因表達(dá)量均高于日本酒曲,推測(cè)可能與中國(guó)酒曲中主要存在的根霉屬、糖多孢菌屬和橫梗霉屬有關(guān)。

圖4 八種中日酒曲代謝途徑的基因表達(dá)KEGG二級(jí)代謝功能差異分析

3 結(jié)論

本研究以8種中日典型酒曲為研究對(duì)象,通過(guò)宏基因組技術(shù)探究了中日酒曲的微生物多樣性。總體而言,中日酒曲之間具有較顯著差異的有曲霉屬、根霉屬、糖多孢菌屬和橫梗霉屬,日本酒曲以曲霉屬為主,中國(guó)酒曲以根霉屬、糖多孢菌屬和橫梗霉屬為主。同時(shí)對(duì)8種酒曲的理化特性進(jìn)行了對(duì)比分析,其中日本酒曲的平均糖化力、液化力和還原糖含量均略高于中國(guó)酒曲,而中國(guó)酒曲的平均發(fā)酵力略高于日本酒曲。由CCA可知,8種中日酒曲中微生物的種群結(jié)構(gòu)與其理化指標(biāo)存在明顯關(guān)聯(lián),且發(fā)酵力、液化力和還原糖含量與微生物物種分布相關(guān)程度最大。此外,對(duì)中日酒曲進(jìn)行了KEGG功能注釋,中日酒曲中微生物均主要參與代謝功能,集中在碳水化合物代謝、氨基酸代謝和代謝通路總覽,其中中日酒曲之間具有顯著性差異的有碳水化合物代謝、代謝通路總覽。本文探究了中日酒曲中微生物群落及理化特性的對(duì)比差異及相互關(guān)系,有助于利用全基因組測(cè)序解析中日酒曲與各類風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)功能微生物,后續(xù)可通過(guò)分析功能微生物具體代謝途徑和機(jī)理來(lái)研究其對(duì)酒曲及酒的風(fēng)味和品質(zhì)的作用,進(jìn)一步篩選特定功能微生物,開發(fā)出功能型強(qiáng)化酒曲,并將功能型強(qiáng)化酒曲應(yīng)用于幾類中國(guó)酒的試生產(chǎn)過(guò)程中,以期為我國(guó)釀酒工業(yè)化發(fā)展提供研究基礎(chǔ)。