張 彪，路娟娥，韓文英，劉素可，武 陶，阮海華

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

近年來，隨著新型食品生產(chǎn)工藝的應(yīng)用、人們飲食習(xí)慣的改變以及衛(wèi)生環(huán)境的惡化等，食源性疾病的發(fā)生率明顯增加，食源性疾病已成為影響食品安全的主要問題之一[1]。沙門氏菌屬腸桿菌科，革蘭氏陰性桿菌，是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的重要致病菌之一[2]。沙門氏菌通過不潔食物或者水源進(jìn)入人體胃腸道后，可黏附于腸黏膜上皮細(xì)胞并迅速增殖，侵入腸道固有層細(xì)胞，引起機(jī)炎癥性腹瀉甚至敗血癥[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，法國每年發(fā)生的食源性感染病例中，幾乎一半是由沙門氏菌引起；在美國，沙門氏菌每年導(dǎo)致約120萬 種疾病發(fā)生、23 000 例住院治療和450 例死亡[4]。因此，為維護(hù)公共健康和提高食品安全性，研究沙門氏菌感染機(jī)制對(duì)于降低沙門氏菌危害性及預(yù)防沙門氏菌感染至關(guān)重要。

外泌體是細(xì)胞向外分泌的小型囊泡，幾乎能被所有的細(xì)胞分泌，尺寸在30～150 nm之間，具有穩(wěn)定的雙層膜結(jié)構(gòu)[5]，其內(nèi)含有多種類型的生物活性成分，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等[6]。大量研究表明，當(dāng)外泌體分泌至細(xì)胞外環(huán)境后，外泌體可通過質(zhì)膜融合的方式，將其內(nèi)所含供體細(xì)胞內(nèi)容物傳遞至受體細(xì)胞，在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞間搭建起信號(hào)交流的橋梁，進(jìn)而影響受體細(xì)胞的基因表達(dá)和生理功能[7-9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在細(xì)菌感染過程中也發(fā)揮著重要作用。一方面，宿主細(xì)胞可通過水解病原菌，產(chǎn)生多類病原體相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）分子；后者可通過外泌體與受體細(xì)胞toll樣受體發(fā)生特異性結(jié)合，刺激細(xì)胞表達(dá)一系列促炎分子[10]。例如，Beatty等[11]發(fā)現(xiàn)被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞所釋放外泌體中含有結(jié)核分枝桿菌PAMPs（LAM和PIM），被感染外泌體可被未感染的巨噬細(xì)胞吞噬，引起后者白介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-10、γ-干擾素和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌增加[12]。另一方面，被感染的宿主細(xì)胞所分泌的外泌體內(nèi)含有特異性的病原分子[10]。例如，Singh等[13]發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者血清外泌體內(nèi)含有5 種分枝桿菌RNA（包括Rv2976和Rv1369c），這些RNA可抑制宿主細(xì)胞分泌促炎因子或釋放抗炎因子，從而抑制或誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡。

蛋白質(zhì)是外泌體的重要內(nèi)含物，其組成與來源細(xì)胞的生理狀態(tài)密切相關(guān)，蛋白質(zhì)組成的差異賦予了外泌體不同的生物學(xué)特性及功能。例如，沙門氏菌感染巨噬細(xì)胞外蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，巨噬細(xì)胞外泌體內(nèi)OTU去泛素化酶1的含量顯著增高，當(dāng)其作用于未感染巨噬細(xì)胞后，可引起TNF-α、調(diào)節(jié)的活化正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌、白細(xì)胞介素1受體拮抗劑、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1、趨化因子配體1等細(xì)胞因子的釋放[14]。此外，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法觀察經(jīng)結(jié)核分枝桿菌感染的J774細(xì)胞釋放外泌體的蛋白質(zhì)表達(dá)，共鑒定出41 種分枝桿菌蛋白，及一些宿主結(jié)核特異性膜蛋白和脂蛋白，這些特異性蛋白可刺激激活樹突狀細(xì)胞并促進(jìn)其抗原提呈[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)采用Label free蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，對(duì)沙門氏菌感染的外泌體宿主來源蛋白質(zhì)組成及其含量的變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析。外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)交流的重要途徑之一，闡明經(jīng)沙門氏菌感染后宿主細(xì)胞所釋放外泌體內(nèi)宿主蛋白質(zhì)的變化情況，可揭示沙門氏菌感染期間病理細(xì)胞與正常細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)交流的內(nèi)容，從而為進(jìn)一步的沙門氏菌感染及擴(kuò)散機(jī)制研究提供新的科學(xué)依據(jù)和素材。此外，本研究以外泌體的角度解釋機(jī)體細(xì)胞對(duì)沙門氏菌感染所產(chǎn)生生理變化的原因，對(duì)沙門氏菌感染機(jī)制研究提供了新的方向，旨在對(duì)預(yù)防沙門氏菌或其他食源性治病菌的感染提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

人腸上皮細(xì)胞Henle-407購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；野生型鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）LT2由西南大學(xué)李洪濤教授惠贈(zèng)；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基美國Corning公司；Gibco胎牛血清、胰蛋白酶、酵母提取物 美國Thermo公司；熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70抗體（鼠源）、四跨膜蛋白（cluster of differentiation，CD）9抗體（鼠源）、CD63抗體（鼠源）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗 美國System Biosciences公司；外泌體提取試劑盒（exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit）德國QIAGEN公司；慶大霉素、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒北京索萊寶科技有限公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒（ClarityTMWestern ECL Substrate） 美國Bio-Rad公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)皿等細(xì)胞培養(yǎng)耗材 美國Corning公司；HERACELL 150i CO2培養(yǎng)箱、RC-3BP＋大容量低速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；SpectraMax M5多功能讀板機(jī) 美國Molecular Device公司；TransBlot SD半干轉(zhuǎn)印槽 美國Bio-Rad公司；Tanon-5200Multi化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；高速離心機(jī) 日本Hitachi公司；0.8 μm濾膜 德國Sartorius公司；Tecnai Spirit T12透射電子顯微鏡 美國FEI公司；粒徑分析儀 廈門福流生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與感染

人腸上皮細(xì)胞Henle-407培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)單層細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)更換為無血清高糖DMEM培養(yǎng)基饑餓2 h，后續(xù)進(jìn)行沙門氏菌感染實(shí)驗(yàn)。將活化后的鼠傷寒沙門氏菌于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期收集菌體，以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為30加入Henle-407細(xì)胞內(nèi)為實(shí)驗(yàn)組（EXP），同時(shí)，以未感染沙門氏菌的Henle-407細(xì)胞為對(duì)照組（CK）。感染30 min后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液潤洗細(xì)胞2 次，用含有100 μg/mL慶大霉素的高糖DMEM培養(yǎng)細(xì)胞30 min以殺死培養(yǎng)皿中殘留的細(xì)胞外沙門氏菌。最后用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液潤洗細(xì)胞2 次后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)基上清液更換為含1 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)Henle-407細(xì)胞至8 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液。

1.3.2 外泌體分離

將所收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液于2 000×g、4 ℃離心20 min以去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，將離心后的上清液通過0.8 μm濾膜后，使用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit試劑盒提取外泌體。

1.3.3 蛋白免疫印跡分析

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法對(duì)外泌體樣本標(biāo)志性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，包括HSP70、CD9和CD63。即取50 μL外泌體樣本制備成樣品，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂乳粉封閉。將一抗按照體積比1∶1 000稀釋后于4 ℃孵育過夜。以等滲Tris-HCl緩沖鹽溶液（tris buffered saline with 0.1%Tween-20，TBST）洗滌3 次后加入體積比1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，用TBST溶液洗滌3 次，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，使用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)成像。

1.3.4 外泌體的透射電鏡分析

取10 μL外泌體樣本滴加至銅網(wǎng)上，室溫下靜置5 min后用濾紙吸去浮液，再用超純水清洗3 次，待其風(fēng)干之后滴加10 μL磷鎢酸于銅網(wǎng)上，靜置染色2 min之后用無塵濾紙吸去浮液，室溫靜置風(fēng)干，制成電鏡樣本，上機(jī)觀察。

1.3.5 蛋白質(zhì)提取及肽段酶解

外泌體樣本采用SDT（4 g/100 mL SDS，100 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl，0.1 mol/L二硫蘇糖醇）裂解法提取蛋白質(zhì)，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每個(gè)樣品取適量蛋白質(zhì)采用過濾輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，F(xiàn)ASP ）方法進(jìn)行胰蛋白酶酶解[18]，采用C18Cartridge對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶，肽段定量。

1.3.6 LC-MS/MS 數(shù)據(jù)采集

每份樣本采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap100，100 μm×2 cm，nanoViper C18），經(jīng)過分析柱（Thermo scientific EASY column，10 cm×75 μm，3 μm，C18-A2）分離，流速為300 nL/min。樣品經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍m/z300～1 800，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000，m/z為200，自動(dòng)增益控制為1×106，ITmax為50 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20 個(gè)碎片圖譜（MS2scan），MS2Activation Type為HCD，Isolation window為m/z2，二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500，m/z為200，Normalized Collision Energy為30 eV，Underfil為0.1%。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

利用BLAST2GO對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋，過程大致可以歸納為序列比對(duì)（BLAST）、GO條目提取、GO注釋和 InterProScan補(bǔ)充注釋4 個(gè)步驟。利用KAAS（京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Automatic Annotation Server）軟件，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋，采用Fisher精確檢驗(yàn)，比較各個(gè)GO分類或KEGG通路在目標(biāo)蛋白質(zhì)集合和總體蛋白質(zhì)集合中的分布情況，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行GO注釋或KEGG通路注釋的富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

對(duì)沙門氏菌感染及未感染的Hen-407細(xì)胞所分泌外泌體各提取3 次，記為3 組平行以進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。采用SPSS V18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)通過Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。本實(shí)驗(yàn)圖表均采用Origin及Adobe illustrator軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 外泌體的鑒定和表征

以經(jīng)沙門氏菌感染的Henle-407細(xì)胞所分泌外泌體為EXP組，同時(shí)以未感染的Henle-407細(xì)胞所分泌外泌體為CK組。為了對(duì)外泌體質(zhì)量進(jìn)行表征，本研究采用電鏡、蛋白質(zhì)免疫印跡和納米粒子追蹤分析3 種方法對(duì)沙門氏菌感染或未感染的宿主細(xì)胞所釋放外泌體進(jìn)行鑒定和分析。外泌體電鏡結(jié)果如圖1a所示，所提取外泌體直徑約100 nm，呈橢圓形茶杯狀囊泡結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道的外泌體形態(tài)特征一致[19]。為了分析所獲得外泌體的特異性，根據(jù)文獻(xiàn)[20]，選取CD9、CD63及HSP70作為外泌體標(biāo)志蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，同時(shí)以Henle-407細(xì)胞全蛋白（C）、細(xì)胞培養(yǎng)基上清液（M）、過試劑盒后細(xì)胞培養(yǎng)基上清液（S）作為對(duì)照，結(jié)果如圖1b所示，在EXP組和CK組外泌體中均成功檢測(cè)到這3 種外泌體特異標(biāo)志物的表達(dá)，而在細(xì)胞培養(yǎng)基上清液和過試劑盒后的培養(yǎng)基上清液中這3 種蛋白的表達(dá)量明顯偏低或沒有，表明本研究所提樣本明確包含有外泌體。接著，為了進(jìn)一步表征EXP組與CK組外泌體樣本中外泌體的純度與質(zhì)量，采用納米粒子追蹤分析法對(duì)外泌體樣本進(jìn)行粒徑分布分析，結(jié)果如圖1c所示，兩組外泌體樣本粒徑范圍均分布于30～150 nm之間，其中CK組峰值為79.75 nm，平均粒徑90.35 nm，濃度為5.06×109particles/mL；EXP組峰值為76.75 nm，平均粒徑81.38 nm，濃度為7.78×109particles/mL，均符合外泌體的粒徑范圍，表明本次實(shí)驗(yàn)所提取樣本外泌體純度良好。綜上所述，從形態(tài)特征、標(biāo)志蛋白表達(dá)和粒徑分布3 個(gè)方面的數(shù)據(jù)可知，本研究所提取外泌體樣本純度良好，質(zhì)量較高。最后，為了對(duì)所提外泌體樣本的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行平行性檢測(cè)，利用SDS-PAGE對(duì)3 次所提取外泌體進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1d所示。各個(gè)平行樣品的SDS-PAGE圖條帶分布正常，樣品之間平行性較好，且蛋白提取樣本量足夠，樣品純度良好，適于進(jìn)行后續(xù)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)。

圖1 外泌體的鑒定及表征Fig. 1 Identification and characterization of exosomes

2.2 差異表達(dá)蛋白的篩選及聚類分析

采用Label free相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)兩組外泌體樣本進(jìn)行比較分析。經(jīng)質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)理論數(shù)據(jù)庫比對(duì)后，如圖2a所示，共鑒定到2 490 種蛋白質(zhì)，包括CK組蛋白2 151 種，EXP組蛋白質(zhì)1 615 種，兩組共有蛋白1 276 種。共有蛋白中采取以倍數(shù)變化大于2.0 倍（上調(diào)大于2 倍或下調(diào)小于0.5 倍）且P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白。如圖2b所示，EXP組與CK組外泌體中共有的差異表達(dá)蛋白有7 種，包括3 種表達(dá)上調(diào)蛋白和4 種表達(dá)下調(diào)蛋白（表1）。發(fā)現(xiàn)上述7 種蛋白中有4 種蛋白與細(xì)胞增殖有關(guān)，分別為上調(diào)蛋白GOLM1、BTF3與下調(diào)蛋白EBNA1BP2、U2AF1L5。

圖2 沙門氏菌感染與未感染宿主細(xì)胞外泌體差異蛋白Venn（a）及火山圖（b）Fig. 2 Venn (a) and volcano maps (b) of DEPs in host cell exosomes infected and not infected with S. typhimurium

表1 EXP組與CK組共有的差異表達(dá)蛋白Table 1 Shared DEPs between infected and non-infected groups

沙門氏菌感染與腸上皮細(xì)胞的增殖和凋亡具有拮抗作用。一方面，沙門氏菌可通過激活宿主細(xì)胞AKT/mTOR信號(hào)通路抑制因細(xì)菌入侵介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，為沙門氏菌在細(xì)胞內(nèi)的存活提供條件[21]。GOLM1是AKT/mTOR信號(hào)通路的正向調(diào)控因子，使用siRNA沉默GOLM1的內(nèi)源性表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞的增殖被抑制，細(xì)胞凋亡增加，而高表達(dá)GOLM1的腫瘤細(xì)胞增值和遷移更快，細(xì)胞凋亡減少[22-23]。GOLM1主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的合成后修飾并協(xié)助高爾基體完成對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌[24]，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖?；诖?，推測(cè)沙門氏菌可能通過對(duì)外泌體中GOLM1蛋白的上調(diào)調(diào)控并抑制臨近細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)沙門氏菌的繁殖。此外，JAK2/STAT3信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡中也起到關(guān)鍵作用，STAT3的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[25]。BTF3是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其可通過激活JAK2/STAT3信號(hào)通路參與胃癌上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、刺激細(xì)胞增殖[26]。同樣，推測(cè)BTF3蛋白于EXP組外泌體內(nèi)的表達(dá)量增高會(huì)起到與GOLM1蛋白類似的作用，即通過調(diào)控受體細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減緩宿主細(xì)胞凋亡速率，從而為沙門氏菌的繁殖提供合適的宿主環(huán)境。

而另一方面，被感染的腸上皮細(xì)胞可通過啟動(dòng)自身程序性死亡以清除其內(nèi)含沙門氏菌，進(jìn)而抑制沙門氏菌的繁殖[27]。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與rRNA、mRNA成熟過程相關(guān)的核仁蛋白EBNA1BP2和U2AF1L5在EXP組外泌體內(nèi)分別下調(diào)至0.15 倍和0.45 倍。EBNA1BP2可通過對(duì)pre-rRNA的加工參與核糖體40S和60S亞單位的合成，若將該基因沉默，細(xì)胞增殖將受到嚴(yán)重抑制[28-29]。U2AF1L5是一種RNA剪接體復(fù)合物蛋白，參與pre-mRNA至成熟mRNA的剪接過程[30]，下調(diào)U2AF1L5的蛋白表達(dá)可損害細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，誘導(dǎo)G2/M期阻滯，降低細(xì)胞增殖速率[31]。由此，推測(cè)經(jīng)沙門氏菌感染的宿主細(xì)胞可通過外泌體降低鄰近細(xì)胞的增殖速率，為接下來細(xì)胞的程序性死亡提供前期引導(dǎo)，以達(dá)到抑制沙門氏菌感染的作用。

表2 EXP組外泌體中特異性存在的蛋白Table 2 Specific proteins in exosomes from the infected group

尤為重要的是，在篩選差異表達(dá)蛋白的過程中發(fā)現(xiàn)，以EXP組（或CK組）樣品3 次平行中2 次以上不為空值；CK組（或EXP組）樣品中3 次平行均為空值的條件篩選差異表達(dá)蛋白，稱其為非共有蛋白，共得到314 種蛋白質(zhì)。其中，與CK組外泌體相比，在EXP組外泌體中特異性存在的蛋白有9 種（表2），而缺失的蛋白卻多達(dá)305 種（未表出）。在特異性存在的9 種蛋白中，與細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)相關(guān)的2 種蛋白（CALD1與MARCKSL1）尤為重要。在感染初期，沙門氏菌可通過其T3SS分泌的效應(yīng)蛋白刺激宿主細(xì)胞骨架重排，使細(xì)菌內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞[32]，而肌動(dòng)蛋白是其作用的重要靶點(diǎn)。CALD1蛋白在其C端具有鈣調(diào)蛋白、原肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的結(jié)合區(qū)[33]，其可通過刺激肌動(dòng)蛋白而促使細(xì)胞骨架重排[34]。同樣，MARCKSL1也是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，主要在未成熟腦中表達(dá)[35]，MARCKSL1蛋白在廣泛的癌癥類型中被上調(diào)，但其在沙門氏菌感染后于宿主細(xì)胞所分泌外泌體中特異性表達(dá)屬首次發(fā)現(xiàn)。MARCKSL1蛋白可與肌動(dòng)蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白束，使細(xì)胞骨架重排，促進(jìn)細(xì)胞遷移[36]。調(diào)控宿主細(xì)胞骨架重排是沙門氏菌能否被成功內(nèi)化的關(guān)鍵。以上2 個(gè)蛋白在被沙門氏菌感染的外泌體中特異性表達(dá)，推測(cè)沙門氏菌感染極有可能特異性激活宿主細(xì)胞CALD1與MARCKSL1的表達(dá)，并使其通過外泌體調(diào)節(jié)臨近細(xì)胞的細(xì)胞骨架，進(jìn)而幫助沙門氏菌在腸上皮細(xì)胞中的感染和擴(kuò)散。

2.3 差異蛋白質(zhì)GO功能富集分析

為進(jìn)一步了解腸上皮細(xì)胞在沙門氏菌感染后所釋放外泌體內(nèi)差異表達(dá)蛋白的生物學(xué)功能，采用BLAST2Go軟件對(duì)本研究鑒定的所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)（共321 種差異表達(dá)蛋白，包括7 種共有蛋白和314 種非共有蛋白）進(jìn)行GO功能注釋，然后通過Fisher精確檢驗(yàn)方法對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能富集分析。從生物過程、細(xì)胞組成和分子功能3 個(gè)分類進(jìn)行富集分析，如圖3所示，外泌體內(nèi)宿主來源差異表達(dá)蛋白主要參與代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生和定位等生物過程，主要為細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)復(fù)合物的組成成分，具有結(jié)合、催化、轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等分子功能。

GO分析表明，其中一部分宿主來源差異表達(dá)蛋白參與生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分組織和定位3 種生物過程，位于細(xì)胞器、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)復(fù)合物3 種細(xì)胞組分分類，可發(fā)揮結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、分子結(jié)構(gòu)等分子功能，如四跨膜蛋白超家族（CD9、CD63、CD81和CD82）、HSP、核糖體蛋白等。猜測(cè)此類蛋白極大可能與細(xì)胞內(nèi)外泌體的產(chǎn)生及外泌體內(nèi)含蛋白的篩選有關(guān)，而剩余其他蛋白（如肌動(dòng)蛋白、高爾基體膜蛋白、黏附蛋白等）可能與沙門氏菌感染特異性相關(guān)。結(jié)合EXP組與CK組外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)的數(shù)量差異（存在314 個(gè)非共有蛋白）與所提樣本外泌體濃度的差異（EXP組7.78×109particles/mL明顯大于未EXP組5.06×109particles/mL），猜測(cè)沙門氏菌感染一方面抑制宿主細(xì)胞蛋白向外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)，另一方面刺激被感染細(xì)胞釋放更多特異性外泌體，進(jìn)而幫助沙門氏菌在腸上皮細(xì)胞中感染和擴(kuò)散。

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG通路富集分析

在生物體中，蛋白質(zhì)并不獨(dú)立行使其功能，而是不同蛋白質(zhì)相互協(xié)調(diào)完成一系列生化反應(yīng)以行使其生物學(xué)功能。為進(jìn)一步了解宿主細(xì)胞外泌體受到沙門氏菌感染時(shí)其代謝通路的具體信息，本研究對(duì)上述321 種外泌體宿主來源的蛋白質(zhì)進(jìn)行了KEGG通路分析。在P＜0.05的范圍內(nèi)，有113 種蛋白與17 條KEGG通路相關(guān)。如圖4所示，最顯著的5 條途徑分別為脂肪酸降解、產(chǎn)熱、蛋白質(zhì)合成、精氨酸及脯氨酸代謝和三羧酸循環(huán)。參與其途徑的差異表達(dá)蛋白分別為10、19、7、7、8 種，富集因子分別為0.4、0.26、0.41、0.37和0.33。KEGG通路富集數(shù)據(jù)顯示，參與這5 條通路的相關(guān)差異表達(dá)蛋白均為EXP組缺失蛋白，由此，推測(cè)在沙門氏菌感染期間宿主細(xì)胞中此5 種代謝途徑均受到嚴(yán)重抑制。從沙門氏菌角度講，侵入宿主細(xì)胞內(nèi)的沙門氏菌的生長和繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)均需從宿主細(xì)胞內(nèi)獲得，因此，抑制宿主細(xì)胞相關(guān)代謝途徑有利于沙門氏菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)如脂肪酸、葡萄糖和氨基酸等物質(zhì)的占據(jù)和掠奪。研究表明，在侵入宿主細(xì)胞后沙門氏菌體內(nèi)對(duì)精氨酸的合成量顯著降低[37]，結(jié)合本研究KEGG數(shù)據(jù)（精氨酸及脯氨酸代謝通路被抑制），推測(cè)沙門氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)通過抑制宿主細(xì)胞對(duì)精氨酸的代謝達(dá)到對(duì)細(xì)胞內(nèi)精氨酸的占有及利用，以補(bǔ)充自身的合成空缺。同樣，脂肪酸降解、產(chǎn)熱、蛋白質(zhì)合成和三羧酸循環(huán)途徑均為宿主細(xì)胞利用自身營養(yǎng)物質(zhì)的過程，此4 條代謝通路受到抑制可使宿主細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的利用顯著降低進(jìn)而有利于沙門氏菌的生長和繁殖。從宿主細(xì)胞角度講，三羧酸循環(huán)途徑與蛋白質(zhì)合成途徑是細(xì)胞生長增殖所需能量和蛋白的直接來源，此2 條途徑同時(shí)受阻無疑會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞生長。此外，研究表明脂肪酸降解途徑受阻將直接抑制細(xì)胞的生長和增殖[38]。由此，推測(cè)沙門氏菌感染會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞增殖減緩，此結(jié)果與文獻(xiàn)[39]報(bào)道基本一致。

圖3 差異蛋白質(zhì)GO分類圖Fig. 3 GO classification of DEPs

圖4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)KEGG通路富集分析圖Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis of DEPs

2.5 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性驗(yàn)證

Western bloting技術(shù)是驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的最佳方法。本實(shí)驗(yàn)利用Western bloting技術(shù)以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為對(duì)照，挑選上調(diào)蛋白GOLM1（5.5 倍）、下調(diào)蛋白EBP2（0.15 倍）和EXP組外泌體特異性表達(dá)蛋白GAPDHS以驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性。如圖5所示，在EXP組外泌體中此3 個(gè)蛋白表達(dá)情況與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)基本一致，表明本研究蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果真實(shí)可靠。

圖5 沙門氏菌感染與未感染外泌體內(nèi)關(guān)鍵差異蛋白Western bloting驗(yàn)證結(jié)果Fig. 5 Western blotting validation of key DEPs in exosomes infected and not infected with S. typhimurium

3 討 論

利用Label free相對(duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法系統(tǒng)分析了沙門氏菌感染后宿主細(xì)胞外泌體內(nèi)宿主來源蛋白質(zhì)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，EXP組與CK組外泌體共有蛋白中有7 種蛋白質(zhì)的含量變化在2.0 倍以上；相比于CK組，EXP組外泌體中特異性增加了9 種蛋白質(zhì)，而缺失的蛋白質(zhì)卻多達(dá)305 種。GO分析表明差異蛋白主要參與細(xì)胞過程、代謝過程和生物調(diào)節(jié)過程，與結(jié)合、催化和轉(zhuǎn)運(yùn)等分子功能有關(guān)。KEGG分析表明差異蛋白主要富集在17 種代謝通路中。其中，與脂肪酸降解、產(chǎn)熱、精氨酸與脯氨酸代謝、蛋白質(zhì)合成和三羧酸循環(huán)途徑有關(guān)的蛋白質(zhì)均為EXP組缺失蛋白。由此可見，沙門氏菌感染對(duì)宿主細(xì)胞外泌體內(nèi)的蛋白組成具有直接調(diào)控作用。

在沙門氏菌感染過程中，沙門氏菌與宿主細(xì)胞之間存在互相對(duì)抗，而宿主細(xì)胞所產(chǎn)生外泌體是沙門氏菌與宿主細(xì)胞所共同調(diào)控的結(jié)構(gòu)。從沙門氏菌角度講，本研究推測(cè)在沙門氏菌感染過程中，被感染宿主細(xì)胞所釋放的外泌外可作為沙門氏菌侵染的先鋒軍。在鄰近細(xì)胞被沙門氏菌侵染前，EXP組外泌體可提前被鄰近細(xì)胞所吸收，其內(nèi)含特異性存在的CALD1與MARCKSL1蛋白可通過肌動(dòng)蛋白促進(jìn)鄰近細(xì)胞骨架重排，有利于接下來沙門氏菌的侵染。之后，共有蛋白中表達(dá)上調(diào)的GOLM1和BTF3蛋白可通過調(diào)節(jié)鄰近細(xì)胞AKT/mTOR、JAK2/STAT3與FOXM1信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，為接下來的沙門氏菌在細(xì)胞內(nèi)的繁殖創(chuàng)造條件。此外，結(jié)果顯示，沙門氏菌感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞所釋放外泌體內(nèi)宿主來源蛋白質(zhì)相比于CK組缺失達(dá)305個(gè)，并且結(jié)合上述GO分析結(jié)果。本研究推測(cè)，在沙門氏菌感染過程中，沙門氏菌極有可能抑制了宿主細(xì)胞外泌體對(duì)宿主來源來源蛋白的攝取，以阻礙感染細(xì)胞與正常細(xì)胞間的正常信息傳遞從而為沙門氏菌感染創(chuàng)造條件。KEGG分析結(jié)果——脂肪酸降解、產(chǎn)熱、精氨酸與脯氨酸代謝、蛋白質(zhì)合成和三羧酸循環(huán)途徑有關(guān)差異表達(dá)蛋白均為EXP組缺失蛋白也證明了這一推論。

從宿主細(xì)胞角度講，被感染宿主細(xì)胞所釋放外泌體也可作為其向鄰近細(xì)胞傳遞信號(hào)的載體。例如，共有蛋白中表達(dá)下調(diào)的EBNA1BP2和U2AF1L5蛋白可通過調(diào)節(jié)mRNA的成熟抑制鄰近及宿主細(xì)胞的增殖，以增強(qiáng)宿主細(xì)胞程序性死亡清除沙門氏菌的作用。但此作用能否成功發(fā)揮，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，因?yàn)樽鳛樯抽T氏菌感染后宿主細(xì)胞向細(xì)胞外釋放的信息載體，外泌體所包含的信息內(nèi)容十分豐富，既存在有利于沙門氏菌存活的部分，也存在有利于宿主細(xì)胞清除沙門氏菌的部分，體現(xiàn)了沙門氏菌與宿主細(xì)胞間的拮抗作用。此外，本研究推測(cè)，包含有沙門氏菌特異性蛋白質(zhì)組的外泌體被巨噬細(xì)胞吞噬后，極有可能刺激巨噬細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)沙門氏菌的清除作用。類似現(xiàn)象已于結(jié)核分枝桿菌感染過程中發(fā)現(xiàn)，被結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞所釋放外泌體可誘導(dǎo)CD4/CD8T細(xì)胞產(chǎn)生THI型免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的清除作用[40]。

沙門氏菌作為全球主要的食源性病原菌之一，對(duì)人類健康和食品安全具有嚴(yán)重影響，然而，有效抑制沙門氏菌疾病的方法仍然有限，研發(fā)用于預(yù)防及治療沙門氏菌感染的有效藥劑仍是食品相關(guān)行業(yè)的重中之重。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)沙門氏菌感染期間宿主細(xì)胞產(chǎn)生外泌體中所含宿主來源的蛋白質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，全面了解宿主細(xì)胞對(duì)細(xì)菌感染的反應(yīng)以及細(xì)胞間通訊的內(nèi)容，提供了沙門氏菌-宿主細(xì)胞-其他靶細(xì)胞相互作用的新思路與新靶點(diǎn)。外泌體作為一種雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)，其可作為傳遞藥物的天然載體，了解其內(nèi)部構(gòu)成，可為挖掘外泌體的藥物載體功能，開發(fā)抗感染藥物或保健食品提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。