田 晏，侯召華

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院，山東 濟南 250353）

冬棗（Ziziphus jujubaMill.cv. Dongzao）為鼠李科棗屬冬棗植物的果實，果皮較薄，果肉脆嫩多汁，口感鮮甜，主要種植于山東沾化一帶，是我國特有的品種[1]，因其采摘時氣溫較低，故稱之為冬棗[2]。冬棗含有多種人體必需氨基酸[3]及微量元素，維生素含量較高[4]，深受廣大消費者喜愛。蛋白質組學是后基因組時代出現的一個新的研究領域，是研究細胞、組織或生物體蛋白質組成及其變化規(guī)律的新技術，可用于研究植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫的響應及發(fā)病機理等[5]。蛋白質作為功能執(zhí)行體，是基因表達的直接產物[6]。與轉錄組相比，蛋白質組能更直接地反映植物基因的表達狀態(tài)。目前已有將蛋白質組學技術應用于枇杷[7]、葡萄[8]、荔枝[9]、石榴[10]等果品的相關報道。在冬棗果實生長發(fā)育過程中，果皮由綠色向黃白、紅色轉變，隨著果皮中可溶性固形物、香氣物質、色素相關物質的持續(xù)積累，相關基因表達及蛋白質合成也出現相應變化[11]。目前以冬棗果實發(fā)育過程蛋白質組為研究對象的報道較少，且數據庫不夠完整，因此有必要對冬棗果實成熟過程的蛋白質表達特性開展深入研究。

本研究以‘沾冬2號’冬棗為研究對象，利用非標記定量蛋白質組學技術，通過液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）和最新數據庫檢索，比較冬棗果實4 個階段差異蛋白質表達特征，結合生物學代謝通路分析，篩選出冬棗果實的關鍵代謝通路及重要差異蛋白，以期從蛋白質水平闡明果實的發(fā)育機制，為研究冬棗的成熟發(fā)育機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冬棗果實品種為‘沾冬2號’（Ziziphus jujubaMill.‘Zhandong 2’），2020年7—10月采于山東省濱州市沾化區(qū)。在4 個生長發(fā)育階段，即幼果（DE01）、膨大期果實（DE02）、白熟期果實（DE03）、脆熟期果實（DE04）分別采集果實（圖1），樣品用液氮速凍粉碎后，置－80 ℃冰箱貯藏備用。

胰蛋白酶 普洛麥格北京生物技術有限公司；二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、尿素、碳酸氫銨（均為分析純） 美國Sigma公司；三氟乙酸（分析純），乙腈、甲醇、甲酸、乙酸（均為質譜級） 美國Thermo Fisher公司。

圖1 不同生長階段的冬棗果實Fig. 1 Winter jujube fruits at different developmental stages

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000 RSLC Nano液相色譜儀、Q Exactive HF納升液相色譜-四極桿串聯(lián)靜電場軌道阱超高分辨質譜儀（Orbitrap 240000FWHM） 賽默飛世爾科技有限公司；Allgera X-30R冷凍高速離心機 美國Beckman公司；BTP8ZL真空冷凍干燥器 美國SP Scientific公司；BILON-650Y超聲波細胞粉碎機 上海比朗儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

選擇大小均勻、無病蟲害、無機械傷的幼果期果實（DE01A、DE01B、DE01C），膨大期果實（DE02A、DE02B、DE02C），白熟期果實（DE03A、DE03B、DE03C），脆熟期果實（DE04A、DE04B、DE04C），去除棗核后液氮速凍，粉碎，－80 ℃冰箱貯藏備用。每一階段樣品分別進行3 個生物學重復。

1.3.2 蛋白質提取及肽段酶解

參考文獻[12]的方法，并略作改進。稱取3 g樣品粉末于50 mL離心管，加入5 倍體積－20 ℃預冷丙酮；勻漿混勻后于－20 ℃靜置4 h以上；4 ℃、10 000×g離心30 min，棄上清液；沉淀用100%預冷丙酮5 mL，清洗3 次；4 ℃、10 000×g離心15 min；沉淀用氮氣吹干后，得蛋白質粗提物。取0.25 g蛋白質樣品，溶于2.5 mL尿素裂解液（5 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、2% SB-3-10、1% PMSF、20 mmol/L二硫蘇糖醇），超聲波破碎處理（50%功率，工作2 s，間歇3 s，循環(huán)5～10 min）；處理后，20 ℃、14 000×g離心40 min，得上清液；0.45 μm濾膜過濾，得蛋白質溶液，考馬斯亮藍法定量分析，－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

各組樣品按超濾輔助樣品制備法進行胰蛋白酶酶解[13]，通過C18Cartridge固相萃取柱對酶解肽段脫鹽，供液相色譜檢測。

1.3.3 LC-MS/MS檢測

樣品酶解后，采用Q Exactive HF納升液相色譜對酶解肽段混合物進行質譜分析。

NanoViperC18色譜柱（75 μm×15 cm，2 μm）；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為0.1%甲酸-80%乙腈溶液；流速300 nL/min；梯度洗脫：120 min；0～3 min，96% A、4% B；3～100 min，96%～66% A、4%～34% B；100～115 min，66%～55% A、34%～45% B；115～120 min，1% A、99% B。

質譜采用離子源為陽離子模式、DDA模式數據采集，得到LC-MS/MS原始數據，用軟件Proteome Discoverer 2.2（PD2.2）搜庫鑒定，并進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

用Perseus軟件（版本號1.6.5.0）和悟空快速查看與分析數據云平臺（https://wkomics.Omicsolution.com）對PD搜庫數據結果進行顯著分析、主成分分析（principle component analysis，PCA）。對蛋白質含量豐度進行數值質控，變異系數不大于0.2，數值轉化log2-transformed，Z-scores中心化，并且缺失值正態(tài)分布填充（width 0.3, downshift 1.8）；Benjamini-Hochberg FDR＜0.01。差異倍數（fold change，FC）≥2，P＜0.05或FC≤0.5，P＜0.05，差異顯著。

1.5 生物信息學分析

用Uniprot蛋白數據庫（http://www.ebi.uniprot.org）對所鑒定到的蛋白質進行基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋，依據蛋白質參與的生物學過程、細胞學組分和分子功能屬性，與各自的前一階段比較，利用在線分析軟件Omicsbean（http://www.omicsbean.cn）對冬棗果實不同發(fā)育階段出現的差異蛋白分別進行GO、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）注釋富集分析以及蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）分析，挖掘冬棗果實在發(fā)育過程中由差異蛋白表達變化導致發(fā)生改變的重要代謝信號通路。

2 結果與分析

2.1 蛋白質鑒定及相對定量

采用Proteome Discoverer 2.2軟件對冬棗蛋白質質譜進行檢索，篩選出可信度水平在95%以上的蛋白質共2 107 個；根據3 次重復實驗中至少2 次鑒定到同一蛋白的原則，從4 個發(fā)育階段分別鑒定到2 095、2 039、2 065、2 042 個蛋白質，其中定量1 986 個，占總數的94.26%。冬棗果實發(fā)育過程中差異表達蛋白質的數量分布和差異如圖2A所示，其中DE01組和DE02組共有差異表達蛋白質2 033 個，DE02組和DE03組共有差異表達蛋白質2 021 個，DE03組和DE04組共有差異表達蛋白質2 029 個。

圖2 發(fā)育過程中冬棗樣品的蛋白質差異Fig. 2 Venn diagram and PCA plot for differentially expressed proteins in winter jujube samples between different developmental stages

為進一步揭示不同發(fā)育階段冬棗果實的蛋白質差異性，對4 個不同發(fā)育階段果實的蛋白質數據進行PCA（圖2B），變量PC1、PC2累計貢獻率達86.7%。12 個樣本被顯著的分為4 類，依次為：DE01A、DE01B、DE01C，DE02A、DE02B、DE02C，DE03A、DE03B、DE03C，DE04A、DE04B、DE04C，表明不同發(fā)育階段的冬棗果實蛋白質存在顯著差異，且生物學重復之間具有密切的相關性。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 不同發(fā)育階段蛋白鑒定結果

對4 組蛋白質進行方差分析，使用t檢驗對表達強度進行比較。結果顯示，與各自的前一階段相比，在膨大期、白熟期、脆熟期果實中差異表達蛋白數分別為96、185、138 個（表1）。對差異表達蛋白質進行生物信息學分析，Level 3水平上進行GO、KEGG分析及PPI分析，參考擬南芥進行映射。

表1 不同階段差異表達蛋白的數量Table 1 Number of differentially expressed proteins between different developmental and ripening stages

2.2.2 差異表達蛋白的GO注釋及富集分析

使用GO功能分類系統(tǒng)對3 組對比的差異蛋白進行生物過程、細胞組分和分子功能分析，以明確差異表達蛋白參與行使的功能。GO表明，DE02 vs DE01差異表達蛋白主要參與的生物過程有單一生物細胞過程、單一生物代謝過程、化學響應、壓力響應、細胞成分組織；經細胞組分分析發(fā)現，差異表達蛋白主要富集在細胞內、細胞外部分、膜結合細胞器、細胞周圍；差異表達蛋白的分析功能主要包括氧化還原酶活性、蛋白質結合、水解酶活性等（圖3A）。

圖3 GO功能注釋及富集分析Fig. 3 Functional annotation and enrichment analysis using GO

DE03vs DE02差異表達蛋白主要參與的生物過程有單一生物代謝過程、單一生物細胞過程、壓力響應、細胞成分組織、化學響應；經細胞組分分析發(fā)現，差異表達蛋白主要富集在細胞內、細胞外部分、膜結合細胞器、細胞周圍；差異表達蛋白的分析功能主要包括蛋白質結合、氧化還原酶活性、核糖體結構組成、輔助因子結合等（圖3B）。

DE04 vs DE03差異表達蛋白主要參與的生物過程有單一生物細胞過程、單一生物代謝過程、生物合成的過程、細胞成分組織、壓力響應；經細胞組分分析發(fā)現，差異表達蛋白主要富集在細胞內、細胞外部分、膜結合細胞器；差異表達蛋白的分析功能主要包括蛋白質結合、氧化還原酶活性、核糖體結構組成等（圖3C）。

2.2.3 KEGG注釋富集分析

KEGG通路分析為探討蛋白參與的生物學代謝通路及其潛在的作用提供了重要信息，表2～4中分別列出了DE02 vs DE01組、DE03 vs DE02組、DE04 vs DE03組富集途徑重要差異表達蛋白的定量信息。冬棗果實各發(fā)育階段中差異表達蛋白質的顯著富集代謝通路（P＜0.05）如圖4所示。圖4A表明，DE02 vs DE01的差異表達蛋白質，類黃酮生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成、光合作用和苯丙烷類生物合成等重要代謝通路存在顯著差異。圖4B表明，DE03 vs DE02的差異表達蛋白質，光合作用、核糖體、乙醛酸和二羧酸代謝等重要代謝通路存在顯著差異。圖4C表明，DE04 vs DE03的差異表達蛋白質，光合作用、類黃酮生物合成、核糖體、脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝和脂肪酸降解等重要代謝通路存在顯著差異。

表2 DE02 vs DE01組的差異蛋白質富集的代謝通路Table 2 KEGG pathway of differentially expressed proteins in DE02 vs DE01

表3 DE03 vs DE02組的差異蛋白質富集的代謝通路Table 3 KEGG pathway of differentially expressed proteins in DE03 vs DE02

表4 DE04 vs DE03組的差異蛋白質富集的代謝通路Table 4 KEGG pathway of differentially expressed proteins in DE04 vs DE03

圖4 KEGG富集分析Fig. 4 KEGG enrichment pathway

2.2.4 PPI網絡

圖5 不同發(fā)育時期差異蛋白網絡互作Fig. 5 Interaction networks of differentially expressed proteins between different developmental periods

在生物體中，蛋白質功能的行使必須借助于其他蛋白質的調節(jié)和介導。這種調節(jié)或介導作用的實現首先要求蛋白質之間有相互作用。研究蛋白質之間的相互作用及其形成的網絡對于揭示蛋白質的功能具有重要意義[14]。圖5中圓點紅色表示差異顯著性高，綠色表示差異顯著性低；方框藍色表示富集顯著性高，黃色表示富集顯著性低。實線表示2 個蛋白質有直接的互作關系，虛線表示有間接的互作關系。與蛋白關聯(lián)的線條數量越多，表明該蛋白在網絡中越關鍵。冬棗果實不同發(fā)育時間的差異蛋白彼此間與互作網絡數據庫收錄的其他蛋白間聯(lián)系緊密，主要相關通路為光合作用、類黃酮生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、苯丙烷類生物合成以及核糖體等途徑。

3 討 論

冬棗4 個不同發(fā)育成熟過程（DE01、DE02、DE03、DE04）中，參與光合作用、苯丙烷類生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成、類黃酮生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝以及核糖體合成等生物學過程的蛋白質差異顯著，這些代謝過程在果實品質形成過程中起重要調節(jié)作用。

3.1 冬棗果實發(fā)育中與光合作用相關蛋白質

4 個時期差異蛋白共同顯著富集在光合作用途徑，說明光合作用途徑貫穿并調控冬棗果實的生長發(fā)育過程。光合作用可為植物生長提供能量、作為環(huán)境信號調節(jié)植物自身生長發(fā)育的形態(tài)，以增強植物對環(huán)境的適應能力。光系統(tǒng)I是一種色素-蛋白質復合體，可介導類囊體膜上的光驅動電子從可溶性電子供體（質體藍素）到可溶性電子受體（鐵氧還蛋白）的傳遞[15]。冬棗果實發(fā)育過程中，光合作用中光系統(tǒng)II的PsbA、PsbB、PsbC、PsbH不同程度的下調，涉及光系統(tǒng)I的PSAD2、PSAE2、PasA、PsaC表達也受抑制。冬棗果實發(fā)育初期富含葉綠素，光合作用相關蛋白質出現極顯著表達，而在果實膨大、轉色成熟過程中，相關蛋白質穩(wěn)定下降。質體藍素是高等植物中為細胞色素b6/f復合體與光系統(tǒng)I之間傳遞電子的一種含銅原子的蛋白質，位于類囊體膜內表面，是光合鏈中的重要成員[16]。冬棗DE03階段質體藍素的表達量高于DE02階段，質體藍素作為光系統(tǒng)I的電子供體，使電子經鐵氧還蛋白催化NADP＋生成NADPH，從而完成光反應電子鏈的最后一步。細胞色素b6是細胞色素b6-f復合物的組成部分，介導光系統(tǒng)II和光系統(tǒng)I之間的電子轉移，光系統(tǒng)I周圍的循環(huán)電子流動以及狀態(tài)轉換，它參與光誘導的光合電子傳遞，起電子載體的作用[17]。果實發(fā)育中后期細胞色素b6表達升高，在光合作用逐漸降低的情況下，有助于冬棗果實發(fā)育后期的能量轉化和利用。

3.2 冬棗果實發(fā)育中與苯丙烷類生物合成相關蛋白質

苯丙烷類化合物是碳和能量流的重要途徑，用于維持黃酮類生物合成能量和碳骨架[18]。本研究中類β-葡萄糖苷酶11亞型X1在苯丙烷類生物合成途徑中被上調，類β-葡萄糖苷酶11亞型X1正向調控順-2-羥基肉桂酸酯，從而合成在冬棗果實發(fā)育中起保護素作用的香豆素化合物。同時，過氧化物酶在此途徑的最后一步反應木質素單體催化聚合為木質素，提高植物對病原菌侵害和逆境脅迫的抵御力[19]。苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammonialyase，PAL1）是苯丙素生物合成途徑的關鍵酶[20]，PAL1在合成途徑的前端催化苯丙氨酸直接脫氨基轉化為反式肉桂酸，反式肉桂酸是植物苯丙烷類次生代謝物生物合成的起始物，能反饋抑制PAL1的活性，苯丙烷類代謝途徑酶系可能受其影響[21]。PAL1調控木質素和類黃酮合成，PAL1活性降低，類黃酮含量隨之減少，從而提高冬棗果實的木質素活性。幼果期冬棗過氧化物酶和類β-葡萄糖苷酶11亞型X1表達量上調能正向調節(jié)冬棗果實生長活動，調控木質素合成與積累，提高冬棗在發(fā)育初期的抗病抗逆境脅迫力。DE02 vs DE01階段中，檸檬烯和蒎烯降解，芪類、二芳基庚酸和姜酚的生物合成顯著富集，說明這些途徑對冬棗果實發(fā)育以及抗擊逆境意義重大。

3.3 冬棗果實發(fā)育中與類黃酮生物合成相關蛋白質

類黃酮化合物是植物重要的次生代謝物，具有化學信使和抗氧化劑等多種生物學功能。黃烷醇類物質是類黃酮物質的亞類，在果實呈現綠色時大量合成，隨著冬棗果皮著色，類黃酮、葉綠素含量逐漸降低[22]。查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）是參與類黃酮生物合成的第一個關鍵酶，可催化對香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成查耳酮，進一步衍生出類黃酮化合物[23]，直接影響類黃酮色素的積累。查耳酮合酶超家族（chalcone synthase superfamily，CHI1）在植物中合成各種次生代謝物，提高植物早期進化過程中對環(huán)境脅迫的抵御力。黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是黃酮類化合物合成途徑的關鍵酶，可催化柚皮素合成，為黃酮醇、花青素的前體的合成提供原料[24]。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）在花青素合成下游途徑中將二氫黃酮醇轉變?yōu)榛ㄇ嗨剀辗磻牡谝粋€酶，直接調控花青素合成[25]?；ㄇ嗨剡€原酶（anthocyanidin reductase，BAN）對花青素的生物合成有重要的調控作用，且其在冬棗生長發(fā)育過程中的表達模式與花青素的合成呈現負相關，是花青素積累中關鍵的負調控因子[26]。本研究中，冬棗果實發(fā)育過程中CHS、CHI1、F3H、BAN、DFR不同程度的下調，這些蛋白是來自不同蛋白翻譯后修飾的異構體，連續(xù)作用于類黃酮生物合成。它們都有一個相似的模式，在第1個生長期結束后急劇下降，呈現與前人研究葡萄類黃酮合成途徑較一致的規(guī)律[27]。

3.4 冬棗果實發(fā)育中與乙醛酸和二羧酸代謝相關蛋白質

谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GLN1-1）是高等植物氮代謝中重要的酶，表達受不同外界因素的影響，其中最主要的是氮源、光照調節(jié)和葉綠體發(fā)育[28]。本研究中GLN1-1在乙醛酸和二羧酸代謝途徑中下調，這與冬棗果實發(fā)育過程中光合作用逐漸下調有關。絲氨酸羥甲基轉移酶（serine hydroxymethyl transferase，SHMT2）作為L-絲氨酸合成中的關鍵酶，能催化甘氨酸和L-絲氨酸的相互轉化。絲氨酸是光呼吸關鍵酶的代謝調控因子，甘油酸脫氫酶（glycerol dehydrogenase，HPR）正向調控光呼吸氧化底物乙醇酸的合成。在長期進化過程中，光呼吸是為植物提高抗逆性而形成的一條代謝途徑，具有重要的生理意義[29-30]。本研究中SHMT2和HPR表達上調，有助于調控光呼吸的進行，為冬棗果實發(fā)育中后期適應環(huán)境變化而提高其抗逆性，以維持冬棗果實的正常生理作用。過氧化氫酶幾乎能在所有需氧呼吸的生物體中發(fā)生，可保護冬棗細胞免受過氧化氫的毒性作用。蘋果酸脫氫酶能夠將蘋果酸脫氫轉化為草酰乙酸并還原成蘋果酸，蘋果酸用于調節(jié)細胞pH值和維持滲透壓平衡，并作為三羧酸循環(huán)的中間代謝物為植物生長發(fā)育提供能量，對細胞代謝調控起重要作用[31]。

3.5 冬棗果實發(fā)育中與核糖體合成相關蛋白質

核糖體由核糖體蛋白復合物組成，是蛋白質合成的重要場所，細胞內核糖體在內質網信號序列的作用下，附著到內質網上并合成可溶性蛋白[32]?？扇苄缘鞍资窃S多植物體內酶的重要組成部分，為植物生長發(fā)育提供營養(yǎng)和能量，參與調控植物的多種代謝過程，與植物生長發(fā)育、成熟衰老以及抗逆性等密切相關。本研究中，核糖體蛋白家族40S、60S核糖體以及60S酸性核糖體在DE03 vs DE02中顯著下調，說明冬棗在膨大期迅速積累糖分，蛋白質合成速率逐漸降低。而在冬棗果實成熟后期以60S核糖體為主的蛋白不同程度的上調，與下調蛋白數目相比，比率接近1。與前人棗類發(fā)育過程中果實的可溶性蛋白質含量呈三峰曲線變化趨勢研究結果一致[33]，可溶性蛋白質含量在冬棗發(fā)育期內變化不明顯，至成熟時游離氨基酸含量降低。

4 結 論

通過沾化冬棗不同成熟階段（DE01、DE02、DE03、DE04）的蛋白質組分析，共定性2 107 個蛋白質，定量1 986 個蛋白質，其中DE02 vs DE01、DE03 vs DE01、DE04 vs DE03差異表達蛋白質分別為96、185、138 個。差異蛋白質GO顯示，主要富集單一生物細胞過程、單一生物代謝過程、化學響應、壓力響應等生物學過程。KEGG代謝通路分析表明，差異表達蛋白顯著富集在光合作用、苯丙烷類生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、類黃酮生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝以及核糖體合成等。冬棗果實不同成熟階段蛋白質組差異顯著，差異蛋白質主要參與能量代謝、遺傳信息處理和其他次生代謝物的生物合成等途徑，這些代謝途徑在二代冬棗果實品質形成過程中起重要調節(jié)作用。