倪瑞潔，詹 萍,*，田洪磊,2,*

（1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）是蕓香科花椒屬植物，具有獨特的香味和麻味，能夠去腥、提香、增味、開胃，是“八大調(diào)味品”之一[1-2]?；ń酚褪腔ń吩谂腼冎械膫鹘y(tǒng)應(yīng)用形式之一，油炸后的花椒油比普通花椒油的風(fēng)味透發(fā)性更強，更符合大眾的口味。然而在油炸過程中，過長的油炸時間或過高的油炸溫度會發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，產(chǎn)生不良風(fēng)味[3-4]，因此選擇適當(dāng)?shù)恼ㄖ茥l件制備花椒調(diào)味油尤為重要。

目前，國內(nèi)外針對花椒油的研究主要集中在花椒揮發(fā)油及浸提花椒油，關(guān)于花椒調(diào)味油的風(fēng)味研究較少。Liu Yuping等[5]采用超臨界二氧化碳萃取法制得花椒揮發(fā)油，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用嗅覺儀（gas chromatographymass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）分離鑒定出32 種氣味活性化合物。牛文婧等[6]采用頂空-固相微萃取-GC-MS測定出7 個不同品種花椒油中的81 種香氣物質(zhì)。陳海濤等[7]采用香氣稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法結(jié)合GC-MS-O分析發(fā)現(xiàn)芳樟醇、大根香葉烯D、檸檬烯、乙酸芳樟酯、乙酸-4-松油烯醇酯等是炸花椒油中的關(guān)鍵香氣化合物。Sun Jie等[8]采用AEDA和GC-MS-O分析比較韓城花椒油和韓源花椒油的香氣特征，發(fā)現(xiàn)β-水芹烯、對傘花烴、乙酸辛酯、辛醛、香茅醇和檜烯是引起差異的主要原因。上述研究在分離鑒定化合物時主要采用GC-MS，該技術(shù)靈敏度高、分離性能強、重復(fù)性好，是一種成熟的常規(guī)分析技術(shù)，但此技術(shù)無法分析鑒定出一些含量少而對風(fēng)味至關(guān)重要的物質(zhì)，且預(yù)處理步驟和質(zhì)譜分析時間限制其應(yīng)用[9-10]。

氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是近年來出現(xiàn)的一種新型氣相分離檢測技術(shù)，該技術(shù)結(jié)合GC的高分離能力和IMS的快速響應(yīng)，具有響應(yīng)快、靈敏度高、穩(wěn)定性好等特點[11-12]。到目前為止，這項技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在食品分類和摻假[13-14]、異味檢測[15]、加工過程的監(jiān)控[16]以及貯存過程中香氣變化的評估[17]等方面，而將GC-IMS用于花椒調(diào)味油揮發(fā)性化合物的分析研究鮮見報道。

本研究以花椒調(diào)味油為研究對象，采用電子鼻和GCIMS對不同炸制時間制得的花椒調(diào)味油進行揮發(fā)性成分及指紋圖譜分析，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、判別因子分析（linear discriminant analysis，LDA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA），解析花椒調(diào)味油樣品間揮發(fā)性組分差異，并篩選標志性化合物，以期對花椒調(diào)味油的風(fēng)味組成進行探究，為花椒調(diào)味油的風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控技術(shù)創(chuàng)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大紅袍花椒，產(chǎn)自陜西韓城（35°48′N，110°43′E），采購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶；魯花低芥酸特香菜籽油市購。

1.2 儀器與設(shè)備

iNose電子鼻 上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；Flavour Spec?GC-IMS聯(lián)用儀 德國G.A.S公司；SE202F百分之一天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將花椒進行除雜篩選處理，準確稱取150 g菜籽油倒入0.5 L圓底燒瓶中，在油浴中逐漸加熱至130 ℃時控溫，加入25 g干花椒顆粒進行恒溫炸制，且炸制過程中不斷攪拌混合物以防止局部過熱。整個過程使用油溫計測量溫度，分別持續(xù)5、15、25 min和35 min后停止加熱，自然冷卻至室溫，并去除花椒顆粒，單獨盛取花椒調(diào)味油，冷藏待用。對制得的花椒調(diào)味油依次編號，分別為HPO1、HPO2、HPO3和HPO4。

1.3.2 感官評價

參考Sun Jie等[8]研究并調(diào)整：準確稱取10 g花椒調(diào)味油于無嗅的透明PET瓶中（體積50 mL），在室溫下由感官評價小組進行描述性感官評價分析（descriptive sensory analysis，DSA）。經(jīng)3 輪培訓(xùn)和篩選后，感官評價小組由10 名成員（5 男，5 女，20～30 歲）組成。在培訓(xùn)期間，小組成員討論并確定了樣品的呈香屬性及相對應(yīng)的標準氣味劑。呈香屬性分別為草藥味、檸檬香、青香、松木香、脂肪香和焦糊味。將這些呈香屬性與下列標準氣味劑水溶液進行比較：草藥味（1,8-桉樹腦）、檸檬香（檸檬烯）、青香（芳樟醇）、松木香（β-月桂烯）和脂肪香（(E)-2-庚醛），焦糊味呈現(xiàn)出令人不愉快的味道。各呈香屬性以1為增量，在0（無臭味）～9 （極強氣味）范圍內(nèi)進行評估。樣品之間間隔1 min，所有樣品進行3 次評估，結(jié)果取平均值。

1.3.3 電子鼻分析

電子鼻利用非特異的、靈敏的傳感器陣列和模式識別系統(tǒng)，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）等多元統(tǒng)計分析，反映樣品的整體氣味信息，能較好區(qū)分食品的品質(zhì)差異[18-20]。分別準確稱取7 g 花椒調(diào)味油于40 mL頂空瓶中密封，室溫下平衡30 min。在分析樣品之前，必須開機預(yù)熱1 h，清洗儀器30 min，以純空氣作為載氣清洗傳感器陣列，使響應(yīng)信號降為0。進樣體積為1 000 μL，分析采樣時間為120 s，樣品之間清洗180 s。以上步驟均在室溫下進行，每個樣品測定5 次平行。

1.3.4 GC-IMS分析

頂空進樣條件：準確稱取1 g花椒調(diào)味油，裝入20 mL頂空進樣瓶中密封。50 ℃條件下孵育20 min，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進樣針溫度85 ℃；進樣體積500 μL。

GC條件：FS-SE-54-CB-1非極性色譜柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；柱溫60 ℃；分析時間30 min；載氣：N2（純度≥99.999%）；載氣流速：0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～10 mL/min；10～20 min，10～100 mL/min；20～30 min，100～150 mL/min。

IMS條件：漂移管長度5 cm；管內(nèi)線性電壓400 V/cm；漂移氣：N2（純度≥99.999%）；流速150 mL/min；IMS溫度45 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

電子鼻數(shù)據(jù)利用內(nèi)置的smartNose分析軟件進行線性判別分析；利用GC-IMS一系列配套的分析軟件（LAV（laboratory analytical viewer），Reporter插件、Gallery Plot插件和Dynamic PCA插件以及GC×IMS Library Search）對花椒調(diào)味油的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行數(shù)據(jù)采集和分析。采用IBM SPSS Statistics 25.0進行單因素方差分析（ANOVA），利用Duncan多重比較評定樣品間的差異性，P≤0.05，認為數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Origin 2018對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒調(diào)味油感官評價分析

通過DSA對4 個樣品（HPOs）的草藥味、檸檬香、青香、松木香、脂肪香和焦糊味6 個呈香屬性進行評價和比較，結(jié)果如圖1所示。HPOs樣品具有不同的香氣強度，其中草藥味、檸檬香、松木香和焦糊味存在高度顯著差異（P＜0.001）。HPO1表現(xiàn)出最弱的草藥味、檸檬香、松木香和焦糊味以及最強的脂肪香，可能是由于炸制時間較短（5 min）。隨著炸制時間的延長，所有樣品（HPO2～HPO4）的草藥味、檸檬香、松木香均出現(xiàn)不同程度地增強，脂肪香逐漸減弱。而焦糊味在HPO4中最強烈，但在其他HPO樣品中較弱，這表明當(dāng)炸制時間超過35 min時，焦糊味會增強。同時HPO2是在中等炸制時間（15 min）下制備的樣品，表現(xiàn)出最強的草藥味、檸檬香和松木香，脂肪香和青香適中，有很弱的焦糊味，使HPO2的整體香味濃郁，清香獨特，油膩感弱，最容易被小組成員接受。

2.2 花椒調(diào)味油電子鼻分析

為避免生理嗅覺的缺陷，增強對食品氣味辨別的穩(wěn)定性和重復(fù)性，采用電子鼻系統(tǒng)獲取揮發(fā)性化合物整體輪廓，根據(jù)14 根傳感器對樣品的平均響應(yīng)值建立雷達指紋圖譜和傳感器信號強度圖[21]，比較4 個花椒調(diào)味油樣品之間的差異。如圖2a所示，花椒調(diào)味油風(fēng)味差異主要集中在傳感器0、1、7、11和12上，表明電子鼻對不同炸制時間的花椒調(diào)味油風(fēng)味區(qū)分效果較好，尤其是在傳感器7上，對花椒調(diào)味油的風(fēng)味輪廓感知更敏感，區(qū)分效果最佳。

圖2 電子鼻檢測不同炸制時間的花椒調(diào)味油的風(fēng)味雷達圖（a）和LDA圖（b）Fig. 2 Radar map (a) and LDA (b) plot of E-nose data of fried pepper oils with different frying times

LDA可用于確定HPOs之間存在可察覺的嗅覺差異，縮小同類數(shù)據(jù)的差異，擴大不同數(shù)據(jù)之間的差異，組間距離越大說明差異性越大[22]。如圖2b可知，樣品聚集明顯，花椒調(diào)味油能很好地被區(qū)分。HPO1和HPO2主要集中在圖上方，HPO3和HPO4主要集中在圖下方。此外，圖中各HPO的3 個平行之間的重復(fù)性也較好，無顯著差異。根據(jù)LDA結(jié)果，在不同炸制時間下，HPOs的香氣強度存在顯著差異，可以用電子鼻有效識別，這些結(jié)果與DSA獲得的結(jié)果一致。

2.3 花椒調(diào)味油的GC-IMS分析

2.3.1 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性化合物GCIMS分析

由Reporter插件生成不同炸制時間下花椒調(diào)味油中揮發(fā)性化合物的GC-IMS三維譜圖。如圖3a所示，不同炸制時間花椒調(diào)味油中的揮發(fā)性化合物種類相似，但峰值強度有所不同。隨著炸制時間的延長，幾乎沒有新的化合物生成，僅出現(xiàn)含量的變化。

為進一步直觀比較樣品之間的差異，結(jié)合二維俯視圖對樣品的GC-IMS進行分析，如圖3b所示。背景為藍色，橫坐標1.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP峰兩側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大?；衔镏饕性诓煌ㄖ茣r間之間A、B區(qū)域相比較，A區(qū)域中部分化合物顏色加深，B區(qū)域的化合物顏色變淺，說明隨著炸制時間的延長，A區(qū)域的化合物含量增加，B區(qū)域的化合物含量降低。

圖3 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性有機物的GC-IMS三維譜圖（a）和二維譜圖（b）Fig. 3 GC-IMS 3D (a) and 2D (b) topographic images of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

2.3.2 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性化合物定性分析

采用GC×IMS Library Search中內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫，根據(jù)保留指數(shù)、保留時間和離子遷移時間對花椒調(diào)味油中揮發(fā)性化合物進行定性分析，結(jié)果如表1所示。部分揮發(fā)性化合物出現(xiàn)了二聚體甚至多聚體，它們具有相近的保留時間和不同的遷移時間，這是GC-MS聯(lián)用儀所檢測不出的[23]。在4 個樣品中共鑒定出46 種揮發(fā)性化合物，包括醛類19 種、萜烯類15 種、醇類8 種、酯類3 種和酮類1 種。隨著炸制時間的延長，揮發(fā)性有機物的種類沒有發(fā)生變化，醇類、酯類含量均出現(xiàn)不同程度的先下降后上升趨勢，萜烯類化合物含量變化不大。醛類化合物包括己醛、庚醛、(E)-2-庚醛等，這些化合物主要是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，與脂肪和油性風(fēng)味有關(guān)，為花椒調(diào)味油的脂肪香提供較大的貢獻；萜烯類化合物含量最高，包括β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-松油烯、β-羅勒烯等，賦予花椒調(diào)味油濃烈的青香、木香和薄荷香，是花椒調(diào)味油的主要呈香物質(zhì)[8]；醇類化合物包括α-松油醇、芳樟醇、桉葉油醇等，主要賦予花椒調(diào)味油薄荷香、藥草香和花香[7]；酯類和酮類化合物主要提供了果香，這些化合物共同構(gòu)成了花椒調(diào)味油濃厚綿長的獨特風(fēng)味。

表1 不同炸制時間花椒調(diào)味油中的揮發(fā)性化合物Table 1 Volatile compounds in fried pepper oils with frying times identified by GC-IMS

續(xù)表1

2.3.3 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性化合物指紋圖譜

采用儀器配套的Gallery Plot插件生成指紋圖譜，可直觀地呈現(xiàn)不同炸制時間花椒調(diào)味油之間的揮發(fā)性化合物差異。如圖4a所示，同一行表示同一花椒調(diào)味油中的揮發(fā)性化合物的信號峰，同一列表示同一揮發(fā)性化合物在不同花椒調(diào)味油中的信號峰，整個指紋圖譜可以呈現(xiàn)每種樣品的完整揮發(fā)性有機物信息以及樣品之間揮發(fā)性有機物的差異。顏色由淺到深表示揮發(fā)性化合物的含量由低到高。不同炸制時間的花椒調(diào)味油之間差異顯著。紅框中的物質(zhì)隨花椒炸制時間的延長含量呈上升趨勢，包括(E)-2-庚醛、(E)-2-戊醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、乙酸異戊酯和乙醇等，多數(shù)為醛類。綠框中的物質(zhì)隨花椒調(diào)味油炸制時間延長含量呈先上升后下降趨勢，包括α-萜品烯、水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基丁酸乙酯和乙縮醛等。部分揮發(fā)性化合物在花椒調(diào)味油的4 個樣品中含量均很高，包括β-蒎烯、α-蒎烯、β-羅勒烯、檸檬烯、芳樟醇、2-甲基丁醛等，與陳海濤等[7]的研究結(jié)果一致。檸檬烯與芳樟醇含量在一定程度上反映了花椒的品質(zhì)和差異，對花椒調(diào)味油的風(fēng)味也有一定的影響[24]。

利用LAV軟件對4 個HPOs進行PCA。如圖4b所示，根據(jù)PCA結(jié)果，2 個PC的貢獻率（PC1為73%；PC2為8%）占方差的81%，能反映出樣品的總體特征[25]。隨著炸制時間的延長，代表花椒調(diào)味油的點在PCA圖上呈現(xiàn)從左到右的規(guī)律排列。顯然，每個樣本都可以區(qū)別于其他樣本，并且在得分圖的不同區(qū)域有明顯的聚類。HPO1和HPO2集中在圖右側(cè)，而HPO3和HPO4主要位于圖左側(cè)。花椒調(diào)味油（HPO1～HPO4）之間的差異主要集中在PC1。

圖4 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性有機物的指紋圖譜（a）及PCA圖（b）Fig. 4 Fingerprint (a) and PCA plot (B) of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

2.3.4 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性化合物PLS-DA

PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的有監(jiān)督的分析方法，能夠?qū)?shù)據(jù)進行降維，實現(xiàn)復(fù)雜數(shù)據(jù)的可視化及判別分析和預(yù)測[26-27]。在PLS-DA中使用7 倍交叉驗證預(yù)測殘差方差分析和100 次隨機重分類的響應(yīng)置換評價模型的性能指標。交叉驗證用于確定解釋X方差、Y方差和交叉驗證預(yù)測能力（Q2）的總數(shù)量所代表的足夠PCs的數(shù)量[25]。其中，代表該模型較可靠。如圖5a所示，所有的R2值和Q2值均是模擬值低于原始值，Q2的回歸線截距為負值，上述結(jié)果說明該模型穩(wěn)定性較好，未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。

PLS-DA因子載荷圖可直觀地反映每一個變量在得分圖上的貢獻[28]，對不同炸制時間制得的花椒調(diào)味油中重要香氣成分進行分析。如圖5b所示，20（β-蒎烯）、36（萜品四醇）、32（α-蒎烯）、10（糠醛）、17（2-甲基丁醛）、42（1-丙醇）等物質(zhì)是HPO1的特征性風(fēng)味物質(zhì)；24（檸檬烯）、28（α-水芹烯）、13（乙縮醛）、26（α-松油烯）、45（3-甲基丁酸乙酯）等物質(zhì)是HPO2的特征香氣物質(zhì)，萜烯類物質(zhì)多，檸檬香和松木香濃烈；HPO3的主要香氣成分有19（2-丙烯醛）、38（1,8桉樹腦）、34（α-蒎烯）、25（檸檬烯）、37（芳樟醇）等風(fēng)味物質(zhì)；HPO4的香氣成分主要是醛類物質(zhì)，包括1（己醛）、3（(E)-2-戊醛）、4（庚醛）、14（戊醛）、22（β-蒎烯）、44（3-甲基丁酸乙酯）等物質(zhì)，由于炸制時間過長，脂肪氧化程度高，導(dǎo)致焦糊味明顯增強，與DSA和指紋圖譜結(jié)果一致。

變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）可用于篩選對花椒調(diào)味油呈香輪廓有重要影響的關(guān)鍵標記物[29]。如圖5c所示，20 種VIP值大于1的揮發(fā)性化合物在判別中具有重要作用，分別為芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-水芹烯、己醛、庚醛、(E)-2-己醛、(E)-2-庚醛、糠醛、2-甲基丁醛、甲基丙醛、2-丙烯醛、1-丙醇和3-甲基丁酸乙酯，VIP值越大，差異越顯著。在以上化合物中，有11 種醛類化合物和6 種萜烯類化合物，因此醛類和萜烯類對于花椒調(diào)味油整體風(fēng)味的影響尤為關(guān)鍵。醛類化合物主要是由多不飽和三酰甘油熱氧化產(chǎn)生[30-31]，氧化產(chǎn)物隨炸制時間的延長而增多，如正己醛是亞油酸的關(guān)鍵氧化代謝產(chǎn)物，亞麻酸等不飽和脂肪酸在一定條件下可快速降解為2-己烯醛，并轉(zhuǎn)化為正己醛[32]。單萜（β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-水芹烯）和含單萜的含氧化合物（芳樟醇）可能是在花椒內(nèi)合成的，在炸制的過程中從花椒中浸出到油中。在生物合成中，首先生成主前體焦磷酸異戊烯酯（isopentenyl pyrophosphate，IPP），IPP被異構(gòu)化為二甲基烯丙基焦磷酸酯（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），然后IPP和DMAPP單元縮合得到異戊烯基化的焦磷酸酯，這是不同萜類化合物的直接前體。IPP和DMAPP單元之間的縮合反應(yīng)是由特定的戊烯基轉(zhuǎn)移酶催化的[33-34]。如果縮合產(chǎn)物為香葉基二磷酸（geranyl diphosphate，GPP），GPP在單萜合成酶作用下可轉(zhuǎn)化為芳樟醇、檸檬烯和1,8-桉樹醇；如果產(chǎn)物為二磷酸神經(jīng)磷酸酯（neryl diphosphate，NPP），則NPP在單萜合成酶作用下轉(zhuǎn)化為α-萜烯和水芹烯[35]。結(jié)合醛類和萜烯類化合物在炸制過程中的含量變化，選擇炸制時間為15 min，與DSA結(jié)果一致。

圖5 不同炸制時間花椒調(diào)味油中揮發(fā)性有機物的PLS-DAFig. 5 PLS-DA of volatile compounds in fried pepper oils with different frying times

3 結(jié) 論

本研究采用描述性感官分析、電子鼻和GC-IMS對不同炸制時間下花椒調(diào)味油的香氣特征進行分析。結(jié)果表明在炸制15 min時，HPO2表現(xiàn)出最強的草藥味、檸檬香和松木香，且焦糊味很弱，使HPO2的整體香味濃郁，清香獨特，油膩感弱。在花椒調(diào)味油中共分離鑒定出46 種化合物，包括醛類19 種、萜烯類15 種、醇類8 種、酯類3 種和酮類化合物1 種。隨著炸制時間的延長，4 個花椒調(diào)味油中的揮發(fā)性化合物種類相似，但峰值強度存在顯著差異，其中醛類物質(zhì)包括己醛、庚醛、(E)-2-庚醛等的含量呈現(xiàn)上升的趨勢，α-萜品烯、水芹烯、4-萜烯醇、3-甲基丁酸乙酯和乙縮醛等的含量呈先上升后下降趨勢，醇類、酯類含量隨著炸制時間的延長先下降后上升，萜烯類化合物含量變化不大。通過PLS-DA共篩選出20 種標志性化合物，包括芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯、檸檬烯、α-水芹烯、己醛、庚醛、(E)-2-己醛、(E)-2-庚醛、糠醛、2-甲基丁醛、甲基丙醛、2-丙烯醛、1-丙醇、3-甲基丁酸乙酯等。