于蓓蓓，閆雪生，周洪雷

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS譜-效相關(guān)的柴胡-黃芩藥對解熱質(zhì)量標(biāo)志物的篩選及含量測定方法的建立

于蓓蓓1, 2，閆雪生2，周洪雷1*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014

篩選柴胡-黃芩（柴黃）藥對解熱作用質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker），并建立Q-Marker的UPLC含量測定方法。采用均勻設(shè)計(jì)法建立柴黃藥對配伍差異樣品，利用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜（UPLC- Q-Exactive Orbitrap-MS）技術(shù)建立柴黃藥對煎液指紋圖譜，采用Thermo Scientific Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm），以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min，并采用電噴霧電離，正離子掃描模式下進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。采用新西蘭兔耳緣靜脈脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）注射的方法建立少陽證高熱模型，以體溫變化值作為解熱藥效指標(biāo)，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法建立指紋圖譜中共有峰與解熱作用的相關(guān)關(guān)系，篩選出關(guān)聯(lián)性較大的成分作為柴黃藥對解熱作用的主要Q-Marker，采用UPLC建立Q-Marker含量測定方法。篩選出黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C作為柴黃藥對解熱Q-Marker，并建立了含量測定方法。基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)的譜-效相關(guān)研究策略可以快速分析及初步確定柴黃藥對解熱Q-Marker，在此基礎(chǔ)上建立其UPLC含量測定方法，對優(yōu)化柴黃類方制劑的質(zhì)量控制方法具有重要的參考價值。

譜效相關(guān)；質(zhì)量標(biāo)志物；超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜；柴黃藥對；指紋圖譜；黃芩苷；漢黃芩苷；千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷；去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷；黃芩素；漢黃芩素；柴胡皂苷A；柴胡皂苷C

柴胡、黃芩（柴黃）藥對源于《傷寒論》，是少陽病證治的方藥核心。作為經(jīng)典藥對，柴黃配伍被廣泛運(yùn)用于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的復(fù)方治療中，具有解熱抗炎、抗病毒、保肝利膽和抗癲癇等作用?！吨嗅t(yī)方劑大辭典》中以柴黃作主藥的有657首[1]，許多沿用至今并被研發(fā)成為成方制劑，如藥典收載的小柴胡片等[2]。在新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案中，柴黃藥對亦出現(xiàn)在清肺排毒湯以及濕熱蘊(yùn)肺證推薦處方中[3]。要深層次開發(fā)該類方劑，更加精準(zhǔn)地指導(dǎo)臨床合理用藥，進(jìn)行其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究有著極為重要的意義。

目前柴黃復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多以黃芩苷為指標(biāo)，且現(xiàn)有的質(zhì)控模式未能反映出成分與解熱、抗病毒等藥效活性之間的“量-效關(guān)聯(lián)”。中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）概念的提出，為中藥質(zhì)控手段的提升提供了新的思路和方法[4]。如何去篩選中藥Q-Marker，成為迫切需要解決的問題。文獻(xiàn)報(bào)道了基于植物親緣學(xué)和生源途徑、化學(xué)成分特有性、傳統(tǒng)功效、傳統(tǒng)藥性、化學(xué)成分可測性、中藥不同配伍環(huán)境、可入血化學(xué)成分以及不同貯藏時間的影響來篩選中藥Q-Marker的方法[5-6]，以及指紋圖譜、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[7-8]、代謝組學(xué)[9]、譜-效相關(guān)[10]等技術(shù)手段。

譜-效相關(guān)是利用指紋圖譜技術(shù)表征中藥所含的化學(xué)成分，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，建立化學(xué)成分與中藥藥效活性的相關(guān)關(guān)系，確定與藥效相關(guān)的成分群[11]，從而篩選Q-Marker的技術(shù)方法。該方法能夠明確地反映Q-Marker與藥效活性的關(guān)聯(lián)。而如何全面地表征中藥化學(xué)成分以及藥效指標(biāo)的選擇是該技術(shù)實(shí)施的關(guān)鍵問題。

本實(shí)驗(yàn)采用不同配伍用量的柴胡、黃芩飲片來制備藥對煎液差異樣品，采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)分別獲取差異樣品的化學(xué)成分指紋譜，結(jié)合其對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的高熱新西蘭兔的解熱藥效結(jié)果，通過灰色關(guān)聯(lián)度分析法建立指紋圖譜共有峰與解熱作用的相關(guān)性，選擇其中特征性的、有效的、可測的化學(xué)成分作為其主要的Q-Marker，并建立主要Q-Marker的UPLC含量測定方法，為柴黃類方制劑質(zhì)量控制水平的提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，DAD-3000RS檢測器，Thermo Scientific Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm），美國賽默飛世爾科技公司；BP211D賽多利斯電子天平，德國賽多利斯股份有限公司；SB-5220 DTS超聲波雙頻清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；6聯(lián)KDM型控溫電熱套，鄄城華魯電熱儀器有限公司；HRQ-A1系列電子體溫計(jì)，小福豬畜牧科技有限公司。

1.2 試藥

黃芩苷（批號P16S8F44143，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、漢黃芩苷（批號P09J8F28374，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、黃芩素（批號C20M8Y31962，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、漢黃芩素（批號C19A8Q34235，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、柴胡皂苷A（批號P03M9F50593，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）對照品購于上海源葉生物科技有限公司；柴胡皂苷C（批號PS0566-0020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷（批號PS2255-0025，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷（批號PS1717-0010，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%）對照品購于成都普思生物科技股份有限公司。乙腈、甲酸、甲醇，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?，色譜純；液相用水為屈臣氏蒸餾水。LPS購于Sigma Aldrich公司，用生理鹽水配制成80 μg/mL的溶液，分裝于硅烷化的EP管，?20 ℃冷凍保存，臨用前37 ℃水浴解凍。

1.3 飲片

柴胡（批號20190701）、黃芩（批號20190101），山東百味堂中藥飲片有限公司，均經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源室林慧彬研究員鑒定，分別為傘形科柴胡屬植物北柴胡DC.和唇形科黃芩屬植物黃芩Georgi的干燥根。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性新西蘭大白兔，普通級，體質(zhì)量（2.5±0.5）kg，購自濟(jì)南西嶺角生物科技有限公司，許可證號：SCXK（魯）20150001。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院動物實(shí)驗(yàn)倫理/管理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號SYXK（魯）2018-0013。

2 方法與結(jié)果

2.1 柴胡-黃芩差異配伍樣品的制備

依照柴胡和黃芩在臨床應(yīng)用上的常用劑量和《中國藥典》2020年版中的規(guī)定用量，確定了柴胡和黃芩使用的劑量范圍[12-13]：柴胡12～80 g，黃芩10～50 g。選取柴胡、黃芩的用量為2個因素，分別設(shè)5個劑量水平，進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，因素及水平見表1。按照均勻設(shè)計(jì)表U10(52×21)，擬合成10個不同的柴胡-黃芩劑量配伍比例的處方，如表1所示。

表1 柴胡黃芩藥對配伍均勻設(shè)計(jì)U10(52×21)

Table 1 Uniform design U10(52× 21) of BSDP compatibility

試驗(yàn)號柴胡/g黃芩/g試驗(yàn)號柴胡/g黃芩/g S112 (1)30 (3)S648 (3)40 (4) S212 (1)50 (5)S766 (4)10 (1) S330 (2)20 (2)S866 (4)40 (4) S430 (2)50 (5)S980 (5)10 (1) S548 (3)20 (2)S1080 (5)30 (3)

依表1中所示劑量取柴胡、黃芩飲片，加入飲片總量的10倍量水，加熱回流提取2次，每次1 h。水提液濾過，濾液合并濃縮，定容至200 mL。由此得1～10號柴黃藥對ig煎液。此為70 kg成人日臨床用藥量，兔等效劑量[14]為200 mL×0.07/1.5 kg≈9.3 mL/kg。由此得1～10號柴黃藥對ig煎液。

2.2 供試品溶液的制備

取1～10號柴黃藥對ig煎液，分別精密量取1 mL煎液于25 mL量瓶中，加70%甲醇20 mL，超聲處理（250 W、40 kHz）30 min，定容，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 對照品儲備液的制備

分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A- 7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、C對照品適量，用甲醇定容，制得質(zhì)量濃度分別為含黃芩苷1218 μg/mL、漢黃芩苷318 μg/mL、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷159 μg/mL、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷82 μg/mL、黃芩素192 μg/mL、漢黃芩素50.2 μg/mL、柴胡皂苷A 33 μg/mL、柴胡皂苷C 18.6 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.4 色譜和質(zhì)譜條件

采用Thermo Scientific C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm），以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫：0～2.0 min，10%～13%乙腈；2.0～6.3 min，13%～20%乙腈；6.3～8.4 min，20%乙腈；8.4～12.6 min，20%～23%乙腈；12.6～18.9 min，23%～25%乙腈；18.9～23.1 min，25%～30%乙腈；23.1～27.3 min，30%～37%乙腈；27.3～33.6 min，37%乙腈；33.6～34.0 min，37%～40%乙腈；34.0～46.2 min，40%～65%乙腈；46.2～50.0 min，65%～85%乙腈；體積流量0.3 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

質(zhì)譜離子源為加熱電噴霧電離源（HESI），采用正離子模式掃描，離子質(zhì)量掃描范圍/90～1350，檢測分辨率70 000。噴霧電壓3.0 kV，碎裂電壓30、40、60 kV，鞘氣（N2）體積流量40 arb，輔助氣（N2）體積流量15 arb，毛細(xì)管溫度350 ℃；輔助加熱器溫度250 ℃；S-Lens RF電壓水平50%。

2.5 柴黃藥對煎液UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS指紋圖譜的建立

取1～10號柴黃藥對供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS分析。分別提取正離子模式下得到的10個不同配伍的柴黃藥對煎液總離子流圖（total ion chromatography，TIC），見圖1。使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批煎液圖譜進(jìn)行分析選擇各圖譜中共有的、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、特征明顯的峰為共有峰，進(jìn)行譜峰匹配后，共標(biāo)記40個共有峰，見圖2。通過與對照品保留時間的比較以及各離子峰一、二級質(zhì)譜裂解特征進(jìn)行分析研究，初步推測其可能的化學(xué)成分。選擇化合物種類較多，保留成分信息相對完整的10號樣品進(jìn)行精密度、重復(fù)性、24 h穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等方法學(xué)考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中共有峰保留時間和峰面積RSD值均小于3%，表明建立的柴黃藥對煎液的UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS指紋圖譜符合要求[15]。

圖1 10批不同配伍柴黃藥對煎液UPLC-MS指紋圖譜(正離子模式)

圖2 10批不同配伍柴黃藥對煎液UPLC-MS指紋圖譜共有峰

2.6 動物模型的建立與解熱藥效指標(biāo)的確定

新西蘭兔在室溫（25±1）℃，相對空氣濕度50%～60%，通風(fēng)良好，自然光線環(huán)境下，隨意攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，且每日早晚固定時間測肛溫2次。選擇體溫穩(wěn)定在38.7～39.5 ℃的新西蘭兔，于試驗(yàn)前24 h內(nèi)測肛溫3次，以平均值為基礎(chǔ)體溫。

選擇日常體溫穩(wěn)定在38.7～39.5 ℃的家兔6只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。按0.25 mL/kg耳緣靜脈注射LPS，此后每0.5 h測1次肛溫，并計(jì)算體溫變化值Δ（Δ＝監(jiān)測體溫－基礎(chǔ)體溫），連續(xù)監(jiān)測10 h，結(jié)果如圖3所示。發(fā)現(xiàn)新西蘭兔注射LPS后出現(xiàn)二相發(fā)熱癥狀，且2～4.5 h逐漸出現(xiàn)畏寒、倦怠、結(jié)膜充血、呼吸急促、渴飲等癥狀，符合少陽證表現(xiàn)[16]。4.5 h可以達(dá)到Δ最大值，之后體溫開始下降，到6.5 h體溫最低，但仍比正常體溫高，之后體溫再次升高，但Δ均低于Δ4.5 h。因此選擇Δ4.5 h作為柴黃藥對解熱藥效指標(biāo)。

2.7 柴黃藥對對高熱新西蘭兔的解熱作用

選擇日常體溫穩(wěn)定在38.7～39.5 ℃的家兔，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。隨機(jī)分為對照組、模型組、柴黃組，每組6只。模型組和柴黃組按0.25 mL/kg耳緣靜脈注射LPS，對照組按0.25 mL/kg耳緣靜脈注射生理鹽水。造模1 h后，柴黃組按等效劑量ig柴黃煎液，模型組、對照組ig等劑量的水。

圖3 LPS誘導(dǎo)的高熱新西蘭兔模型體溫變化曲線(, n = 6)

造模后各組動物每0.5 h測1次肛溫，并計(jì)算體溫變化值Δ。模型組動物體溫于造模后4.5 h達(dá)到最高值，對照組動物體溫比較穩(wěn)定，柴黃組給藥10號煎液后0.5 h，體溫下降明顯，之后體溫逐漸增高，但是明顯低于模型組，且在給藥3 h后，給藥組動物的體溫又有明顯的回落，體溫變化如圖4所示。由此可見，柴黃藥對對LPS所致的高熱模型具有解熱作用。

2.8 成分-藥效的灰色關(guān)聯(lián)分析

按“2.7”項(xiàng)下方法進(jìn)行對照組、模型組、柴黃S1～S10號組動物的造模和給藥處理，造模后4.5 h動物體溫變化如表2所示。

將表2中10批柴黃給藥組的Δ4.5 h作為參考序列，記為0()，＝1，2，3，…，10。1～10號柴黃藥對供試品溶液的UPLC-MS指紋圖譜各特征峰面積作為比較序列，記作x()，＝1，2，3，…，10；＝1，2，3，…，40，共40個比較序列。采用均值變換法分別對參考序列和各比較序列數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理。按下式分別計(jì)算每個比較序列與參考序列對應(yīng)元素的關(guān)聯(lián)系數(shù)（分辨系數(shù)＝0.5）。

圖4 對照組、模型組及柴黃10號組ΔT變化曲線(, n = 6)

表2 12組實(shí)驗(yàn)動物造模后4.5 h體溫變化(, n = 6)

Table 2 ΔT4.5 hof 12 groups of experimental animals (, n = 6)

組別T0/℃T4.5 h/℃ΔT4.5 h/℃ 對照39.42±0.1539.82±0.881.40±0.83 模型39.20±0.1941.95±0.40*2.75±1.02* S139.26±0.3041.34±0.51#2.08±0.45# S239.40±0.1341.06±0.52#1.66±0.45# S339.14±0.2641.36±0.44#2.22±0.43# S439.47±0.1941.56±0.36#2.09±0.34# S539.35±0.3340.92±0.45#1.57±0.39# S639.33±0.2341.21±0.54#1.98±0.70# S739.38±0.1040.93±0.60#1.55±0.64# S839.42±0.1940.88±0.72#1.46±0.68# S939.35±0.1540.87±0.88#1.52±0.73# S1039.42±0.1240.79±0.70#1.37±0.62#

與對照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05

*< 0.05normal group;#< 0.05model group

由此，即可計(jì)算每個特征峰與解熱指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度（0i）[17]。

經(jīng)過計(jì)算，與解熱指標(biāo)關(guān)聯(lián)度0i≥0.865（40個共有峰所代表化學(xué)成分與藥效關(guān)聯(lián)度的中位數(shù)）的22個特征峰及其所代表化學(xué)成分辨識情況如表3所示。關(guān)聯(lián)度數(shù)值越高，說明該特征峰與藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性就越強(qiáng)。當(dāng)關(guān)聯(lián)度0i≥0.8時，表明色譜峰代表的化學(xué)成分與藥理指標(biāo)有較大的關(guān)聯(lián)性；當(dāng)0i≥0.9時，表明色譜峰代表的化學(xué)成分與藥理指標(biāo)關(guān)聯(lián)性非常大[10]。由此可見，黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、7,2′-二羥基-8-甲氧基黃酮-5--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、柴胡皂苷A與柴黃藥對解熱藥效密切相關(guān)。黃芩新素I、5,2′-二羥基-8-甲氧基黃酮-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩新素I-5--葡萄糖醛酸苷、白楊素-6--β--葡萄糖-8--α--阿拉伯糖苷、漢黃芩素、黃芩新素II、柴胡皂苷C、黃芩素等成分亦與解熱藥效有較大的關(guān)聯(lián)性。結(jié)合文獻(xiàn)中對柴胡、黃芩解熱抗炎活性成分的報(bào)道，從中選擇特征性的、可測的8個成分：黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、柴胡皂苷A、漢黃芩素、柴胡皂苷C、黃芩素作為柴黃藥對解熱Q-Marker。

表3 柴黃藥對煎液譜-效關(guān)聯(lián)度分析及解熱成分辨識

Table 3 Spectrum-effect analysis and identification of antipyretic components

峰號tR/minr0i成分母離子子離子文獻(xiàn) 27.150.881白楊素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷549.159 43531.143 3618 37.600.883野黃芩苷463.086 65287.071 81, 169.017 5919 47.970.886白楊素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷549.160 50531.143 3618 58.330.879白楊素-6-C-β-L-阿拉伯糖-8-C-β-D-葡萄糖苷549.160 46531.143 3618 78.860.871白楊素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷549.160 57531.143 3618 1010.540.8844′-羥基漢黃芩苷477.101 82301.071 08, 286.059 75, 269.045 5020 1213.020.930黃芩苷*447.091 23271.060 10, 169.017 5921 1314.480.877二氫黃芩苷449.106 53273.088 1720 1415.350.897去甲漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷*447.092 91271.060 10, 169.017 5921 1616.140.8895,6,7-三羥基-8-甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷477.101 95301.071 08, 286.059 75, 269.045 5022 1717.030.902千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷*461.106 41285.075 85, 270.042 62, 186.014 2321 1817.710.9015,7,2′-三羥基-6-甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷477.101 95301.071 08, 286.059 75, 269.045 5021 1919.170.907漢黃芩苷*461.106 41285.075 75, 270.042 6221 2019.910.8885,7-二羥基-6,8-二甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖醛酸苷491.117 87315.102 88, 285.030 46, 198.061 4723 2121.160.878漢黃芩苷異構(gòu)體461.106 39285.075 75, 270.042 6221 2324.050.865黃芩素*271.060 24253.050 46, 169.017 59, 103.051 4121 2629.220.865柴胡皂苷C*927.533 45909.522 31, 763.458 66, 745.428 83, 601.390 63, 24 421.333 22 2730.270.877漢黃芩素*285.075 43270.052 7821 2830.960.893黃芩新素I315.086 08300.063 49, 285.030 46, 198.070 0525 2931.620.870黃芩新素II375.108 43360.083 23, 345.051 31, 227.052 8221 3033.560.895柴胡皂苷A*781.472 26763.458 66, 601.390 63, 455.337 68, 437.327 9126 3940.290.874N″-O-乙?；窈碥誂823.483 47805.478 83, 455.337 68, 437.327 91, 419.317 7824

*與對照品比對確定

*Compare with reference substance to determine

2.9 解熱Q-Marker的含量測定

在上述Q-Marker的初步篩選基礎(chǔ)上，采用UPLC建立同時測定柴黃藥對煎液中黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C共8種成分含量的方法。供試品溶液和對照品儲備液的制備方法分別見“2.2”和“2.3”項(xiàng)下具體要求，色譜條件如“2.4”項(xiàng)下所述，進(jìn)樣量為15 μL，樣品、混合對照品色譜分析結(jié)果見圖5。

2.9.1 線性關(guān)系及定量限考察 分別精密量取混合對照品儲備液適量，甲醇逐級稀釋定容，形成一系列梯度質(zhì)量濃度的對照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）、峰面積值為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，8個待測成分在檢測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，均大于0.999 0。分別測定各待測組分信噪比（信噪比為10時的質(zhì)量濃度計(jì)為定量限），結(jié)果分別為黃芩苷＝7.430 6－4.280 8，＝0.999 4，線性范圍121.8～1 218.0 μg/mL，定量限1.218 μg/mL；漢黃芩苷＝4.481 2－0.183 2，＝0.999 5，線性范圍31.8～318.0 μg/mL，定量限1.059 μg/mL；千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷＝2.163 4＋3.954 7，＝0.999 7，線性范圍15.9～159.0 μg/mL，定量限0.795 μg/mL；去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷＝1.469 8－0.856 9，＝0.999 4，線性范圍8.2～82.0 μg/mL，定量限1.025 μg/mL；黃芩素＝1.387 2＋0.972 8，＝0.999 3，線性范圍19.2～192.0 μg/mL，定量限1.920 μg/mL；漢黃芩素＝0.976 2－0.812 3，＝0.999 1，線性范圍5.02～50.2 μg/mL，定量限1.004 μg/mL；柴胡皂苷A＝0.152 7＋0.002 1，＝0.999 1，線性范圍3.3～33.0 μg/mL，定量限0.413 μg/mL；柴胡皂苷C＝0.105 2＋0.013 6，＝0.999 2，線性范圍1.86～18.6 μg/mL，定量限0.186 μg/mL。

1-黃芩苷 2-去甲漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷 3-千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷 4-漢黃芩苷 5-黃芩素 6-柴胡皂苷C 7-漢黃芩素 8-柴胡皂苷A

2.9.2 精密度考察 精密吸取“2.9.1”項(xiàng)下同一混合對照品溶液，連續(xù)測定6次，記錄各待測成分的峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C峰面積的RSD分別為0.64%、0.87%、0.92%、0.76%、0.56%、0.77%、0.97%、0.69%，結(jié)果表明儀器精密度符合試驗(yàn)要求。

2.9.3 重復(fù)性考察 取10號柴黃藥對煎液6份，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，計(jì)算各成分的質(zhì)量濃度及其RSD，結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C的質(zhì)量濃度分別為20.505、3.465、2.895、1.080、2.055、0.675、0.521、0.243 mg/mL，RSD分別為1.06%、1.27%、1.13%、0.95%、1.23%、1.07%、1.18%、1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9.4 穩(wěn)定性考察 取上述重復(fù)性1號溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，不同時間點(diǎn)各待測成分黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C峰面積的RSD分別為0.86%、0.98%、1.09%、1.48%、1.22%、1.17%、1.33%、1.54%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取0.5 mL 10號柴黃藥對煎液于25 mL量瓶中，精密加入適量各對照品混合溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行操作6份，計(jì)算各待測成分加樣回收率及其RSD。結(jié)果黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷A、柴胡皂苷C的加樣回收率分別為99.77%、99.01%、99.23%、100.87%、98.72%、102.21%、97.39%、96.68%，RSD分別為1.34%、1.57%、1.39%、1.07%、2.13%、1.89%、2.27%、1.98%，表明該方法對8種待測成分的測定回收率較好。

2.10 不同配伍柴黃藥對煎液Q-Marker含量測定

取1～10號柴黃藥對供試品溶液，采用“2.4”項(xiàng)下色譜條件，測定主要解熱Q-Marker的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算每種Q-Marker在來源藥材飲片中的煎出率，結(jié)果見表4?？梢园l(fā)現(xiàn)隨配伍中柴胡用量的增加，黃酮苷類化學(xué)成分煎出率逐漸升高，苷元類成分煎出率呈下降趨勢，而柴胡皂苷A隨黃芩配比的升高，煎出率亦有所提高，柴胡皂苷C的變化未見明顯規(guī)律性，有待進(jìn)一步研究。

煎出率＝煎液中某種Q-Marker的質(zhì)量/來源藥材飲片的質(zhì)量

3 討論

Q-Marker概念的提出為中藥質(zhì)控水平的提高指明了研究方向。在化學(xué)成分與中藥的安全性、有效性相關(guān)基礎(chǔ)上，選擇中藥中可測的標(biāo)識性成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，提高了中藥質(zhì)量一致性、可控性和溯源性，對中藥質(zhì)量控制有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過“譜-效”相關(guān)的研究策略探索篩選柴黃藥對解熱Q-Marker，將柴黃藥對煎液的化學(xué)成分譜通過計(jì)量學(xué)手段與其解熱藥效進(jìn)行有效性關(guān)聯(lián)，初步篩選出22個有效成分（0i≥0.865）。其中，多個成分在文獻(xiàn)中都被報(bào)道過其解熱抗炎作用。如柴胡皂苷是解熱抗炎藥效物質(zhì)，柴胡皂苷A和C顯著抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中炎癥介質(zhì)前列腺素E2的合成和花生四烯酸的釋放[27]；柴胡皂苷A還可通過降低血清中cAMP和下丘腦PKA的含量，使體溫降低[28]。黃芩苷、漢黃芩苷等苷類物質(zhì)在體內(nèi)代謝成相應(yīng)的苷元類化合物，共同發(fā)揮解熱抗炎作用[29-30]。如黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素可以通過不同環(huán)節(jié)干擾花生四烯酸的代謝通路[31]，千層紙素A則通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活，抑制iNOS和COX-2的表達(dá)[32]，去甲漢黃芩素則有極強(qiáng)的抗內(nèi)毒素活性[30]。同時，因?yàn)槠涮卣餍院涂蓽y性，將黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7--葡萄糖醛酸苷、去甲漢黃芩素-7--葡萄糖醛酸苷、柴胡皂苷A、漢黃芩素、柴胡皂苷C、黃芩素這8種成分作為柴黃藥對煎液的主要Q-Marker。實(shí)驗(yàn)還建立了8個主要Q-Marker的UPLC含量測定方法，該法準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定可行。在不同配伍用量下，Q-Marker的含量不同，其解熱藥效亦存在一定差異。以篩選出的8個Q-Marker為指標(biāo)來進(jìn)行柴黃類方制劑質(zhì)量控制，相對于現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上彌補(bǔ)了“唯成分論”存在的不足，為柴黃類制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高奠定基礎(chǔ)。

表4 不同配伍柴黃藥對煎液Q-Marker煎出率測定(n = 2)

Table 4 Decocting rates of quality markers in different compatibility (n = 2)

樣品柴胡/黃芩生藥量/g煎出率/% 黃芩苷漢黃芩苷千層紙素A-7-O-葡萄糖醛酸苷去甲漢黃芩素-7-O-葡萄糖醛酸苷黃芩素漢黃芩素柴胡皂苷A柴胡皂苷C S112/3010.481.791.560.661.890.590.170.13 S212/5010.791.671.230.571.970.610.200.09 S330/2011.042.121.700.741.900.560.120.15 S430/5010.971.961.330.681.730.490.140.13 S548/2011.892.272.070.731.570.520.090.08 S648/4012.062.011.740.561.500.580.110.11 S766/1013.883.132.601.041.230.330.090.05 S866/4012.742.071.750.871.290.370.100.05 S980/1012.962.892.500.911.330.430.080.09 S1080/3013.672.311.930.721.370.450.130.06

全面地表征中藥復(fù)雜體系的化學(xué)成分是“譜-效相關(guān)”技術(shù)實(shí)施的重要基礎(chǔ)。UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS是一種能快速并準(zhǔn)確地分析、識別中藥成分的有效手段，具有超高分辨率和高靈敏度，尤其適合中藥復(fù)雜體系化學(xué)成分的定性定量分析[33]。本研究利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)可以比較全面的反映柴黃藥對煎液中的化學(xué)成分。對比正負(fù)離子模式下的圖譜，峰數(shù)基本一致，負(fù)離子模式不存在特有峰，因此，僅以正離子模式建立柴黃藥對煎液指紋圖譜。以指紋圖譜中離子峰面積作為成分量的指標(biāo)，當(dāng)多個離子保留時間接近，不同成分離子峰面積從該離子提取離子流圖中獲取，經(jīng)過無量綱化處理進(jìn)行譜效相關(guān)分析。關(guān)聯(lián)度高于0.865的成分作為解熱主要藥效成分進(jìn)行質(zhì)譜識別。多數(shù)柴黃成分在正離子模式下易產(chǎn)生加和離子[M＋H]+或[M＋Na]+，以及脫掉1～3個糖殘基及水分子的碎片離子。利用精確質(zhì)量數(shù)加二級全譜，與對照品或文獻(xiàn)圖譜數(shù)據(jù)比對，可達(dá)到快速識別的目的。

選擇合適的藥效指標(biāo)亦是“譜-效相關(guān)”技術(shù)實(shí)施的關(guān)鍵問題。為考察柴黃藥對煎液的藥效，根據(jù)少陽證的主要癥狀“寒熱往來”建立少陽證新西蘭兔高熱模型。LPS作為外源性致熱源，進(jìn)入體內(nèi)，激活機(jī)體免疫細(xì)胞，釋放內(nèi)源性致熱源（如白介素、腫瘤壞死因子、干擾素等），作用于體溫調(diào)節(jié)中樞下丘腦，使其合成和釋放發(fā)熱介質(zhì)（前列腺素E）而引起發(fā)熱，主要癥狀為高熱和一系列炎癥反應(yīng)。采用LPS耳緣靜脈注射的方法造模，出現(xiàn)二相發(fā)熱癥狀，符合少陽證表現(xiàn)[34]，而柴黃藥對有顯著的解熱作用。從檢測結(jié)果來看，Δ4.5 h可以有效的反應(yīng)不同配伍柴黃藥對煎液的解熱藥效差異。因此將其作為柴黃藥對解熱藥效指標(biāo)，進(jìn)行譜效關(guān)系分析和主要Q-Marker的篩選。

實(shí)驗(yàn)采用所建立的UPLC含量測定方法測定不同配伍用量柴黃煎液中主要Q-Marker的含量，發(fā)現(xiàn)黃酮苷類化學(xué)成分隨柴胡用量的增加，溶出量逐漸升高，可能是因?yàn)椴窈杏幸种破渌饣蜓趸某煞郑瑫r柴胡皂苷的表面活性作用也有利于黃芩苷類物質(zhì)的溶出，而與黃芩共煎亦有助于柴胡皂苷A環(huán)氧醚鍵的穩(wěn)定，這可能是柴胡、黃芩配伍應(yīng)用的物質(zhì)基礎(chǔ)，具體的變化規(guī)律有待進(jìn)一步的探索研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的“譜-效”相關(guān)研究策略快速分析并確定了柴黃藥對Q-Marker，在此基礎(chǔ)上建立柴黃藥對主要Q-Marker含量測定方法，對于優(yōu)化柴黃類方制劑的質(zhì)量控制方法具有較重要的參考價值，也為中藥制劑的質(zhì)量評價水平的提升提供新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality markers screening of drug pair decoction ofandby UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS spectrum-effect correlation technology and establishment of content determination method

YU Bei-bei1, 2, YAN Xue-sheng2, ZHOU Hong-lei1

1. Shandong University of traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014, China

To screen the quality markers of Chaihu () and Huangqin () drug pair (BSDP) decoction, and establish the UPLC content determination method of quality markers (Q-Marker).UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS was used to establish the fingerprint of BSDP decoctionThe analysis was performed on a Thermo Scientific Hypersil Gold C18column (150 mm × 2.1 mm, 3 μm) by gradient elution, and the mobile phase consisted of acetonitrile and 0.1% formic acid solution. Electron spray ionization was used, via positive ions scanning. The New Zealand rabbit model withfever syndrome was established by LPS injection via ear vein. Taking temperature change value as antipyretic effect index, gray correlation analysis was used to study the correlation between the common peaks in the fingerprints and the antipyretic effect to screen out the components with greater correlation as quality markers for the antipyretic effect of BSDP decoction, and the contents determination method for quality markers was established using UPLC.Eight quality markers related to the antipyretic effect of BSDP decoction were screened out: baicalin, wogonoside, oroxyloside, glychionide A, baicalein, wogonin, saikosaponin A and saikosaponin C, and the content determination method of them was established.The “spectrum-effect” correlation research strategy based on UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS technology is an effective method for rapid analysis and preliminary determination of antipyretic quality markers of BSDP. On the basis, the UPLC method established for content determination of the eight quality markers is reliable and accurate. This study has important reference value for the in-depth research on quality control of the compound preparation containing BSDP.

spectrum-effect correlation; quality markers; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS; drug pair ofand; fingerprint; baicalin; wogonoside; oroxyloside; glychionide A; baicalein; wogonin; saikosaponin A; saikosaponin C

R283.6

A

0253 - 2670(2022)07 - 1983 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.007

2021-10-28

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2017PH068）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018GSF119019）；山東省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（2020Z08）

于蓓蓓，博士研究生，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)及質(zhì)量控制研究。Tel: 13791049031 E-mail: ybb137 @163.com

周洪雷，博士，教授，從事中藥及天然藥物有效成分及質(zhì)量控制研究。Tel: 13964017341 E-mail: zhouhongleitcm@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]