王力文，黃德華，田俊生，高曉霞，秦雪梅，杜冠華，周玉枝*

? 藥理與臨床 ?

基于外周血單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制研究

王力文1, 2, 3，黃德華1, 2, 3，田俊生1, 2, 3，高曉霞1, 2, 3，秦雪梅1, 2, 3，杜冠華1, 4，周玉枝1, 2, 3*

1. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006 2. 山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006 3. 地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點實驗室，山西 太原 030006 4. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050

通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)分析柴歸顆粒對慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，并采用qRT-PCR法驗證其作用機制。將大鼠隨機分為對照組、模型組、鹽酸文拉法辛（35 mg/kg）組和柴歸顆粒低、中、高劑量（4.2、8.3、16.6 g/kg）組，造模同時給藥，連續(xù)28 d。通過抑郁癥傳統(tǒng)藥效學(xué)指標(biāo)（體質(zhì)量、曠場實驗、糖水偏愛實驗及強迫游泳實驗）評價柴歸顆粒的藥效。采用RNA-seq技術(shù)對大鼠PBMCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選差異基因，對其進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析；通過qRT-PCR法對篩選出的關(guān)鍵表達(dá)基因進(jìn)行實驗驗證。行為學(xué)指標(biāo)顯示柴歸顆粒能顯著改善CUMS模型大鼠的抑郁行為。轉(zhuǎn)錄組學(xué)中KEGG通路富集分析表明抑郁發(fā)生時及柴歸顆粒干預(yù)后，都顯著富集到嘌呤代謝通路，因此針對嘌呤代謝相關(guān)代謝酶基因表達(dá)進(jìn)行深入研究。qRT-PCR結(jié)果表明，與模型組比較，柴歸顆粒組大鼠PBMCs中的胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3，）、胞質(zhì)-5′-核苷酸酶IIIA（cytosolic-5′-nucleotidase IIIA，）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，）、腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，）mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，）、嘌呤能受體P2X7（purinergic receptor P2X7，）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，）mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。柴歸顆粒具有抗抑郁作用，其作用機制與調(diào)節(jié)嘌呤代謝途徑上的基因及嘌呤能受體和炎癥因子mRNA表達(dá)有關(guān)。

柴歸顆粒；慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激抑郁；外周血單個核細(xì)胞；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；嘌呤代謝

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，抑郁癥是一種常見的精神障礙，影響著全球3億多人口。抑郁癥也是自殺的一個危險因素。2017年，世界衛(wèi)生組織宣布自殺是15～29歲年輕人的第2大死因，并預(yù)測抑郁癥將是未來10年世界上最常見的精神疾病[1]。臨床抗抑郁藥物以化學(xué)藥為主，其優(yōu)勢在于起效較快，療效確切，不足在于不良反應(yīng)較大，患者對藥物存在依賴性，復(fù)發(fā)率較高；而中藥的藥效穩(wěn)定且不良反應(yīng)少，安全性高。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，多種中藥復(fù)方[2-3]均有顯著的抗抑郁作用。因此，從中藥和天然藥物中研究和開發(fā)新藥，對抑郁癥的治療和創(chuàng)新藥物的開發(fā)有重要意義。柴歸顆粒是本課題組經(jīng)過前期對經(jīng)典方劑逍遙散最佳抗抑郁組分進(jìn)行藥效學(xué)篩選和抗抑郁物質(zhì)基礎(chǔ)研究，并通過藥效成分歸屬和臨床觀察對原方進(jìn)行化裁而研發(fā)的抗抑郁中藥新藥，其處方由柴胡、當(dāng)歸、白芍、麩炒白術(shù)、炙甘草、薄荷6味中藥組成。柴歸顆粒已獲得國家藥物臨床試驗批件（2018L03149），多種抑郁動物模型均證明該藥具有確切的抗抑郁作用[4-7]，目前正在開展藥物臨床試驗研究[8]。然而，柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制尚未明確。

外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是由外周血中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等具有單個核的細(xì)胞組成（以淋巴細(xì)胞為主）。PBMCs在免疫應(yīng)答、代謝、與其他細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的通訊等方面發(fā)揮著重要作用[9-11]。炎癥及免疫反應(yīng)在抑郁癥的發(fā)病機制中起重要作用。因此，與血清/血漿樣本相比，以免疫細(xì)胞為主的PBMCs對于研究抑郁癥的發(fā)生與免疫之間的聯(lián)系更具有說服力。目前，已有大量的臨床試驗樣本證據(jù)表明PBMCs的基因改變與抑郁癥的關(guān)系非常密切。如崔雪蓮[12]以抑郁癥和健康人的PBMCs為研究對象，用人類LncRNA3.0芯片初步篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個LncRNAs有潛力作為抑郁癥的診斷標(biāo)志物，其中一個LncRNA（NONHSAG045500）與5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（serotonin transporter，SERT）的表達(dá)密切相關(guān)，可作為抗抑郁新型藥物的靶點。Beech等[13]用微陣列技術(shù)檢測20名抑郁癥患者和15名健康人PBMCs的基因表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中85個差異表達(dá)基因顯著富集途徑為線粒體能量代謝途徑，表明線粒體能量代謝途徑在抑郁患者的病理生理過程中發(fā)揮重要作用。Pan等[14]采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究產(chǎn)后抑郁癥患者PBMCs基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示產(chǎn)后抑郁與參與能量代謝、神經(jīng)退行性疾病和免疫應(yīng)答的多種基因表達(dá)呈正相關(guān)。另有文獻(xiàn)報道[10]，在抗抑郁治療過程中抑郁患者PBMCs中的端粒酶活性增加與抑郁癥狀減少密切相關(guān)。阿戈美拉汀的長期給藥降低抑郁模型大鼠PBMCs中色氨酸分解代謝途徑上的mRNA表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控蛋白表達(dá)起到抗抑郁作用[15]。也有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)Toll受體4信號的microRNA（let-7e、miR-146a和miR-155）在抑郁患者中表達(dá)降低，并且這些microRNA表達(dá)水平通過抗抑郁治療后得到回調(diào)[16]。抑郁癥的嚴(yán)重程度與PBMCs中2′,5′-寡腺苷酸合成酶、Toll受體及P2X7受體的含量呈正相關(guān)，與β-抑制蛋白1的含量呈負(fù)相關(guān)[17-20]。PBMCs可通過血腦屏障進(jìn)入中樞，參與腦內(nèi)的病理生理過程[21-22]。同時，PBMCs表達(dá)抑郁癥相關(guān)的基因與腦具有一定相似性[23-24]。He等[25]對重度抑郁患者PBMCs的miRNAs表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cAMP-response element binding protein，CREB）表達(dá)的miR-124表達(dá)水平明顯高于健康人，給予抗抑郁藥后miR-124水平得到回調(diào)，提示大腦中豐富表達(dá)的miR-124可能作為抑郁癥的外周系統(tǒng)的標(biāo)志物。此外，鑒于腦脊液和腦組織活檢樣本在臨床上不適用于常規(guī)篩查或診斷，PBMCs在抑郁癥診斷生物標(biāo)志物篩選中顯示出其獨特的優(yōu)勢。綜上所述，抑郁癥發(fā)生必然對PBMCs造成影響，以PBMCs為切入點，適用于抑郁癥發(fā)病機制及抗抑郁藥物在基因或蛋白水平的深入研究。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞中所有基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，有助于了解疾病發(fā)生發(fā)展過程中基因的表達(dá)情況，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄水平揭示生命過程的代謝網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機制[26]。本研究借助轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術(shù)從基因水平進(jìn)行研究，探尋正常、抑郁以及柴歸顆粒干預(yù)后PBMCs中的差異表達(dá)基因，并對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析及驗證，以期闡明柴歸顆粒改善抑郁癥可能的靶基因及相關(guān)通路，進(jìn)而闡明柴歸顆?？挂钟舻淖饔脵C制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，6～7周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。實驗期間動物保持自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（24±1）℃，濕度為（55±5）%，12 h明暗交替光照，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗獲得山西大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號SXULL-2020028）。

1.2 藥材

柴歸顆粒（10 g/袋，批號20181009）由山西省中醫(yī)研究院制劑中心制備，所用中藥材有柴胡、當(dāng)歸、白芍、麩炒白術(shù)、炙甘草和薄荷，以上藥材均購自山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定分別為柴胡DC.、當(dāng)歸(Oliv.) Diels.、白芍Pall.、白術(shù)Koidz.、甘草Fisch.和薄荷Briq.，均符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。本課題組前期通過研究建立了柴歸顆粒的指紋圖譜并通過對照品指認(rèn)出12種化學(xué)成分，分別為芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸銨、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、白術(shù)內(nèi)酯III、歐前胡素、藁本內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯II。經(jīng)高效液相色譜含量測定方法測得柴胡皂苷a、b2、b1、d的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.68%，芍藥苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.98%以上，將柴胡皂苷a、b2、b1、d和芍藥苷作為柴歸顆粒的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[27-28]。

1.3 藥品與試劑

鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（75 mg/粒，進(jìn)口藥品注冊證號H20160382H20160383，分包裝批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字J20160087，批號CF1090D）購自Pfizer Ireland Pharmaceuticals公司；Oligo（dT）18Primer（批號AL11594A）、dNTP Mixture（批號AJG1229A）、RNase Inhibitor（批號AK32360A）、2×TaqPCR Master Mix（批號U9202）、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（批號067600）、Trizol試劑購自日本Takara公司；DEPC處理水購自北京索萊寶生物科技有限公司；分析級氯仿、異丙醇和無水乙醇。

1.4 儀器

恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上?，槴\實驗設(shè)備有限公司）；大鼠曠場測試箱（長100 cm、寬100 cm、高70 cm，黑色，25格，實驗室自制）；KQ-400KDE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5型高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BSA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；NC2000 Nanodrop紫外定量儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent Technologies生物分析儀2100系統(tǒng)（美國CA公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng)（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；2720型PCR擴增儀（美國ABI公司）；FLX800T型酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 柴歸顆粒的制備

柴胡、當(dāng)歸、白芍、麩炒白術(shù)、炙甘草和薄荷6味藥材用8倍量85%乙醇加熱回流提取2次，每次2 h，藥液濃縮、干燥至浸膏；藥渣用8倍量水提2次，每次2 h，將水提液濃縮至1.10 g/mL（65 ℃），乙醇沉淀濃度為50%，靜置48 h，濾過，回收乙醇，濃縮、干燥至浸膏；混合乙醇提取物和水提醇沉物，即得復(fù)方柴歸方提取物。淀粉、糊精、乳糖、預(yù)膠化淀粉均為輔料，采用干法制粒技術(shù)，取干浸膏粉，成品采用聚酯/鍍鋁聚酯/聚乙烯藥用復(fù)合膜包裝，即得到柴歸顆粒。此工藝由山西省中醫(yī)研究院制劑中心制備，10 g/袋，每袋含生藥量27.5 g。

2.2 分組與給藥

經(jīng)體質(zhì)量、曠場實驗、糖水偏愛實驗測試后，選擇指標(biāo)相近的大鼠60只，隨機分為對照組、模型組、鹽酸文拉法辛（35 mg/kg）組和柴歸顆粒低、中、高劑量（4.2、8.3、16.6 g/kg）組，每組10只，大鼠造模同時給藥，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)28 d。

2.3 慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁模型的建立

參照本課題組前期方法[29]，建立CUMS大鼠抑郁模型。對照組大鼠正常飼養(yǎng)，不接受任何刺激。其余各組接受28 d造模程序，主要包括熱刺激、4 ℃冰水游泳、超聲刺激、夾尾、晝夜顛倒、足底電擊、禁水（24 h）束縛和禁食（24 h）等。每組動物每天隨機給予1種刺激，同一種刺激累計使用不超過4次。

2.4 行為學(xué)檢測

參照本課題組前期行為學(xué)檢測方法[29]，進(jìn)行行為學(xué)實驗，包括體質(zhì)量實驗、糖水偏愛實驗、曠場實驗和強迫游泳實驗。

2.4.1 體質(zhì)量實驗 在實驗第0、7、14、21和28天分別稱定大鼠體質(zhì)量。

2.4.2 糖水偏愛實驗 在實驗之前，需要進(jìn)行糖水偏愛訓(xùn)練。準(zhǔn)備1%蔗糖溶液和日常飲用水用于訓(xùn)練和實驗。每只大鼠（單籠飼養(yǎng)）飼養(yǎng)籠上放置2個水瓶，訓(xùn)練開始第1天給予2瓶1%蔗糖溶液，第2天將其中1瓶1%蔗糖水溶液換為日常飲用水。訓(xùn)練結(jié)束后，所有大鼠禁食禁水24 h，然后在12 h內(nèi)正式進(jìn)行糖水偏愛實驗測定糖水消耗量，實驗期間大鼠自由選擇飲用1%蔗糖水溶液或水。第0天測定糖水偏愛率的基線，第28天進(jìn)行糖水偏愛實驗，計算每只大鼠的糖水偏愛率。

糖水偏愛率＝消耗的蔗糖水溶液的質(zhì)量/(消耗的蔗糖水溶液的質(zhì)量＋消耗日常飲用水的質(zhì)量)

2.4.3 曠場實驗 實驗第0、7、14、21、28天，曠場實驗裝置的底部（100 cm×100 cm×40 cm）被等分成25個正方形，在相對安靜的環(huán)境里（≤60分貝）從16: 00～19: 00時進(jìn)行曠場實驗測試。將大鼠置于曠場實驗裝置中1 min以適應(yīng)環(huán)境，觀察大鼠穿越格數(shù)（至少3只爪子跨過網(wǎng)格線）和直立次數(shù)（兩前肢距離地面至少1 cm）。適應(yīng)環(huán)境1 min后，記錄4 min內(nèi)的大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)。

2.4.4 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗裝置為高50 cm、直徑20 cm的圓柱形有機玻璃容器，水溫（25±1）℃，水深30 cm。實驗第28天，每只大鼠接受15 min的強迫游泳訓(xùn)練，并在第29天進(jìn)行強迫游泳實驗。每只大鼠進(jìn)行強迫游泳實驗6 min，在最后4 min記錄不動時間。大鼠保持頭部懸浮在水面上并且無明顯掙扎的時間為不動時間。

2.5 PBMCs樣本收集

末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，大鼠ip 10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，用肝素鈉抗凝管收集血液約10 mL。取血1 h內(nèi)，取15 mL的離心管，先加入聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll-Hypaque）5 mL，按照全血量與分離液比例為1∶1，再沿壁緩慢加入抗凝血，室溫2000 r/min離心25 min，吸取血漿至離心管，再取離心管吸取PBMCs，加入適量清洗液，1000 r/min離心10 min，棄上清，清洗2次。根據(jù)行為學(xué)測試結(jié)果可以看出柴歸顆粒中劑量組的抗抑郁效果較好，更接近對照組，因此選用對照組、模型組和柴歸顆粒中劑量組大鼠PBMCs樣本進(jìn)行后續(xù)的RNA-seq實驗。在對照組、模型組和柴歸顆粒中劑量組中每組選取4個PBMC樣本進(jìn)行RNA-seq前樣本準(zhǔn)備，加入適量PBS溶液清洗細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清，清洗2次；加入適量Trizol試劑提取總RNA，反復(fù)吹打至PBMCs充分裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL無酶管中液氮速凍，于?80 ℃保存。

2.6 RNA-seq分析

利用RNA 6000Nanokit檢測儀檢測所提RNA的濃度和純度，質(zhì)檢合格后，通過Oligo（dT）磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA打斷到200～300 bp片段。隨后合成cDNA第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA，建立鏈特異性文庫。使用安捷倫2100生物分析儀對文庫進(jìn)行質(zhì)檢，采用第二代測序技術(shù)，基于Illumina HiSeq測序平臺，對文庫進(jìn)行雙末端測序，得到FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)（raw data）。使用Cutadapt軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，使用TopHat2軟件將過濾后得到的高質(zhì)量序列（cleaned data）的Reads比對到參考基因組上。

2.7 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

使用HTSeq統(tǒng)計每組樣本比對到每個基因上的Reads數(shù)，作為基因的原始表達(dá)量，然后采用FPKM對表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件：表達(dá)差異倍數(shù)＞1.2、＜0.05。采用R語言ggplots2軟件包繪制差異表達(dá)基因的火山圖，使用Venn圖統(tǒng)計差異基因個數(shù)以及各組差異分析之間的共有基因數(shù)量。為進(jìn)一步篩選顯著變化的基因群，采用STEM軟件將差異基因進(jìn)行趨勢分析。將差異基因注釋到京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)而確定差異表達(dá)基因主要參與的代謝途徑和信號通路。

2.8 qRT-PCR驗證

各組選取6只大鼠，使用Trizol試劑提取PBMCs中的總RNA。選取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中有趨勢表達(dá)的差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗證，作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt計算差異表達(dá)基因的mRNA相對表達(dá)量。胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3，）、單磷酸腺苷脫氨酶1（adenosine monophosphate deaminase 1，）、單磷酸鳥苷還原酶2（guanosine monophosphate reductase 2，）、胞質(zhì)-5′-核苷酸酶IIIA（5′-nucleotidase, cytosolic IIIA，）、腺苷酸脫氨酶（adenosine deaminase，）、嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，）、黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（xanthine dehydrogenase/oxidase，）、鳥嘌呤脫氨酶（guanine deaminase，）、嘌呤能受體P2X7（purinergic receptor P2X7，）、白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，）引物采用Primer Primer 5軟件設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因名基因號（ID）序列 (5’-3’)產(chǎn)物大小/bp Enpp3ENSRNOG00000013791F: CCATTGTCACGGGTTTGTAT121 R: CTCCACCAGGCAGGGTTA Ampd1ENSRNOG00000018656F: CAAGCCCTACCCTTACCCA 175 R: CTTCAGCTCCTTTAGCTCGTC Gmpr2ENSRNOG00000020216F: ATGGCAGGCAATGTGGTAA297 R: CCGTCTGAAATGATGTGGC Nt5c3aENSRNOG00000005981F: AGGATGGCCGATGGTGTA136 R: CAACCTCCAGTGATTCTTCTTT AdaENSRNOG00000010265F: GGGACTACGCAACATTATCG149 R: CTTCCTTTGCCTTCATCTCC PnpENSRNOG00000009982F: ACATCGACCTCAAGTGGCA106 R: GGGAAAGTTGGGTATCTCATT XdhENSRNOG00000007081F: TTTGCGAAGGATGAGGTTAC133 R: GGATTGTGATAATGGCTGGA GdaENSRNOG00000018282F: CCCTCAGTATGCCTTTGCT158 R: TGGTGGTGCCGTTCTTTA P2rX7ENSRNOG00000001296F: GTGCCATTCTGACCAGGGTTGTATAAA354 R: GCCACCTCTGTAAAGTTCTCTCCGATT IL1βENSRNOG00000004649F: TTGCTTCCAAGCCCTTGACT214 R: CTCCACGGGCAAGACATAGG ATCBENSRNOG00000034254F: GAGACCTTCAACACCCCAGC205 R: ATGTCACGCACGATTTCCC

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間使用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett-檢驗。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)檢測

3.1.1 體質(zhì)量實驗 如圖1-A所示，第0天，各組大鼠體質(zhì)量無差異，體質(zhì)量基線基本不變。如圖1-B所示，第28天，與對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著減輕（＜0.001）；與模型組比較，柴歸顆粒中劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加（＜0.05），表明柴歸顆粒能夠有效逆轉(zhuǎn)CUMS造模引起的大鼠體質(zhì)量減輕。

3.1.2 曠場實驗 如圖2所示，與對照組相比，模型組大鼠穿越格數(shù)和直立次數(shù)顯著減少（＜0.001），表明CUMS模型成功復(fù)制。與模型組比較，各給藥組大鼠穿越格數(shù)顯著增加（＜0.01、0.001），柴歸顆粒中劑量組大鼠直立次數(shù)顯著增加（＜0.05）。表明柴歸顆粒能夠有效改善CUMS抑郁大鼠的曠場活動情況，且柴歸顆粒中劑量組效果最佳。

C-對照組 M-模型組 P-鹽酸文拉法辛組 CG-L-柴歸顆粒低劑量組 CG-M-柴歸顆粒中劑量組 CG-H-柴歸顆粒高劑量組 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖2、3、7同

圖2 柴歸顆粒對抑郁大鼠曠場實驗中穿越格數(shù)和直立次數(shù)的影響(, n = 10)

3.1.3 糖水偏愛和強迫游泳實驗 如圖3所示，與對照組相比，模型組大鼠糖水偏愛率顯著降低（＜0.001），強迫游泳不動時間顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠糖水偏愛率顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），柴歸顆粒各劑量組大鼠強迫游泳不動時間顯著減少（＜0.05、0.01）。表明柴歸顆粒能夠顯著逆轉(zhuǎn)抑郁大鼠的快感缺失和行為絕望現(xiàn)象，具有顯著的抗抑郁的作用。

3.2 RNA-seq分析

3.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估 所建立的測序文庫中，12個樣品的原始數(shù)據(jù)為4.4×107～5.5×107，每個cDNA文庫平均獲得4.9×107個原始數(shù)據(jù)，其中12個樣品的Reads差異較小，質(zhì)量值≥20的堿基所占百分比（20）≥98.09%，質(zhì)量值≥30的堿基所占百分比（30）≥95.06%，表明測序結(jié)果較好，可用于后續(xù)的分析（表2）。

圖3 柴歸顆粒對抑郁大鼠糖水偏愛率和強迫游泳不動時間的影響(, n = 10)

3.2.2 差異表達(dá)基因分析 采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，如圖4所示，與對照組相比，模型組共有256個顯著差異表達(dá)基因，其中顯著上調(diào)的差異基因為105個，顯著下調(diào)的差異基因為151個；與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組共有2702個顯著差異表達(dá)基因，其中顯著上調(diào)的差異基因為1343個，顯著下調(diào)的差異基因為1359個。

3.2.3 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析 將篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，如圖5所示，與對照組相比，模型組差異表達(dá)基因顯著富集到的信號通路主要有B細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT）信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號通路等，研究報道這些信號通路與抑郁癥的發(fā)病機制密切相關(guān)[30-32]。差異表達(dá)基因顯著富集到的代謝通路主要有糖胺聚糖生物合成和嘌呤代謝等。

如圖6所示，與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組差異表達(dá)基因顯著富集到的信號通路主要有Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信號通路、Notch信號通路、C型凝集素受體信號通路和p53信號通路等。差異表達(dá)基因顯著富集到的代謝通路主要有氧化磷酸化、丙酮酸代謝和嘌呤代謝等。

由上述結(jié)果可知抑郁發(fā)生時及柴歸顆粒干預(yù)后都顯著富集到嘌呤代謝通路。同時，基于目前調(diào)控嘌呤代謝抗抑郁的作用機制研究主要集中在嘌呤分解代謝，因此對測序結(jié)果進(jìn)一步挖掘，對嘌呤分解代謝和嘌呤能系統(tǒng)相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表3。柴歸顆粒干預(yù)后，在核苷酸水平上的和基因表達(dá)水平顯著降低；在核苷水平上的和基因表達(dá)水平顯著升高；在堿基水平上的基因表達(dá)水平顯著升高，和基因表達(dá)水平有升高趨勢；嘌呤能系統(tǒng)中的基因表達(dá)水平顯著降低，基因表達(dá)水平有降低趨勢。

表2 每個樣本cDNA文庫的測序數(shù)據(jù)

Table 2 Sequencing data of cDNA library in each sample

樣本原始條目原始數(shù)據(jù)Q30數(shù)據(jù)過濾條目測序錯誤率/%Q20/%Q30/% C155 056 7368 258 510 4007 851 013 2427 648 513 8000.001 32798.0995.06 C251 320 6487 698 097 2007 359 697 5137 093 751 7000.001 27398.3595.60 C354 235 1188 135 267 7007 768 675 0317 518 813 0000.001 35298.2595.49 C444 196 6146 629 492 1006 331 351 4906 208 298 1000.000 20698.2395.50 M151 243 9907 686 598 5007 353 804 3787 081 146 9000.000 22198.3195.67 M244 989 9266 748 488 9006 431 558 8276 264 447 0000.000 22098.1495.30 M355 924 1988 388 629 7007 862 156 4449 702 595 2000.001 27598.1695.74 M453 359 2588 003 888 7007 615 014 5867 434 598 2000.000 22398.1095.14 CG-M144 703 7146 705 557 1006 423 214 3756 194 225 7000.001 27598.4095.78 CG-M253 714 5968 057 189 4007 747 965 7677 427 522 7000.001 27298.5296.16 CG-M344 819 5286 722 929 2006 426 146 3226 217 330 2000.000 22298.3095.58 CG-M453 934 1668 090 124 9007 702 809 7747 504 610 7000.001 28098.1695.21

C-對照組 M-模型組 P-鹽酸文拉法辛組 CG-M-柴歸顆粒中劑量組

C-control group M-model group P-venlafaxine hydrochloride group CG-M-Chaigui Granules medium-dose group

紅色：上調(diào)基因；藍(lán)色：下調(diào)基因；灰色：無顯著性差異基因

圖5 CUMS造模后差異基因的KEGG通路富集分析

圖6 柴歸顆粒干預(yù)后差異基因的KEGG通路富集分析

3.3 嘌呤代謝分解途徑關(guān)鍵基因的qRT-PCR驗證

以為內(nèi)參，采用qRT-PCR法對RNA-seq結(jié)果中嘌呤分解代謝途徑上的8個關(guān)鍵基因、、、、、、、以及嘌呤能通路上2個基因、進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的驗證。結(jié)果如圖7所示，與對照組相比，模型組、、、、mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.01、0.001）；、、、mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.05）。與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組、、、mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），、、、mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

表3 柴歸顆粒干預(yù)抑郁大鼠嘌呤代謝途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)

Table 3 Chaigui Granules interfere with key genes expression in purine metabolism pathway in depressed rats

基因號（ID）基因P值倍數(shù)變化（vs模型）趨勢（vs模型） ENSRNOG00000018656Ampd10.013 567 5270↓ ENSRNOG00000013791Enpp30.227 797 8501.556 860 409↑ ENSRNOG00000005981Nt5c3a3.63×10?62.559 357 634↑ ENSRNOG00000009982Pnp0.228 367 9821.277 001 431↑ ENSRNOG00000018282Gda0.044 530 0182.159 190 490↑ ENSRNOG00000007081Xdh0.143 547 7981.326 008 513↑ ENSRNOG00000010265Ada0.054 164 4231.468 402 782↑ ENSRNOG00000020216Gmpr20.000 785 0940.484 805 139↓ ENSRNOG00000001296P2rx70.393 944 7650.322 012 382↓ ENSRNOG00000004649IL1β0.009 203 8170.329 862 979↓

↑：上調(diào)；↓：下調(diào)

↑: up-regulated; ↓: down-regulated

圖7 qRT-PCR檢測Ada、Ampd1、Enpp3、Nt5c3a、Pnp、Gda、Gmpr2、Xdh、P2rX7和IL1β mRNA表達(dá)(, n = 6)

4 討論

CUMS是目前較為公認(rèn)的抑郁癥動物模型，聯(lián)合孤養(yǎng)的動物模型[33]能夠穩(wěn)定地模擬人類抑郁癥患者的核心癥狀，即快感缺失，且具有高度的有效性，基于此模型研究抑郁癥的病因?qū)W和抗抑郁藥的作用有重要的科學(xué)意義。本研究采用CUMS聯(lián)合孤養(yǎng)的抑郁模型，通過各種行為學(xué)指標(biāo)（體質(zhì)量、曠場實驗、糖水實驗和強迫游泳實驗）對柴歸顆粒進(jìn)行藥效學(xué)評價，同時通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對大鼠PBMCs樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，采用RNA-seq高通量測序技術(shù)對對照組、模型組和柴歸顆粒中劑量組的PBMCs樣本進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與對照組相比，模型組共篩選出256個差異表達(dá)基因；與模型組相比，柴歸顆粒中劑量組共篩選出2702個差異表達(dá)基因。KEGG通路富集顯示抑郁發(fā)生時及柴歸干預(yù)后都顯著富集到嘌呤代謝。然后利用qRT-PCR驗證嘌呤代謝過程中的8個關(guān)鍵基因、、、、、、、以及嘌呤能通路上的2個基因、的表達(dá)，驗證結(jié)果與RNA-seq結(jié)果基本一致。以上結(jié)果表明柴歸顆粒具有抗抑郁作用，其作用機制與調(diào)節(jié)嘌呤代謝途徑上的基因及嘌呤能受體和炎癥因子有關(guān)，該結(jié)果為后續(xù)柴歸顆?？挂钟糇饔脵C制的深入闡明提供了基礎(chǔ)。

多條證據(jù)顯示，抑郁發(fā)生時嘌呤代謝途徑中的代謝物發(fā)生明顯變化[34-37]。多種酶參與嘌呤代謝過程且在該過程中發(fā)揮著重要作用。其中，Nt5c3a和Pnp是嘌呤代謝核苷酸分解代謝過程重要的酶。Pnp和5′-核苷酸酶在正常T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的分化中起著重要作用[38]。Pnp的缺乏會使T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫力受到影響，還會導(dǎo)致三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）升高從而抑制核糖核苷酸還原酶，阻礙細(xì)胞分裂[39]。研究表明細(xì)胞內(nèi)Nt5c3a是干擾素和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)中的負(fù)表觀遺傳因子[40]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS抑郁大鼠PBMCs中和的表達(dá)降低，柴歸顆粒干預(yù)后這2種基因的表達(dá)顯著回調(diào)，提示其可能產(chǎn)生細(xì)胞因子信號的傳導(dǎo)并影響免疫細(xì)胞分裂和分化，與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系密切。

Ada是嘌呤代謝中的一種關(guān)鍵酶，它通過將腺苷不可逆轉(zhuǎn)的脫氨為肌苷來調(diào)節(jié)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)腺苷的濃度[41-42]。Ada通過催化腺苷和脫氧腺苷的脫氨基作用影響甲基化過程、細(xì)胞生長和分化、細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制和免疫功能[43]。文獻(xiàn)報道Ada的主要功能是發(fā)展和維持免疫系統(tǒng)，在免疫細(xì)胞功能紊亂的疾病中，Ada的活性發(fā)生了變化[44]。淋巴細(xì)胞的增殖和分化也需要Ada[45-46]。Elgün等[47]發(fā)現(xiàn)在重度抑郁癥患者血清中Ada水平下降，Ada水平與抑郁癥癥狀存在負(fù)相關(guān)。也有研究表明Ada的活性降低導(dǎo)致腺苷濃度增加對于誘發(fā)抑郁癥是一個危險信號，外源性Ada加速腺苷的降解，能縮短小鼠自發(fā)電皮質(zhì)活動的抑郁癥持續(xù)時間[48]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS抑郁大鼠PBMCs中的表達(dá)顯著降低，與上述文獻(xiàn)報道一致，提示與對照組相比，CUMS抑郁大鼠的免疫系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂，給予柴歸顆粒后的表達(dá)水平顯著升高。提示柴歸顆?？赡芡ㄟ^回調(diào)的表達(dá)，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫功能恢復(fù)正常發(fā)揮抗抑郁作用。

Xdh位于所有有核細(xì)胞中，催化次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，這是嘌呤核苷酸分解代謝的另一種關(guān)鍵酶。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS抑郁大鼠PBMCs中的表達(dá)顯著升高。Herken等[49]發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清中Xdh水平顯著升高。在反復(fù)抑郁發(fā)作患者死后的腦組織中，在皮質(zhì)邊緣丘腦紋狀體區(qū)域檢測到Xdh活性增加[50]。Xdh催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化過程會產(chǎn)生活性氧和過氧化氫等[51]，從而導(dǎo)致以氧化應(yīng)激和炎癥為特征的病理反應(yīng)[52-53]。一項在人類和小鼠巨噬細(xì)胞中進(jìn)行的研究表明，Xdh引起的活性氧生成是促進(jìn)Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）活化的主要來源[54]。抑郁癥的發(fā)病機制與氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性的變化和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。Gürbüz等[55]使用Xdh抑制劑阿洛普利諾與經(jīng)典抗抑郁藥氟西汀作比較，發(fā)現(xiàn)使用Xdh抑制劑阿洛普利諾后抑郁大鼠的強迫游泳不動時間明顯減少，與氟西汀的抗抑郁效果一致。本研究結(jié)果顯示，給予柴歸顆粒后，的表達(dá)水平顯著降低，柴歸顆粒有改善抑郁癥的作用。綜上推斷，抑郁發(fā)生時Xdh水平升高引起活性氧的生成，可能進(jìn)一步促進(jìn)NLRP3活化，調(diào)控下游信號通路，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥為特征的病理狀態(tài)。而柴歸顆粒是否通過這一作用機制發(fā)揮抗抑郁需要進(jìn)一步研究驗證。

此外，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嘌呤能系統(tǒng)在抑郁癥發(fā)病機制中占有重要地位，通過調(diào)控嘌呤能系統(tǒng)可有效改善抑郁癥[56-59]。嘌呤能受體（腺苷P1受體中A1、A2A亞型與ATP結(jié)合的P2受體中P2X7亞型）與抑郁癥誘發(fā)神經(jīng)炎癥緊密相關(guān)[60-62]。研究顯示P2rX7主要位于興奮性細(xì)胞膜、神經(jīng)元和平滑肌中，也存在于粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和單核細(xì)胞中[63]。隨著抑郁發(fā)病機制的不斷研究，已證明抑郁癥機體中嘌呤能P2X7受體是一種成熟的炎癥小體激活劑，不僅可以激活NLRP3炎癥小體，還會促進(jìn)炎癥因子的釋放，P2X7受體已被公認(rèn)為炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子[64-66]。本研究發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠PBMCs中和的表達(dá)水平顯著升高，給予柴歸顆粒后，它們的表達(dá)水平顯著降低。提示抑郁癥的發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，柴歸顆粒能夠調(diào)控，減少炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗抑郁作用。但還需要進(jìn)一步驗證該通路蛋白的表達(dá)情況，明確柴歸顆粒抗抑郁的作用機制。

綜上所述，柴歸顆粒對抑郁大鼠有明顯的改善作用，其作用機制與調(diào)節(jié)嘌呤代謝途徑上的基因及嘌呤能受體和炎癥因子有關(guān)，為后續(xù)柴歸顆粒抗抑郁作用機制的深入研究提供了基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Antidepressant mechanism of Chaigui Granules based on transcriptomics of peripheral blood mononuclear cells

WANG Li-wen1, 2, 3, HUANG De-hua1, 2, 3, TIAN Jun-sheng1, 2, 3, GAO Xiao-xia1, 2, 3, QIN Xue-mei1, 2, 3, DU Guan-hua1, 4, ZHOU Yu-zhi1, 2, 3

1. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 2. The Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China 3. The Key Laboratory of Effective Substances Research and Utilization in TCM of Shanxi Province, Taiyuan 030006, China 4. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To analyze the transcriptomic characteristics of Chaigui Granules (柴歸顆粒) on peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of rats with chronic unpredictable mild stress (CUMS) model by RNA sequencing (RNA-seq), qRT-PCR was used to verify the mechanism.Rats were randomly divided into control group, model group, venlafaxine hydrochloride (35 mg/kg)group, and Chaigui Granules low-, medium- and high-dose (4.2, 8.3, 16.6 g/kg)groups. Rats were given drugs for 28 d while modeling. The efficacy of Chaigui Granules was evaluated through traditional pharmacodynamic indicators for depression (body weight, open field test, sugar water preference test and forced swimming test). RNA-seq technology was used to perform transcriptome sequencing analysis on rat PBMCs, screen for differential genes, and perform Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) analysis; The key expressed genes screened out were verified experimentally by qRT-PCR.Behavioral indicators showed that Chaigui Granules significantly improved the depressive behavior of CUMS model rats. Enrichment analysis of KEGG pathway in transcriptomics showed that when depression occurs after the intervention of Chaigui Granules, purine metabolism pathway was significantly enriched. Therefore, in-depth research was conducted on gene expression of metabolic enzymes related to purine metabolism. qRT-PCR results showed that compared with model group, expression levels of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3 (), cytosolic-5′-nucleotidase IIIA(), purine nucleoside phosphorylase() and adenosine deaminase() mRNA in PBMCs of Chaigui Granules group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), expression levels of xanthine dehydrogenase/oxidase(), purinergic receptor P2X7 (), interleukin 1β ()mRNA were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Chaigui Granules has antidepressant effects, its mechanism is related to the regulation of genes in purine metabolism pathway, purinergic receptorand inflammatory factor.

Chaigui Granules; chronic unpredictable mild stress depression; peripheral blood mononuclear cells; transcriptomics; purine metabolism

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2031 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.012

2021-12-02

國家自然科學(xué)基金資助項目（82074323）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81673572）；國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2017ZX09301047）；山西省留學(xué)回國人員科技活動擇優(yōu)資助項目（201991）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2020019）

王力文，男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理作用機制研究。E-mail: 18434375989@163.com

周玉枝，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制研究。E-mail: zhouyuzhi@sxu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]