范嗣剛，劉 勇,2，趙 超，侯思禹，邱麗華,2,

日本囊對蝦核因子κB抑制蛋白激酶ε2基因克隆及表達

范嗣剛1，劉 勇1,2，趙 超1，侯思禹3，邱麗華1,2,3

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384）

【目的】了解核因子κB抑制蛋白激酶ε2（IKKε2）基因在日本囊對蝦（）受細菌刺激后的應(yīng)答情況，以闡釋在對蝦先天免疫中所起的作用。【方法】從日本囊對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得日本囊對蝦（命名為）的cDNA序列，并進行生物信息學(xué)分析，采用熒光定量PCR分析的組織表達以及受哈維弧菌（）刺激后在肝胰腺組織的表達情況。【結(jié)果】全長為4 009 bp，其中開放閱讀框長2 337 bp，編碼778個氨基酸，5′UTR（Untranslated region）174 bp，3′UTR 1 498 bp。PjIKKε蛋白含有一個激酶結(jié)構(gòu)域、一個類泛素結(jié)構(gòu)域和一個TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。多重序列比對結(jié)果顯示，PjIKKε2蛋白序列與其他甲殼類IKKε的相似性高，在激酶結(jié)構(gòu)域保守性高。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，PjIKKε2與其他對蝦屬的IKKε聚集在一支。在日本囊對蝦9個組織中均有表達，在淋巴組織中表達量最高（< 0.05）。在哈維弧菌刺激6 h后，在肝胰腺中表達量顯著上調(diào)，達到最大值（< 0.05）。【結(jié)論】PjIKKε2參與了日本囊對蝦的先天免疫。

日本囊對蝦；核因子κB抑制蛋白激酶ε2；基因表達；先天免疫

先天免疫是機體抵御病原體侵犯的第一道防線[1]，依賴于核因子κB（Nuclear factor Kappa-B，NF-κB）和干擾素調(diào)控因子（interferon regulatory factor，IRF)）等轉(zhuǎn)錄因子的激活。核因子κB抑制蛋白激酶 [inhibitor of κB kinase (IKK)] 家族能激活NF-kB信號途徑[2]。該途徑與I型干擾素、炎癥細胞因子和趨化因子共同作用，消除細菌和病毒的入侵[3-4]。因此，IKK/NF-κB是動物先天免疫系統(tǒng)中一條重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已廣受關(guān)注[2,5-6]。

在哺乳動物中，IKK家族成員分為經(jīng)典的IKK（IKKα、IKKβ）和非經(jīng)典的IKK（IKKε和TANK結(jié)合激酶）[7]。IKKε有IKKε1和IKKε2兩種。IKKε主要在胰腺、胸腺和脾臟中表達，在T細胞中也有表達。然而，許多細胞在佛波酯、脂多糖、病毒RNA等微生物產(chǎn)物和TNF、IL-1、IL-6等細胞因子誘導(dǎo)下，IKKε表達量快速上調(diào)[9]。IKKε通過激活體內(nèi)NF-κB、IRF3等轉(zhuǎn)錄因子，使IκB α、IFN-α和IFN-β蛋白磷酸化[10-11]，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細胞凋亡等生理活動。當(dāng)病毒入侵時，IKKε能使IRF3和IRF7磷酸化，也能使IκBa、IKKb、NF-κB亞基p65等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而激活NF-κB[10-11]。

日本囊對蝦（）又稱花蝦、九節(jié)蝦，屬亞熱帶種類，主要分布在日本、朝鮮沿海，非洲東海岸，印度-西太平洋熱帶，中國東南沿海等地[12]，是我國對蝦養(yǎng)殖的主要物種之一，有生長快、適應(yīng)性強、食性雜、耐低氧等特點[12]。目前，已有日本囊對蝦先天免疫研究[13-14]，IKKε在甲殼類亦有少量研究[5,15-16]。在斑節(jié)對蝦（）中，IKKε2和IKKε1均參與先天免疫過程，可能在細胞因子系統(tǒng)和信號傳導(dǎo)交互作用中起正向作用[5]。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦（）IKKε通過激活NF-kB 信號途徑激活A(yù)MP表達，抵御白斑綜合征病毒（WSSV）感染[15]。Jiang等[16]獲得擬穴青蟹（）的、基因，發(fā)現(xiàn)在注射溶藻弧菌（）或poly (I:C)后，表達量顯著增多。而IKKε是否參與日本囊對蝦的先天免疫，未見報道。本研究獲得日本囊對蝦基因序列，研究哈維弧菌刺激后在肝胰腺的表達情況，為探究該基因在日本囊對蝦先天免疫中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

體質(zhì)量（21.3 ± 2.0）g的日本囊對蝦，購自湛江某對蝦養(yǎng)殖場。剖取對蝦肝胰腺、肌肉、淋巴鰓、神經(jīng)節(jié)、胃、心、血淋巴、眼柄等組織，液氮冷凍后保存，用于克隆和組織表達分析。

隨機選取400尾健康有活力體質(zhì)量（30 ± 2）g的日本囊對蝦，在鹽度35、水溫（25 ± 1）℃水池中暫養(yǎng)3 d，用于菌液注射實驗。養(yǎng)殖期間，每天換水2/3，及時清除池內(nèi)的殘留物，投喂對蝦飼料。

1.2 細菌刺激實驗

實驗分為實驗組和對照組2組，每組3個平行組，即每組設(shè)3桶（水體為1 000 L），每桶50尾蝦。實驗組每桶中的每尾蝦腹腔注射50 μL 1 × 106cfu?mL-1哈維弧菌懸液，對照組每尾蝦腹腔注射50 μL磷酸鹽緩沖液（PBS, 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）。在注射后0、6、12、24、48、72 h分別取蝦5尾，剖取肝胰腺，液氮冷凍后移至– 80℃冰箱中保存。

1.3 RNA提取和cDNA合成

用Tirzol（Invitrogen，美國）提取上述樣品的RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000分別檢測RNA完整性和濃度。

用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成肌肉組織cDNA的第一條鏈。用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，日本）試劑盒，以IKKε cDNA序列為模板，以O(shè)ligo-dT為引物進行反轉(zhuǎn)錄，得到IKKε的cDNA鏈，用于實時定量PCR實驗。

1.4 日本囊對蝦IKKε基因克隆和測序

從日本囊對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRX2030618）中獲得基因cDNA序列。用Primer Premier 5設(shè)計引物-S1和-A1（表1）。PCR反應(yīng)體系為20 μL，含13.8 μL ddH2O，2.0 μL 10×PCR Ex Buffer（Mg2+Plus），1.6 μL dNTP（各2.5 mmol/L），0.8 μL正/反向引物（10 mmol/L），0.8 μL cDNA模板，0.2 μL ExTaq（5 U/μL）（TaKaRa，日本）。反應(yīng)程序：94℃，3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 50 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min。用膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]回收PCR產(chǎn)物，在16 ℃條件下將純化的PCR產(chǎn)物連接到pMDTM18-T（TaKaRa）載體中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。通過菌液PCR篩選出陽性克隆，送至廣州擎科生物公司（廣州）測序。

表1 引物序列

1.5 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ orffinder/）查找開放閱讀框和預(yù)測編碼蛋白序列；用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測編碼蛋白理化特性；用Global Align軟件分析蛋白相似性。用Conserved domains軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白結(jié)構(gòu)；預(yù)測糖基化位點用NetNGIys 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）；用軟件SignalP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測蛋白信號肽結(jié)構(gòu)。用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM-2.0/) 預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；用Clustal X進行序列多重比對；用MEGA 7.0[17]的鄰接（Neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap置信值為1 000。

1.6 組織表達分析

用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)（Takara，日本）將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，每種組織cDNA設(shè)置3個重復(fù)，并稀釋至50 ng/μL，備用。用引物qIKKε-S和qIKKε-A（表1）進行熒光定量PCR，以日本囊對蝦為內(nèi)參基因。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書配制反應(yīng)體系并進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)；最后進行溶解曲線反應(yīng)，以檢測擴增特異性。每種組織cDNA和內(nèi)參均設(shè)置3個平行。用2-ΔΔCt法[18]計算的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)< 0.05時差異顯著，< 0.01時差異極顯著，用Excel 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 IKKε的克隆與鑒定分析

獲得日本囊對蝦基因，命名為（GenBank號MZ707249）。cDNA全長4009 bp，其中開放閱讀框（ORF）長2337 bp，編碼778個氨基酸，5非編碼區(qū)長174 bp，3UTR長1498 bp。PjIKKε2蛋白理論分子質(zhì)量為88.076 ku，理論等電點pI為6.07。PjIKKε2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，含有一個激酶結(jié)構(gòu)域（第18－331位氨基酸）、一個類泛素結(jié)構(gòu)域（第310－388位氨基酸），一個TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（第407–670位氨基酸）。Global Align分析顯示，PjIKKε2蛋白序列與甲殼類IKKε的相似性均高于80%。PjIKKε2與PvIKKε2的相似性最高（89%），與HsIKKε的最低（27%）（表2）。氨基酸序列（圖2）多重比對結(jié)果表明，IKKε2蛋白在激酶結(jié)構(gòu)域中保守性較高，有140個完全保守的氨基酸（用‘‘*”標(biāo)記），89個相對保守的氨基酸（用‘‘:”和‘‘.”標(biāo)記），保守率高達70.68%。

PK為激酶結(jié)構(gòu)域；Ubl_TBK1_like為類泛素結(jié)構(gòu)域；TBK1_CCD1為TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域

表2 用于多重序列比對的IKKε蛋白及其與PjIKKε2的相似性

下劃直線為激酶結(jié)構(gòu)域，“*”, “:”和“.” 分別表示完全保守，保守性強和保守性弱的位點

圖3顯示，無脊椎動物（甲殼動物、昆蟲和海鞘）與脊椎動物各聚為一支，PjIKKε2與其他對蝦屬的IKKε聚集在一支。斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦的IKKβ氨基酸序列為外群。

2.2 PjIKKε2的組織表達

在日本囊對蝦9個組織中均有表達，其中在淋巴組織中表達量最高（0.05），其次是在神經(jīng)節(jié)和眼柄，在肝胰腺、肌肉、胃和心臟的表達量最低，差異不顯著（圖4）

2.3 哈維弧菌刺激后PjIKKε2的表達情況

注射哈維弧菌6 h后，在肝胰腺中的表達量顯著上調(diào)，達到最大值 (< 0.05)，隨后逐漸減弱并持續(xù)至72 h，48 h后恢復(fù)正常水平，在6、12和24 h，mRNA的表達量與0 h時有顯著差異 (< 0.05)（圖5）。

圖3 基于IKKε氨基酸序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹

不同字母表示差異顯著（P < 0.05）。Hep，肝胰腺；M，肌肉；L，淋巴；Gi，鰓；Ga，神經(jīng)節(jié)；S，胃；Hea，心；Hem，血淋巴；E，眼柄

不同字母表示有顯著差異（P < 0.05）

3 討論

本研究獲得日本囊對蝦基因的cDNA全長序列，其中ORF長2 337 bp，編碼778個氨基酸，含有一個激酶結(jié)構(gòu)域、一個類泛素結(jié)構(gòu)域，一個TANK結(jié)合激酶卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。斑節(jié)對蝦基因編碼710個氨基酸，凡納濱對蝦基因編碼704個氨基酸，均比的氨基酸序列短。PjIKKε2氨基酸的C端序列比斑節(jié)對蝦和凡納濱對蝦IKKε2氨基酸C端多70多個氨基酸。這段多出的序列功能需進一步研究。同時，這3種對蝦IKKε2蛋白序列均含有激酶結(jié)構(gòu)域。序列比對結(jié)果顯示，激酶結(jié)構(gòu)域在各物種中高度保守。激酶結(jié)構(gòu)域的功能是催化gamma-磷酸基團的轉(zhuǎn)移。另外，在日本囊對蝦PjIKKε2中有類泛素結(jié)構(gòu)域，這與Verhelst等[2]的報道一致。類泛素結(jié)構(gòu)域能優(yōu)化激酶活性[8]。系統(tǒng)進化樹表明，PjIKKε與其他對蝦IKKε聚為一支，與物種分類結(jié)果一致。

研究證明，IKKε主要在哺乳動物的胰腺、胸腺、脾臟等免疫相關(guān)組織和T細胞、白細胞、巨噬細胞、神經(jīng)細胞和星形狀膠質(zhì)細胞等細胞中表達[2,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在日本囊對蝦9個組織中均有表達。在其他甲殼動物中，在各組織中均有表達[5,15-16]，這可能說明在低等動物中，基因功能更加廣泛，在許多組織中均有作用。在淋巴組織中表達量最高。淋巴中有免疫因子，是對蝦主要的免疫組織[20]。這也說明的功能保守性，即主要在先天免疫中起作用。另外，在神經(jīng)節(jié)的表達量高，這與凡納濱對蝦的研究結(jié)果[15]相似。M?ser等[21]發(fā)現(xiàn)，IKKε通過激活NF-κB參與小鼠的神經(jīng)性疼痛。IKKε在對蝦神經(jīng)中的作用，還需進一步研究。

先天免疫是對蝦抵御外界病原體的第一道防線[20]。在機體感染病原后，宿主的模式識別受體能識別病原體的配體，從而引起一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過IKK復(fù)合物產(chǎn)生抗菌肽[22]。在脊椎動物中，IKKε及IKK相關(guān)的激酶能使IRF-3和IRF-7磷酸化，從而激活宿主的抗細菌反應(yīng)[23]。本研究中，注射哈維弧菌6 h后，在肝胰腺中的表達量顯著上調(diào)，達到最大值。在斑節(jié)對蝦注射哈維弧菌后，在血細胞的表達量在注射6 h時降低，在12 h時升至注射前，隨后逐漸降低[14]。在凡納濱對蝦中，注射溶藻弧菌6 h后，在肝胰腺的表達量上升，是0 h表達量的1.5倍，在24 h達到最大值（是0 h表達量的2倍）[15]。擬穴青蟹在注射溶藻弧菌6 h后，在肝胰腺的表達量達到最大值，隨后逐漸下降，在72 h時略有升高[16]。這些結(jié)果均說明甲殼類的參與了細菌引起的先天免疫應(yīng)答過程。

綜上，本研究克隆出基因cDNA全長，在哈維弧菌刺激下，mRNA表達表達量均出現(xiàn)不同程度的變化，表明基因參與了日本囊對蝦的先天免疫。這為研究IKKε2的免疫功能提供了理論依據(jù)，也為研究甲殼類動物的先天免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

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Characterization and Expression of Inhibitor-κB Kinase Epsilon 2 in

FAN Si-gang1, LIU Yong1,2，ZHAO Chao1, HOU Si-yu3, QIU Li-hua1,2,3

（1.;,;,,510300,;2.,201306,; 3.,,300384,）

【Objective】In order to investigate inhibitor κB kinase epsilon 2 (IKKε2) response of bacterial infection and elucidate the function of IKKε2 ininnate immunity.【Method】The full-length cDNA of(named) was identified and characterized with bioinformatics strategy.The expression ofwas detected in various tissues under normal condition and in hepatopancreas after the treatment with.【Result】PjIKKε2 cDNA was 4 009 bp length, including a 2 337 bp open reading frame (ORF) encoding 778 amino acid, a 174 bp 5′untranslated region (5′-UTR) and a 1 498 bp 3′-UTR.PjIKKε2 protien contain an N-terminal catalytic kinase domain, an ubiquitin-like domain and a TANK-binding kinase 1 coiled-coil domain.Multiple sequence alignment showed that PjIKKε2 share high identity with that of another IKKε2 of crustacean.The kinase domain was conserved in most species.The phylogenetic analysis suggested that PjIKKε2 was clustered with the closely related IKKs fromand.transcript was detected in all examined tissues with high mRNA expression in lymph.Following the infection of, thewas up-regulated significantly in hepatopancreas (< 0.05) and maximize at 6 h.【Conclusion】PjIKKε2 plays an important role in innate immunity of.

; inhibitor κB kinase epsilon 2; gene expression; innate immunity

S917.4; Q786

A

1673-9159（2022）02-0013-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.002

2021-10-09

國家自然科學(xué)基金（31802281）；廣東省重點領(lǐng)域研發(fā)計劃項目（2021B0202020002）；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費專項 (2020TD21) ；廣州市科技計劃項目（202102020487）；廣州市農(nóng)村科技特派員項目（20212100051）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項(2021TS03；2021SD11)

范嗣剛（1982―），男，博士，副研究員，從事海洋生物功能基因研究。E-mail: fansigang@scsfri.ac.cn

邱麗華（1971―），女，博士，研究員，從事海洋生物功能基因研究。E-mail: qiugroup_bio@outlook.com

范嗣剛，劉勇，趙超，等.日本囊對蝦核因子κB抑制蛋白激酶ε2基因克隆及表達[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2022，42（2）：13-19.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）