鄒家明，何珊，梁旭方，朱強(qiáng)勝

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心/

長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，武漢 430070

近年研究證據(jù)表明，魚類中存在營養(yǎng)感應(yīng)機(jī)制［1-2］，但氨基酸傳感機(jī)制與食物攝入調(diào)控的關(guān)系尚不清楚。魚類中關(guān)于氨基酸的研究，主要集中在亮氨酸和精氨酸，在肌肉和肝臟等外周組織，以及氨基酸水平變化對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的影響等方面［3-4］。有關(guān)魚類中組氨酸和纈氨酸通過下丘腦信號整合調(diào)節(jié)食物攝入的研究較少［5］。組氨酸是合成組胺的前體，在魚類中含量豐富，是水產(chǎn)動物飼料中不可或缺的一種必需氨基酸［5］。纈氨酸屬于支鏈氨基酸，是參與蛋白合成與代謝的重要成分之一。氨基酸代謝受損會改變攝食行為并調(diào)節(jié)下丘腦中的食欲神經(jīng)肽表達(dá)［6］。此外，魚類攝食的調(diào)控是通過中樞攝食系統(tǒng)和外周飽食系統(tǒng)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。腦室注射氨基酸后會直接引起魚類中樞系統(tǒng)對腦室氨基酸水平的感知從而傳遞攝食控制信號［7-8］，而魚類攝食剝奪或缺乏氨基酸的飼料會間接刺激機(jī)體外周系統(tǒng)對營養(yǎng)信號的感知進(jìn)一步調(diào)節(jié)飼料的攝入［3，9］。下丘腦中GCN2 信號通路是大多數(shù)真核生物中保守的氨基酸信號傳感途徑，可通過感知胞內(nèi)氨基酸水平，調(diào)節(jié)下游Eif2α 磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子atf4，進(jìn)而調(diào)節(jié)動物的攝食［10-11］。此外，下丘腦神經(jīng)系統(tǒng)中的兩類重要神經(jīng)元（NPY/AGRP 促食欲神經(jīng)元和POMC/CART 抑食欲神經(jīng)元）可根據(jù)機(jī)體的營養(yǎng)狀況整合攝食控制信號，調(diào)節(jié)動物的攝食行為［12］。

對于試驗(yàn)對象翹嘴鱖（Siniperca chuatsi），筆者所在課題組前期已采用腦室注射的方式開展相關(guān)研究［7-8］，證明此方法具有可行性。為了研究中樞神經(jīng)的直接信號感知以及外周組織的間接信號感知，本研究通過腦室注射組氨酸和纈氨酸和飼料缺乏組氨酸和纈氨酸2 種方式來探索這2 種氨基酸對翹嘴鱖攝食的影響，以及GCN2 信號通路和食欲因子在其中可能存在的調(diào)控作用，以期完善必需氨基酸調(diào)控翹嘴鱖攝食的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用翹嘴鱖及其餌料魚麥鯪（0.37±0.05 g）均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)鱖魚研究中心提供。翹嘴鱖人工配合飼料原料購自武漢高龍公司，飼料級氨基酸原料購自上海源葉生物科技有限公司，細(xì)胞級L-組氨酸、L-纈氨酸（晶體氨基酸）購自Sigma-Aldrich 公司，GCN2抑制劑GCN2iB購自MCE公司。

1.2 試驗(yàn)分組及處理

1）腦室注射試驗(yàn)。篩選40 尾體表無傷、攝食狀態(tài)優(yōu)良的翹嘴鱖，平均質(zhì)量（40±4）g，隨機(jī)分為4組，每組10 尾，每個(gè)水族缸（50 cm×40 cm×40 cm）投放1尾翹嘴鱖。正式試驗(yàn)前在循環(huán)水系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周，每天2 次飽食投喂，記錄攝食的餌料魚數(shù)量以供正式試驗(yàn)時(shí)餌料魚的投放數(shù)作參考。正式試驗(yàn)時(shí)，24 h 饑餓處理后用MS-222 將翹嘴鱖麻醉，選用10 μL 量程的微量注射器進(jìn)行腦室注射，腦室注射方法參照文獻(xiàn)［8］。氨基酸溶于PBS、注射劑量參照文獻(xiàn)［8］，GCN2 抑制劑GCN2iB 參照試劑說明溶于二甲基亞砜（DMSO）。試驗(yàn)設(shè)空白對照組、氨基酸注射組、GCN2iB 抑制組和藥物對照組。其中空白對照組注射2 μL DMSO 30 min后再注射2 μL PBS，氨基酸組注射2 μL DMSO 30 min 后再注射20 μg（溶于2 μL PBS）的L-組氨酸、L-纈氨酸，抑制劑組注射10 μg GCN2iB（溶于2 μL DMSO）30 min 后再注射20 μg（溶于2 μL PBS）的L-組氨酸、L-纈氨酸，藥物對照組注射10 μg GCN2iB（溶于2 μL DMSO）30 min后再注射2 μL PBS。注射后15 min內(nèi)翹嘴鱖恢復(fù)正常運(yùn)動，每缸投放30 尾餌料魚，統(tǒng)計(jì)注射后1 h 及4 h各組累計(jì)攝食量。

2）飼料馴飼試驗(yàn)。200 尾翹嘴鱖平均質(zhì)量為（250±10）g，暫養(yǎng)至水泥池中，篩選108 尾大小規(guī)格一致、體表無傷、攝食狀態(tài)優(yōu)良的翹嘴鱖隨機(jī)分為3組（對照組、組氨酸缺乏組、纈氨酸缺乏組），每組6個(gè)網(wǎng)箱，每個(gè)網(wǎng)箱（100 cm×100 cm×100 cm）投放6 尾翹嘴鱖，網(wǎng)箱內(nèi)水溫維持在（26±1）℃。飼料馴飼試驗(yàn)前1周，采用對照組飼料投喂使試驗(yàn)魚的生理狀態(tài)趨于同一水平，各組飼料成分含量見表1、表2。其中，魚粉中含64.5%粗蛋白和8.6%粗脂肪；酪蛋白中含88.7%粗蛋白和0.8%粗脂肪；淀粉中含0.3%粗蛋白和0.2%粗脂肪；魚油中含98%粗脂肪；大豆油中含98%粗脂肪。維生素預(yù)混料的成分為（每千克飼料）：膽堿，1 000 mg；肌醇，600 mg；維生素A，40 mg；維生素D，60 μg；維生素C，210 mg；維生素E，200 mg；維生素K，10 mg；維生素B6，20 mg；維生素B12，0.1 mg；煙酸，200 mg；泛酸，50 mg；葉酸，10 mg；硫胺素，15 mg；核黃素，25 mg；生物素，3.2 mg。礦物質(zhì)預(yù)混料（每千克飼料）：CaHPO4，94.9 g；KCl，7.1 g；MgSO4，4.6 g；NaCl，3.8 g；CuSO4，39.1 mg；FeSO4，455.4 mg；ZnSO4，220.3 mg；MnSO4，39.9 mg；Na2SeO3，2.0 g；KI，1.4 mg；Na2MoO4，0.4 mg；CoSO4，0.1 mg；KF，0.8 mg。氨基酸預(yù)混料中含86.27%粗蛋白。

表1 試驗(yàn)飼料成分Table 1 Ingredients of experimental feed%

表2 氨基酸預(yù)混料成分Table 2 Compositions of amino acid premix%

每天2 次飽食投喂，分別在上午8：00 和下午5：00，且每次在固定點(diǎn)喂食，選用滴水、流水等作為投喂信號。為防止飼料過于硬，在投飼前噴灑池水，以改善飼料口感。正式試驗(yàn)中，提前24 h 饑餓處理后，對照組投喂氨基酸完全飼料，組氨酸缺乏組投喂組氨酸缺乏飼料，纈氨酸缺乏組投喂纈氨酸缺乏飼料，每組投飼30 min后，待80%的翹嘴鱖不攝食則停止投喂，計(jì)算攝入飼料顆粒數(shù)。每2次試驗(yàn)之間間隔3 d，期間用對照組飼料投喂以恢復(fù)各組翹嘴鱖生理狀態(tài)。

1.3 總RNA提取及q-PCR分析

依據(jù)生產(chǎn)商的試劑說明，使用Trizol Reagent（TaKaRa 公司）提取翹嘴鱖下丘腦組織總RNA。然后使用多重檢測酶標(biāo)儀（BioTek，Winooski，USA）檢測總RNA 濃度后，-80 ℃保存樣品。依據(jù)產(chǎn)品說明書，使用Hiscript II Q RT SuperMix for qPCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊，南京）將總RNA（1 μg）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃短期保存。

在鱖基因組數(shù)據(jù)庫中檢索相關(guān)基因的全長序列，由Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物。目的基因的表達(dá)量使用MyiQTM 2雙色實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，USA）進(jìn)行檢測。mRNA的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃3 min 預(yù)變性，然后在95 ℃變性30 s，退火30 s，設(shè)置40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析從65 ℃開始，0.5 ℃/6 s 逐漸增加至95 ℃，以驗(yàn)證PCR反應(yīng)的特異性。rpl13a作為內(nèi)部對照基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算法量化目的基因的相對表達(dá)水平。各基因的PCR引物序列等信息詳見表3。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 3 Primer sequences used for RT-PCR

1.4 Western blotting

下丘腦組織使用含1% PMSF 和1%去磷酸化酶抑制劑的1×RIPA 蛋白裂解液（碧云天，中國）獲取總蛋白。在4 ℃下以12 000 r/min 離心10 min 后，收集上清液并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（翊圣，上海）檢測蛋白質(zhì)濃度。按比例添加5×SDS 蛋白上樣緩沖液（碧云天，中國），混勻后于95 ℃高溫變性10 min。取等量變性后的蛋白于10%SDS-PAGE中電泳分離條帶，采用濕式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio Rad，USA）將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（Millipore，USA）。1×TBST（含0.1%Tween 20）洗膜2次后，在含10%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉4 h，然后4 ℃過夜孵育一抗。目的抗體為P-eIF2a（1∶1 000，CST）、ATF4（1∶1 000，CST）、P-S6（1∶1 000，CST），內(nèi)參抗體選用β-tubulin（1∶2 000，Bioss）。一抗4 ℃過夜孵育結(jié)束后，1×TBST（含0.1%Tween 20）洗膜2 次，二抗室溫孵育1 h。二抗選用Goat-anti-rabbit（1∶30 000，CST）、Goat-anti-Mouse（1∶15 000，CST）。 1×TBST（含0.1% Tween 20）洗膜4 次后，于掃膜儀（Licor Odyssey，USA）中顯影成像，用Image J 軟件進(jìn)行條帶分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組數(shù)據(jù)之間的差異，使用單因素方差分析（ANOVA）和Duncan’s多重比較分析單變量多組數(shù)據(jù)，使用雙因素方差分析（ANOVA）和Duncan’s多重比較分析雙變量多組數(shù)據(jù)。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 腦室注射組氨酸或纈氨酸對翹嘴鱖攝食的影響

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析腦室注射組別與攝食統(tǒng)計(jì)時(shí)間對翹嘴鱖攝食量的影響無交互性（P＞0.05）。與空白對照組（DMSO+PBS）相比，注射20 μg 組氨酸或纈氨酸1 h 后均能顯著降低翹嘴鱖的攝食量（P＜0.05），注射組氨酸4 h 后對翹嘴鱖的攝食量無影響（P＞0.05），而注射纈氨酸4 h后能夠顯著降低翹嘴鱖的攝食量（P＜0.05）。此外，注射10 μg GCN2iB，可使注射組氨酸1 h 后降低的攝食水平恢復(fù)，但對注射纈氨酸引起的攝食降低無恢復(fù)作用（P＞0.05）。同時(shí)注射10 μg GCN2iB 和20 μg 組氨酸時(shí)，4 h 組攝食量顯著高于1 h組（P＜0.05）（圖1）。

圖1 腦室注射組氨酸（A）或纈氨酸（B）后翹嘴鱖的累計(jì)攝食量Fig.1 Accumulative food intake of Chinese perch after ICV administration with histidine（A）or valine（B）

2.2 飼料中缺乏組氨酸或纈氨酸對翹嘴鱖攝食的影響

試驗(yàn)一共開展5 次獨(dú)立的攝食量統(tǒng)計(jì)，且每2 次試驗(yàn)之間間隔3 d，間隔期間投喂對照組飼料以恢復(fù)各組翹嘴鱖的生理水平。結(jié)果顯示，與對照組飼料相比，翹嘴鱖對缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料單次實(shí)驗(yàn)攝食量整體呈降低的趨勢（圖2A、B），而且對缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料累計(jì)攝食量極顯著減少（P＜0.01）（圖2C、D）。

圖2 翹嘴鱖對缺乏組氨酸或纈氨酸飼料的攝食量Fig.2 Food intake of Chinese perch on deprived feed of histidine or valine

2.3 飼料中缺乏組氨酸或纈氨酸對翹嘴鱖下丘腦GCN2信號通路的影響

與對照組相比，翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料后，下丘腦中GCN2 信號通路下游轉(zhuǎn)錄因子atf4的基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖3A），但Peif2α 的蛋白水平無顯著性差異（P＞0.05）（圖3B、C）。

圖3 翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸飼料后下丘腦P-eif2α和atf4表達(dá)量Fig.3 Expression of P-eif2α and atf4 in hypothalamus after ingesting deprived feed of histidine or valine in Chinese perch

2.4 飼料中缺乏組氨酸或纈氨酸對翹嘴鱖下丘腦食欲基因的影響

翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料后，其下丘腦食欲基因的表達(dá)變化如圖4 所示。與對照組相比，翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料后下丘腦npy、agrp基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)下降的趨勢（圖4A、B），且npy基因的mRNA 表達(dá)水平受到顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖4A），而pomc、cart基因的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)上升的趨勢（圖4C、D）。

圖4 翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸飼料后下丘腦食欲基因的表達(dá)變化Fig.4 Expression changes of appetite genes in the hypothalamus after ingesting deprived feed of histidine or valine in Chinese perch

3 討 論

氨基酸是參與機(jī)體合成代謝的重要物質(zhì)，食物中氨基酸的豐度一定程度上影響了動物對食物的攝入量。本研究結(jié)果顯示，腦室注射20 μg 組氨酸或纈氨酸1 h 后，翹嘴鱖的攝食量顯著降低，表明腦室組氨酸或纈氨酸濃度的升高可在短時(shí)間內(nèi)迅速抑制食物的攝入。這與虹鱒腦室注射亮氨酸后攝食減少［13］、大鼠腹腔注射組氨酸2 h后其食物攝入量受到抑制［14］的結(jié)果一致。而這也許是因?yàn)橐环N氨基酸的濃度過高會影響其他氨基酸的吸收效率，從而間接影響魚類的攝食生長［15］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)同時(shí)注射氨基酸感知通路關(guān)鍵因子GCN2 的抑制劑GCN2iB 和組氨酸1 h后會使翹嘴鱖下降的攝食水平恢復(fù)，表明GCN2 信號通路被抑制后，組氨酸將無法發(fā)揮抑食作用。但GCN2 信號通路被抑制4 h 后，腦室注射纈氨酸的抑食作用依然存在，可能因?yàn)槔i氨酸作為支鏈氨基酸還受到了mTOR 信號通路的調(diào)控［8］。以上結(jié)果表明，GCN2信號通路可能參與了腦室注射組氨酸抑制翹嘴鱖攝食行為的調(diào)節(jié)。

動物通常會拒絕必需氨基酸缺乏的食物，這是一種適應(yīng)性行為［16］，食欲降低、生長緩慢、飼料利用率低是魚類氨基酸不足的主要癥狀［17］。本研究對翹嘴鱖投喂缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料，結(jié)果顯示翹嘴鱖會顯著減少對缺乏組氨酸或纈氨酸飼料的攝入。類似地，大黃魚攝食缺乏蛋氨酸的飼料后，其食欲減弱、攝食量降低［18］。用缺乏纈氨酸的飲食喂食大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠產(chǎn)生了嚴(yán)重的厭食癥（食物攝入量減少80%）［19］。動物會減少單一必需氨基酸缺乏食物的攝入量，血清中所含有的該種必需氨基酸水平降低，而整體或其他氨基酸水平增加，缺乏非必需氨基酸不會導(dǎo)致動物體內(nèi)氨基酸的消耗［20］。因此，本研究組氨酸或纈氨酸缺乏飼料可能引起血液中氨基酸失衡，而這也許導(dǎo)致翹嘴鱖對該氨基酸缺乏食物的拒食。此外，前梨狀皮質(zhì)（anterior piriform cortex，APC）中的神經(jīng)元能夠直接感知食物攝入后血液中氨基酸失衡從而迅速激活蛋白激酶GCN2［21］。小鼠攝食必需氨基酸缺乏的膳食后，GCN2可識別必需氨基酸的消耗，并引起飲食拒絕及相應(yīng)的適應(yīng)性策略［22］。然而，本研究結(jié)果顯示翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料后，下丘腦GCN2 信號通路Eif2α蛋白磷酸化水平無顯著變化，但下游atf4基因表達(dá)受到顯著性抑制。有研究表明，氨基酸缺乏對于atf4的激活存在定時(shí)調(diào)控，即長時(shí)間的氨基酸缺乏會引起atf4 活性的降低以恢復(fù)機(jī)體整體蛋白的合成［23］。因此，本研究結(jié)果可能是因?yàn)槿拥臅r(shí)間點(diǎn)存在滯后產(chǎn)生的。但飼料中缺乏組氨酸或纈氨酸引起的攝食抑制與GCN2信號通路仍存在相關(guān)性。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是動物攝食的主要調(diào)節(jié)器，接受外周刺激，感受血液中的營養(yǎng)和激素信號，影響中樞食欲因子的表達(dá)，最終調(diào)節(jié)攝食量。有研究表明不平衡氨基酸飲食攝入對腦中氨基酸濃度的影響主要集中在下丘腦區(qū)域［24］，NPY/AGRP 和POMC/CART 神經(jīng)元則是下丘腦中參與攝食調(diào)控的一級神經(jīng)元［25］。因此，為了進(jìn)一步研究翹嘴鱖下丘腦對氨基酸不平衡飲食的響應(yīng)，我們檢測了4種食欲因子的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，翹嘴鱖攝食缺乏組氨酸或纈氨酸的飼料后下丘腦食欲因子npy基因的mRNA 表達(dá)水平顯著降低，但agrp、pomc、cart基因的mRNA 表達(dá)水平無顯著變化。筆者所在課題組以往研究結(jié)果表明組氨酸引起翹嘴鱖攝食減少與npy基因的表達(dá)降低有關(guān)［7］。類似地，大鼠與小鼠喂食纈氨酸缺乏飲食后，npy基因的mRNA表達(dá)水平也有降低的趨勢［26］。以上結(jié)果表明飼料中缺乏組氨酸或纈氨酸可能通過下調(diào)npy基因的表達(dá)從而抑制翹嘴鱖的攝食量。

綜上所述，組氨酸和纈氨酸通過腦室注射和飼料缺乏的方式均可抑制翹嘴鱖攝食，且與GCN2 信號通路有關(guān)，飼料缺乏組氨酸或纈氨酸可能通過下調(diào)促食欲因子npy基因的表達(dá)起到抑食作用。