張康玉，蔣正軒，陶黎明，鮑 寧，李 凱，劉 勇

0引言

青光眼是一類以眼內(nèi)壓的相對(duì)或絕對(duì)升高引起視神經(jīng)損害及視功能不可逆損傷為特征的眼科常見疾病，以發(fā)病率高、病情復(fù)雜、術(shù)后并發(fā)癥較多及手術(shù)成功率較低為主要特點(diǎn)[1]。而難治性青光眼是一組病因多樣、病情復(fù)雜、治療棘手的疾病，青光眼引流物最初的引入即是為治療難治性青光眼，目前該方法仍是難治性青光眼主要的治療手段[2]，然而手術(shù)成功率仍相對(duì)較低，青光眼引流閥植入術(shù)后早期和晚期成功率分別約80%和50%[3]，其主要原因?yàn)樾g(shù)后閥體周圍嚴(yán)重的炎癥及免疫反應(yīng)，成纖維細(xì)胞和膠原纖維增生包裹，致引流不暢，眼內(nèi)壓再次升高[4]。術(shù)后炎癥反應(yīng)在術(shù)后瘢痕形成過程中起到重要作用，而相關(guān)研究顯示白細(xì)胞介素(IL)類炎癥因子在術(shù)后炎癥細(xì)胞浸潤、組織損傷及修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用[5]。已有研究顯示IL-10不僅具有炎癥抑制和免疫調(diào)節(jié)作用[6-7]，亦具有抑制矽肺、炎性腸道疾病及肝纖維化的作用[8-10]，而在青光眼引流物植入術(shù)后纖維化過程中的作用研究較少。因此本研究通過不同的引流物材料植入及抗纖維化藥物的應(yīng)用，擬在球結(jié)膜下形成不同的瘢痕組織，檢測(cè)并比較術(shù)后各組織中不同時(shí)間段IL-10的表達(dá)水平，揭示其對(duì)青光眼引流物植入術(shù)后炎癥及纖維化的影響，為探討其在青光眼引流物植入術(shù)后瘢痕化的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料購置標(biāo)準(zhǔn)新西蘭大白兔75只(約2.5kg)并飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。表面涂裹聚一氯對(duì)二苯(Parylene C)的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材料由美國加州大學(xué)提供，絲裂霉素C(MMC)、硅膠塊由安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。主要試劑：ELISA試劑盒(Elabscience公司)，RNA提取試劑盒(Magen公司、R4130-03)，逆轉(zhuǎn)錄試劑(Vazyme公司、R222-01)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(Vazyme公司、SYBR Green Master Mix)，兔抗兔IL-10多克隆抗體(北京Bioss，bs-0698R)，辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(北京中杉金橋公司，ZB-2301)。主要儀器設(shè)備：光學(xué)顯微鏡、石蠟切片機(jī)、RT-PCR儀(Aglient Technologies公司、型號(hào)：Stratagen Mx3000P)、分光光度計(jì)(Thermo公司、型號(hào)：NANODROP 2000c)、逆轉(zhuǎn)錄儀(MJ Research公司、型號(hào)：PTC-100)、酶標(biāo)儀(Cloud-Clone公司、型號(hào)：SMR16.1)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)[11]。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模采用隨機(jī)數(shù)字表法將75只新西蘭大白兔分為3組、每組25只：PMMA組、硅膠-MMC組及硅膠組。選擇左眼為手術(shù)眼，術(shù)前3d術(shù)眼點(diǎn)抗生素眼液，每天4次，預(yù)防感染。術(shù)前行全身麻醉(戊巴比妥鈉注射液耳緣靜脈給藥、40mg/kg)，縫線懸吊開瞼，聚維酮碘沖洗結(jié)膜囊，以穹窿為基底部作球結(jié)膜瓣，向上充分分離并植入5mm×5mm引流物材料塊(PMMA組在球結(jié)膜下植入聚一氯對(duì)二苯涂層包裹的PMMA塊；硅膠-MMC組于球結(jié)膜下植入硅膠塊，同時(shí)注射0.4mg/mL的絲裂霉素C 1mL；硅膠組于球結(jié)膜下植入硅膠塊)，間斷縫合球結(jié)膜瓣，結(jié)膜囊涂左氧氟沙星眼膏。分別于術(shù)后第1、3d，1、2、3、4、8wk，全身麻醉下取前房水；于第1、2、3、4、8wk，過量麻醉致死后取出植入物周邊結(jié)締組織(包括部分黏連鞏膜)，切割均分、稱重、清洗(9%氯化鈉注射液)，分別置于冰箱(-80℃)和多聚甲醛溶液(10%)中保存。

1.2.2ELISA檢測(cè)房水中IL-10蛋白的含量收集兔前房水，采用ELISA試劑盒檢測(cè)房水中IL-10蛋白的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值，分別繪制三組蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相對(duì)質(zhì)量濃度。為了確保結(jié)果的可靠性，每個(gè)樣本均進(jìn)行3次檢測(cè)后取平均值。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)結(jié)締組織中IL-10mRNA相對(duì)表達(dá)量根據(jù)RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green Master Mix試劑盒操作說明，首先提取總RNA，測(cè)定其質(zhì)量及濃度，再合成cDNA，熒光定量測(cè)定。為確保測(cè)定結(jié)果的可靠性，在熒光定量測(cè)定過程中，對(duì)每個(gè)樣本均進(jìn)行3次檢測(cè)后取平均值，采用2-ΔΔCt(ΔCt=sample-control)法計(jì)算IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR引物由通用生物公司在線設(shè)計(jì)及合成。內(nèi)參GAPDH前引物：AGCTGGTCATCAACGGGAAG，后引物：GGTTCACGCCCATCACAAAC；IL-10前引物：GAACCACAGTCCAGCCATCA，后引物：CTCCACTGCCTTGCTCTTGTT。

1.2.4石蠟切片的制備將多聚甲醛溶液固定的組織經(jīng)梯度乙醇充分脫水，二甲苯及無水乙醇透明，浸蠟包埋，連續(xù)切片(厚度5μm)，載玻標(biāo)記、烘干保存。

1.2.5HE染色法取1.2.4石蠟切片，復(fù)溫，二甲苯、乙醇浸泡脫蠟，蘇木精-伊紅(HE)染色法染色，封片保存。高倍顯微鏡(400×)下觀察切片組織、拍攝照片、計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞數(shù)。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色取1.2.4石蠟切片，常規(guī)脫蠟、高壓修復(fù)抗原，加對(duì)應(yīng)一抗、生物素化二抗、鏈霉素工作液，顯色并封片保存。高倍顯微鏡(400×)下觀察并拍照。以組織中出現(xiàn)棕褐色染色為陽性。通過Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)采集、分析處理圖像，計(jì)數(shù)平均吸光度(A)值，測(cè)定3個(gè)視野，取平均值。

2結(jié)果

2.1HE染色觀察成纖維細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞浸潤情況高倍鏡(400×)下觀察術(shù)后成纖維細(xì)胞增生明顯的結(jié)締組織(圖1)。第1wk，硅膠-MMC組、PMMA組和硅膠組組織中均存在細(xì)胞核增大、深染、分裂相增多、炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象，但硅膠組較其他兩組更顯著。第2wk，各組組織中炎癥細(xì)胞浸潤均較第1wk時(shí)減輕，成纖維細(xì)胞增生，硅膠組炎癥細(xì)胞最多，硅膠-MMC組炎癥細(xì)胞最少。與第2wk相比，第3wk各組組織中成纖維細(xì)胞增多，炎癥細(xì)胞明顯減少，其中硅膠組仍然最多，硅膠-MMC組最少。與第3wk相比，第4wk各組組織中成纖維細(xì)胞明顯增多，膠原纖維增生，而炎癥細(xì)胞明顯減少，硅膠組較PMMA組及硅膠-MMC組可見更為紊亂的成纖維細(xì)胞、密集交錯(cuò)分布的膠原纖維，仍伴有明顯炎癥細(xì)胞浸潤，硅膠-MMC組仍為最少。第8wk，各組組織中均可見較致密的膠原纖維交錯(cuò)呈旋渦狀或波紋狀等多樣性紊亂排列，硅膠組仍有少量炎癥細(xì)胞浸潤，其他兩組無明顯炎癥細(xì)胞。

圖1 HE染色觀察成纖維細(xì)胞增生和炎癥細(xì)胞浸潤情況 藍(lán)色箭頭：炎癥細(xì)胞；紅色箭頭：成纖維細(xì)胞。

2.2免疫組織化學(xué)染色觀察IL-10蛋白表達(dá)情況高倍鏡(400×)下觀察可見術(shù)后PMMA組、硅膠-MMC組和硅膠組結(jié)締組織中均存在大量的呈棕褐色染色的IL-10蛋白，圍繞鞏膜表面增生的成纖維細(xì)胞分布(圖2)。第1wk，IL-10在三組組織中的表達(dá)均明顯增多，硅膠組最顯著，硅膠-MMC組最少(F=19.791，P<0.001)；第2wk，IL-10在三組組織中的表達(dá)均較第1wk減少，硅膠-MMC組最少，硅膠組仍最多(F=20.047，P<0.001)；第3wk，IL-10在三組組織中的表達(dá)均較第2wk減少，硅膠組較其他兩組稍高，而PMMA組與硅膠-MMC組無明顯差異(F=7.521，P=0.008)；第4wk，IL-10在三組組織中的表達(dá)均較第3wk有所增加，硅膠組高于其他兩組，PMMA組與硅膠-MMC組亦無明顯差異(F=6.826，P=0.010)；第8wk，IL-10在三組組織中的表達(dá)較第4wk均明顯增多，增生細(xì)胞仍圍繞膠原纖維分布，硅膠組表達(dá)最多，瘢痕組織較少的硅膠-MMC組表達(dá)最少(F=12.382，P=0.001)，見圖3。

圖2 免疫組織化學(xué)染色觀察IL-10蛋白表達(dá)情況。

圖3 三組IL-10蛋白表達(dá)水平比較 aP<0.05 vs 硅膠組；cP<0.05 vs PMMA組。

2.3ELISA檢測(cè)房水中IL-10的表達(dá)術(shù)后三組房水中IL-10的表達(dá)呈現(xiàn)先增高再降低的趨勢(shì)，第3d達(dá)高峰。術(shù)后第1d～3wk，硅膠組房水中IL-10表達(dá)均明顯高于PMMA組與硅膠-MMC組，且術(shù)后第1～3d硅膠-MMC組房水中IL-10表達(dá)高于PMMA組；術(shù)后第1wk，PMMA組房水中IL-10表達(dá)高于硅膠-MMC組；術(shù)后第2～3wk，PMMA組與硅膠-MMC組房水中IL-10的表達(dá)無明顯差異；術(shù)后第4～8wk，三組房水中IL-10的表達(dá)均無明顯差異(F第1d=11.091，P第1d=0.002；F第3d=20.701，P第3d<0.001；F第1wk=28.039，P第1wk<0.001；F第2wk=13.818，P第2wk=0.001；F第3wk=8.141，P第3wk=0.006；F第4wk=2.208，P第4wk=0.153；F第8wk=2.759，P第8wk=0.103)，見圖4。

圖4 三組房水中IL-10的表達(dá) aP<0.05 vs 硅膠組；cP<0.05 vs PMMA組。

2.4RT-PCR檢測(cè)結(jié)締組織中IL-10mRNA的表達(dá)術(shù)后三組結(jié)締組織中IL-10 mRNA表達(dá)均明顯增高，但硅膠組增高最明顯，與PMMA組、硅膠-MMC組比較均有差異；術(shù)后第1、2、8wk，PMMA組與硅膠-MMC組IL-10 mRNA表達(dá)亦有差異(F第1wk=17.757，P第1wk<0.001；F第2wk=26.941，P第2wk<0.001；F第3wk=6.283，P第3wk=0.014；F第4wk=14.418，P第4wk=0.001；F第8wk=41.615，P第8wk<0.001)，見圖5。

圖5 三組IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量 aP<0.05 vs 硅膠組；cP<0.05 vs PMMA組。

2.5IL-10表達(dá)水平與成纖維細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析術(shù)后第4、8wk，高倍顯微鏡(400×)下，單位面積HE染色切片中成纖維細(xì)胞數(shù)與免疫組織化學(xué)染色中IL-10的表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.712、0.695，均P<0.05)，見圖6。

圖6 三組組織中IL-10表達(dá)水平與成纖維細(xì)胞數(shù)的相關(guān)性分析 A：術(shù)后第4wk；B：術(shù)后第8wk。

3討論

青光眼是致視神經(jīng)不可逆性損傷的眼病，以眼球脹痛、視力下降及特征性視野缺損為主要表現(xiàn)；高發(fā)病率[12-13]、視功能損傷不可逆性、難治性等為主要特征；控制眼內(nèi)壓仍是目前主要的治療方法[3]。難治性青光眼是最復(fù)雜的一組青光眼疾病，包括外傷性青光眼、角膜移植術(shù)后繼發(fā)性青光眼、無晶狀體或人工晶狀體植入術(shù)后青光眼、新生血管性青光眼、多次手術(shù)失敗的青光眼等。青光眼引流物植入術(shù)是抗青光眼的有效治療方法，亦是難治性青光眼的首選手術(shù)方法[2]；青光眼引流物材料以硅膠、PMMA較為多見，作為異物，植入球壁后易誘發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫排異反應(yīng)及成纖維細(xì)胞增生，導(dǎo)致瘢痕組織包裹植入物、引流受阻，手術(shù)失敗。因此檢測(cè)青光眼引流物植入術(shù)后瘢痕化組織中抑炎因子IL-10的表達(dá)及探討其對(duì)瘢痕化形成的影響有著極其重要的意義。

不同材料的青光眼引流物具有不同的組織相容性，植入后可引起不同的炎癥及免疫反應(yīng)[14]，MMC為鏈霉素中提取的抗代謝藥物，具有抗纖維組織增生作用，在臨床已廣泛應(yīng)用[15]。Parylene C是一種惰性的高分子材料，因具有良好的生物相容性及化學(xué)穩(wěn)定性，涂抹于青光眼引流物外層可以有效降低術(shù)后局部組織的炎癥反應(yīng)及成纖維細(xì)胞增生[11]。本研究選擇不同的材料植入兔球結(jié)膜下，再選擇性注射MMC，預(yù)計(jì)術(shù)后各組球結(jié)膜下形成不同的瘢痕。HE染色顯示，硅膠組術(shù)后早期的炎癥反應(yīng)及晚期瘢痕化水平最高；因MMC藥物的刺激作用，術(shù)后早期硅膠-MMC組的炎癥反應(yīng)高于PMMA組，但至術(shù)后第1wk，PMMA組炎癥因子的表達(dá)較硅膠-MMC組高，PMMA組的成纖維細(xì)胞增生及晚期瘢痕化水平亦較硅膠-MMC組高。提示本研究中各組不同時(shí)期形成不同的炎癥反應(yīng)及瘢痕化組織。

IL-10是在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用的因子，是由輔助性T2(Th2)細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制輔助性T1(Th1)細(xì)胞分泌作用，由嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、NK細(xì)胞等分泌，具有抗炎、抗免疫、抗纖維化及促進(jìn)修復(fù)等作用的多功能細(xì)胞因子[16-17]。IL-10的炎癥抑制作用在大量研究中得以證明，其可以抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等促炎因子的釋放，同時(shí)誘導(dǎo)炎癥因子的自噬作用[18]；亦可抑制T細(xì)胞增生和其細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如可以抑制CD4+細(xì)胞分化所必需的IL-23、IL-12等因子的分泌[7，19]；而且通過降低組織相容性復(fù)合體(MHC)和黏附分子的表達(dá)抑制排異反應(yīng)抗原，干擾抗原傳遞，抑制免疫反應(yīng)[20]。

IL-10對(duì)成纖維細(xì)胞增生及瘢痕化的作用也有大量研究，但具體作用目前尚不統(tǒng)一。Kathju等[21]研究顯示IL-10可以通過抑制炎癥及免疫反應(yīng)，同時(shí)分解增生的細(xì)胞基質(zhì)，抑制成纖維細(xì)胞增生及瘢痕形成。IL-10在塵肺的形成中具有抑制肺炎癥反應(yīng)的作用，而晚期因?qū)α馨图?xì)胞的抑制作用，具有促進(jìn)肺泡纖維化的增生作用[22]。Xie等[23]對(duì)瘢痕增生的研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后IL-10的高表達(dá)不僅具有抑制促炎因子(IL-1β、TNF-α、IL-6等)的分泌，減輕炎癥反應(yīng)及抑制細(xì)胞外間質(zhì)細(xì)胞增生的作用，同時(shí)可以抑制生長(zhǎng)因子[轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)等]的釋放，維持細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的平衡，抑制瘢痕形成。本研究顯示，IL-10 mRNA及蛋白的表達(dá)在術(shù)后早期炎癥反應(yīng)明顯時(shí)增加，炎癥反應(yīng)減輕時(shí)降低，在瘢痕化最明顯的硅膠組表達(dá)最高，在瘢痕化最輕的硅膠-MMC組表達(dá)最低；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，IL-10主要集中在增生的成纖維細(xì)胞周圍；在術(shù)后第4～8wk，炎癥反應(yīng)減輕而膠原纖維增生明顯時(shí)，IL-10的表達(dá)不減反增。上述結(jié)果表明抑炎因子IL-10不僅在術(shù)后早期炎癥反應(yīng)嚴(yán)重時(shí)增加，抑制炎癥作用，而且在術(shù)后晚期成纖維細(xì)胞及膠原纖維增生時(shí)增加，抑制其增生作用。

綜上所述，IL-10在青光眼引流物材料植入術(shù)后早期炎癥反應(yīng)明顯時(shí)表達(dá)增高，炎癥反應(yīng)減輕時(shí)減少，晚期膠原纖維增生時(shí)再次升高，提示IL-10可能在青光眼引流物植入術(shù)后早期有抑制炎癥的作用，晚期有抑制膠原纖維增生，減輕瘢痕化的作用。