劉語涵 李莉 張來斌 馬光皇 陳家力 肖海兵 朱天生 楊明祿

摘要：家蠶腸道菌群與蠶體對營養(yǎng)物質的消化吸收及健康密切相關。通過飼喂蘇優(yōu)一號家蠶3種不同處理的桑葉，探討不同處理桑葉飼喂對家蠶腸道菌群的影響及可能的作用機制，為新疆蠶區(qū)家蠶腸道微生物種類組成及多樣性差異提供一定的理論依據(jù)。以正常飼喂組、含沙桑葉組、高濕桑葉組等3種處理方式，飼喂5齡幼蟲，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法對家蠶腸道微生物進行DNA提取，之后通過瓊脂凝膠電泳檢測DNA的濃度，以16S rDNA高通量測序技術研究不同飼喂組家蠶腸道微生物種類組成及多樣性。結果表明，蘇優(yōu)一號優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria），優(yōu)勢菌科為Chloroplast-norank科和伯克氏菌科（Burkholderiaceae），優(yōu)勢菌屬為Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬、Tyzzerella-3屬等。正常桑葉飼喂組水桿菌屬的含量顯著高于其他處理，腸球菌屬（Enterococcus）僅存在于含沙桑葉飼喂組，而不動桿菌屬（Acinetobacter）僅在正常飼喂組。α多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)Simpson指數(shù)B處理顯著高于其他處理，Chao1、Faith_pd、Goods_coverage和Observed_species指數(shù)組間無差異，而Shannon和Pielou_e指數(shù)有差異但不顯著。說明桑葉表面沙塵和水分都能影響家蠶腸道微生物豐度，其中沙塵能夠影響腸道微生物群落結構。

關鍵詞：家蠶;腸道菌群;多樣性;干旱蠶區(qū);豐度

中圖分類號：S881.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0156-06

收稿日期：2021-07-13

基金項目：新疆建設兵團南疆重點產(chǎn)業(yè)科技支撐計劃（編號：2018DB004）。

作者簡介：劉語涵（1993—），山東菏澤人，碩士研究生，研究方向為農業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail：569175037@qq.com。

通信作者：楊明祿，博士，教授，碩士生導師，研究方向為農業(yè)昆蟲與害蟲防治。E-mail：ymlzkytd@163.com。

家蠶（Bombyx mori L.）屬于鱗翅目（Lepidoptera）蠶蛾科（Bombycidae），起源于我國北方野桑蠶（Bombyx mandarina），幼蟲均以桑葉為食，家蠶經(jīng)過幾千年的馴化與選育，已有3 000多個品種[1-3]。家蠶也是重要的生物學模型和模式昆蟲之一，具有遺傳背景清楚、個體大、易飼養(yǎng)等優(yōu)勢，在生物學、遺傳學和昆蟲免疫學領域發(fā)揮著重要的作用[4]。對于家蠶腸道微生物，早在20世紀60年代日本學者就利用培養(yǎng)基對家蠶幼蟲的腸道細菌有了初步的研究[4]。早期主要研究家蠶疾病相關微生物，如白僵菌、綠僵菌、微孢子蟲、病原細菌及病毒等病原微生物經(jīng)消化道的侵染過程。目前，越來越多的研究人員開始關注鱗翅目昆蟲腸道微生物的多樣性與宿主的關系及在昆蟲資源和保護中的作用[5]。家蠶腸道微生物以細菌為主，優(yōu)勢菌有微球菌科、芽孢桿菌科、短桿菌科、乳桿菌科、腸桿菌科、Peudomonadaceae、伯克氏菌科、毛螺菌科、針葉樹科，其次豐富的菌種為表皮葡萄球菌屬、Tyzzerella-3屬、Aquabacterium屬，蠟樣芽孢桿菌屬、金黃色葡萄群菌屬、克雷伯氏菌屬。1996年，孫雪奇等通過不同的培養(yǎng)基分離出家蠶腸道中的好氧微生物，并檢測出部分兼厭氧微生物，證明它們分別屬于16個屬[6]。1999 年魯興萌等運用 API 20 STREP（V.5.0）系統(tǒng)對正常的家蠶消化道來源的89株腸球菌進行研究，發(fā)現(xiàn) Ent .casselif lavus 和 Ent .faecalis是家蠶消化道內的主要腸球菌菌叢[7]。2006 年袁志輝等采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法研究家蠶腸道的細菌群體結構，顯示家蠶腸道中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillu）、大腸桿菌屬（Escherichia coli）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcu）、假單胞菌屬（Pseudomonas）豐度較高[8]。2007年田貞華等對家蠶 4 齡幼蟲腸道通過16S rDNA-RFLP分析，分離出14個不同類群，發(fā)現(xiàn)它們主要分布在10個細菌屬及其分支中[9]。近期對家蠶腸道菌群基因組分析的報道表明，家蠶腸道菌在屬水平上主要包括腸球菌屬（Enterococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬[10]表明了家蠶腸道菌群的多樣性。

家蠶腸道微生物與其消化吸收和生長狀況息息相關。研究家蠶腸道菌群有利于改善家蠶的健康狀況、減少疾病的發(fā)生從而提高蠶繭的產(chǎn)量和質量。之前的研究是利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法來檢測家蠶腸道菌群結構，不能全面地反映出家蠶腸道細菌的真實狀況，因此本試驗利用16S rRNA基因高通量測序數(shù)據(jù)分析來全面準確地了解家蠶腸道菌群的結構。

新疆地處亞歐大陸腹地，屬于典型的溫帶大陸性氣候，是絲綢之路的重要通道。最早的種桑養(yǎng)蠶起源于和田地區(qū)，和田地區(qū)位于新疆最南端，南枕昆侖山和喀喇昆侖山，北部深入塔克拉瑪干沙漠腹地，處于干旱荒漠氣候區(qū)，風沙天氣頻發(fā)[11-12]，形成具有新疆特色的養(yǎng)蠶方式——水洗桑葉飼喂。本研究利用16S rDNA高通量測序技術，研究不同飼喂處理對其腸道微生物的影響，為研究家蠶對桑葉濕度和沙塵耐受性奠定基礎，闡明腸道微生物與家蠶之間的互作可以為通過改變腸道微生態(tài)改善家蠶生長狀況及提高經(jīng)濟效益提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇優(yōu)一號三眠蠶由新疆維吾爾自治區(qū)和田蠶?？茖W研究所提供;桑樹品種為桂桑12，沙地滴灌栽培，三年生條桑桑葉。

1.1.1 試驗地設置

試驗地位于新疆維吾爾自治區(qū)和田桑蠶科學研究所。新疆最早的種桑養(yǎng)蠶起源于和田，和田位于新疆最南端，地處喀喇昆侖山與塔克拉瑪干大沙漠之間，屬于干旱荒漠性氣候，四季多風沙，形成新疆獨具特色的養(yǎng)蠶方式。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶飼育及取樣

2020年8月，取同一批次的家蠶，桑葉水洗晾干后飼喂4齡起蠶，挑選 1 200 頭長勢均一的家蠶用于試驗。試驗設置3個處理、重復4次。將飼喂水洗高濕桑葉（洗凈桑葉，補水20%，SY1-A）、水洗晾干正常桑葉（飼喂前 2 h 用水洗凈的桑葉，桑葉表面干爽無水珠，SY1-B）和采回含沙桑葉（采摘回來的新鮮桑葉，補水20%，SY1-C），其中SY1-B為對照組。取5齡第3天的家蠶腸道為樣本，每個重復取10頭家蠶，取其腸道，并置于離心管中，放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 提取家蠶腸道微生物DNA

每個離心管內的中腸進行勻漿后，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法取樣提取DNA基因組，以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度，用無菌水稀釋至1 ng/μL備用。

1.2.3 16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測序

以稀釋的DNA為模板進行PCR擴增，選擇通用引物（27F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA;1492R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT），采用北京全式金生物技術有限公司的Pfu高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，采用相同的擴增條件，并設置陰性對照，保證操作過程無污染。以Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Preparation Kit制備測序文庫，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit將構建好的測序文庫在Agilent Bioanalyzer上進行質檢，合格后采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端測序。

1.2.4 生物信息學分析

1.2.4.1 測序數(shù)據(jù)處理

首先使用cutadapt切除序列的引物片段（設置-O為10），棄去未匹配引物的序列用Vsearch的fastq_mergepairs模塊拼接序列;使用fastq_filter模塊對拼接序列進行質控;使用 derep_fulllength模塊去除重復序列;使用cluster_size模塊，在98%相似度水平對去重后的序列聚類，并使用uchime_denovo模塊去除嵌合體;再使用perl腳本（https：//github.com/torognes/vsearch/wiki/VSEARCH-pipeline），過濾質控后序列集中的嵌合體，從而獲得高質量序列;使用cluster_size模塊，在97%相似度水平對高質量序列聚類，并分別輸出代表序列和OTU表，去除OTU表格中的singletons OTUs及其代表序列。

1.2.4.2 數(shù)據(jù)質控與分析

使用QIIME2 （2019.4）、自編perl腳本等繪制物種分類組成圖表;使用QIIME2 （2019.4）、R語言、ggplot2包，計算Chao1、Observed species指數(shù)、Shannon、Simpson指數(shù)、Faiths PD指數(shù)、Pielous evenness 指數(shù)和Goods coverage指數(shù);使用QIIME2 （2019.4）軟件繪制稀釋曲線;R腳本將上表中數(shù)據(jù)繪制Alpha多樣性指數(shù)箱線圖和PCoA點圖。

2 結果與分析

2.1 家蠶腸道微生物16S rDNA序列組裝和拼接

對不同飼育處理組家蠶腸道的有效測序數(shù)據(jù)進行分析。由表1可知，SY1-B2的有效序列數(shù)據(jù)量是最多的，為106 377條，其次為SY1-A3（105 303條）、SY1-A1（104 019條）;總有效序列量為1 133 549條，平均有效序列量為94 462.42條，測序數(shù)目較大，可以充分保證數(shù)據(jù)的準確性。

2.2 家蠶腸道細菌的種類及豐度

本研究分別從界、門、綱、目、科、屬、種 7 種不同分類階元水平分析分類序列的變化情況。在界、門、綱、目、科 5 種分類階元水平上，序列的減少比較緩慢，而在科、屬、種 3 個分類階元水平上序列數(shù)驟減，表明待測樣本菌群中微生物的差異主要集中在科、屬、種的分類水平上?；?OTUs 注釋結果，所測樣本在門水平分布最多的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（ Firmicutes） 、藍細菌門（Gyanobacteria）和變形菌門（ Proteobacteria） 。SY1-A組和SY1-B的優(yōu)勢菌門是變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門，SY1-C組的優(yōu)勢菌門為變形菌門、藍細菌門、厚壁菌門（圖1）。

科水平上SY1-A組的優(yōu)勢菌科為Chloroplast-norank科、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae），SY1-B組的優(yōu)勢菌科為伯克氏菌科、Chloroplast-norank科，SY1-C組的優(yōu)勢菌科為伯克氏菌科、Chloroplast-norank科、腸球菌科（Enterococcaceae）（圖2）。

屬水平上SY1-A組的優(yōu)勢菌屬為Tyzzerella-3屬、Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬（Aquabacterium）等;SY1-B組的優(yōu)勢菌屬菌為水桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）;SY1-C組的優(yōu)勢菌屬為Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬、腸球菌屬（Enterococcus）（圖3）。

根據(jù)OTU數(shù)據(jù)繪制稀疏性曲線（圖4），Spe-caccum 物種累積曲線（圖5）。稀疏性曲線末端趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)有效反映了家蠶腸道微生物菌群的多樣性。物種累積曲線反映了持續(xù)抽樣下新OTU（新物種）出現(xiàn)的速率。在樣本量為1～10組內，曲線急劇上升，表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)，樣本量約為11組左右時，曲線趨于平緩，表示微生物的種類不會隨飼喂的增加而有明顯的增加。

分析各組樣本屬水平的韋恩圖可知，對照組獨有的OUT數(shù)量為1 321種，SYI-C組和SYI-A組獨有的OUT數(shù)量分別為1 355、1 758種，說明各個組在屬水平上的腸道微生物存在一定差異;SYI-C和 SYI-A 組與對照組共有的OUT數(shù)量分別為268、211種，SYI-C和SYI-A共有的OUT數(shù)量為92種，說明SYI-A腸道菌屬的數(shù)量影響較大，但是在屬水平的物種豐富度上SYI-C和SYI-A均高于對照組（圖6）。

2.3 家蠶腸道細菌多樣性分析

分析α多樣性指數(shù)可知，Goods-coverage指數(shù)為0.99，說明對16S rDNA進行測序分析有一定的代表性;從Chao1指數(shù)可以看出SY1-A組和 SY1-B 組的群落豐富度大于SY1-C組;從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可知，SY1-A組和SY1-B組細菌的物種多樣性大于SY1-C組（圖7）。

3 結論與討論

家蠶腸道菌群結構與其生長發(fā)育、生理變化、機體免疫密切相關，同時受品種、性別及發(fā)育時期、生長環(huán)境、飼料的影響。本研究中以正常家蠶為對照，運用高通量測序技術，為全面了解家蠶腸道細菌種群的組成提供了強有力的手段，本研究通過高通量測序16S rRNA 基因序列的方法，從家蠶品種蘇優(yōu)一號的中腸中所檢測到的細菌種類大大多于簡單純培養(yǎng)或變性梯度凝膠電泳（DGGE）檢測到的細菌種類[4-5]，表明家蠶腸道細菌類群非常豐富，通過16S rRNA高通量測序技術可獲得更加全面的家蠶腸道細菌多樣性信息。探究飼喂不同處理桑葉后家蠶蘇優(yōu)一號腸道微生物結構，并分析菌群結構的共性與差異。

蘇優(yōu)一號在門分類水平上的優(yōu)勢菌門為變形菌門，科分類水平上為Chloroplast-norank科、伯克氏菌科，在屬分類水平上優(yōu)勢菌屬為Chloroplast-noranks屬、水桿菌屬、Tyzzerella-3屬等。與正常桑葉飼喂組相比Chloroplast_norank的含量均低于高濕桑葉飼喂組和含沙桑葉飼喂組，而水桿菌屬的含量顯著高于其他2個組;水桿菌屬的含量顯著高于其他2個組;腸球菌屬只存在于 SY1-C 組中，在其他2個組中均未發(fā)現(xiàn);不動桿菌屬只在SY1-B組中被發(fā)現(xiàn)，其他2個組均未發(fā)現(xiàn)該屬細菌。

對柞蠶5齡中腸微生物研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群中包含Tyzzerella-3屬[13]，有研究發(fā)現(xiàn)在人體腸道中存在該屬，與人類抑郁癥有關[14-15]。含沙桑葉飼喂組的優(yōu)勢菌屬腸球菌屬也是一類較為常見的細菌，在家蠶腸道內是主要的消化細菌之一[16-17]，許多昆蟲體內含有大量的腸球菌，腸道細菌影響昆蟲消化液的pH值，并與對家蠶的致病性相關聯(lián)。腸球菌屬是家蠶腸道中的優(yōu)勢菌屬，能產(chǎn)生乙酸鹽，導致消化液的pH值降低[18]，也可以保護寄主免受一些毒素的攻擊[6]，家蠶在受到BmBDV病毒感染時腸道內腸球菌的比例也會逐漸增加[19]。魯興萌等的研究在一定程度佐證了家蠶腸道細菌有抑制致病微生物感染的作用[7]。3種桑葉處理飼喂對家蠶的腸道微生物組成和多樣性有較大影響，桑葉表面沙塵可改變家蠶腸道微生物的結構，高濕度可能在一定程度上造成家蠶腸道微生物結構改變，濕度對家蠶的取食量也影響較大，桑葉不進行處理直接飼喂家蠶取食量明顯降低。

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