劉淑娟，張翠萍，李淑英，李學(xué)孺，李元，周元清*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；3.玉溪師范學(xué)院教師教育學(xué)院，云南 玉溪 653100）

鄰苯二甲酸酯類化合物（PAEs）種類較多，主要作為增塑劑應(yīng)用于塑料制品的制造和加工。其可通過食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致人類生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)功能失調(diào)。PAEs是典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其中鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是檢出最多且最難降解的PAEs污染物，土壤中的DEHP會(huì)影響微生物群落結(jié)構(gòu)和酶活性，對蚯蚓造成氧化應(yīng)激和DNA損傷，抑制植物根和莖的伸長（特別是在較高濃度下）。此外，DEHP也嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，PAEs修復(fù)技術(shù)研究備受關(guān)注，陸續(xù)報(bào)道了物理吸附、化學(xué)混凝/絮凝、高級氧化和細(xì)菌生物降解等。其中，細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的PAEs降解極具優(yōu)勢：污染物降解更完全、處理成本更低、安全性更高、環(huán)境擾動(dòng)更小。因此，有關(guān)PAEs降解菌的分離、降解特性、分子機(jī)制和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物修復(fù)應(yīng)用等研究廣泛。

草本植物構(gòu)建的人工濕地是集植物-微生物-基質(zhì)為一體的生態(tài)工程措施，在凈化有機(jī)污染物方面效果顯著。已有研究表明，自然環(huán)境中PAEs的代謝主要依靠各種土著細(xì)菌的共同作用。目前已經(jīng)從海洋塑料碎屑污泥、農(nóng)業(yè)土壤、塑料污染的土壤、垃圾填埋場污泥、活性污泥等環(huán)境中分離獲得了大量DEHP降解菌，但從濕地草本植物根際土壤中分離DEHP降解菌的研究尚鮮見。在前期調(diào)查基礎(chǔ)上，本研究以DEHP作為目標(biāo)污染物，從PAEs污染的濕地（PAEs含量約為18.87～37.36 mg·kg）草本植物根際土壤中篩選DEHP高效降解菌株，并通過生理生化特征、16SrDNA序列分析對菌株進(jìn)行鑒定，分析不同環(huán)境因素對菌株生長及降解特性的影響，以期為人工濕地草本植物配置和調(diào)控PAEs降解效能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品：在玉溪市撫仙湖、星云湖流域，選取PAEs污染的人工濕地，采集草本植物根際土壤。撥開表層土壤，去除植物殘枝、碎礫石等，用不銹鋼土鉆采集植物根際土壤（5～10 cm表層）100 g，土樣避光儲(chǔ)存于預(yù)先洗凈烘干的棕色玻璃瓶（250 mL）中，并于4℃冷藏運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。土壤樣品按照HJ/T 166—2004的相關(guān)要求采集和保存。

參照文獻(xiàn)[22]配制富集培養(yǎng)基（BM）、無機(jī)鹽離子培養(yǎng)基（MSM）、LB培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均用去離子水配制，用0.1 mol·LHCl和0.1 mol·LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0 g·L。所有培養(yǎng)基按需（取100 mL裝至250 mL錐形瓶）分裝后，于121℃滅菌30 min，冷卻備用。

選擇培養(yǎng)基的制備：取DEHP試劑（分析純）10 mL（=1 g·mL）置于棕色容量瓶，用正己烷（分析純）定容至100 mL，移取0.1 mL DEHP正己烷溶液至100 mL滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于通風(fēng)櫥內(nèi)，待正己烷完全揮發(fā)，即獲得100 mg·L的DEHP溶液選擇培養(yǎng)基。

菌懸液的制備：挑取新鮮單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中30℃、120 r·min恒溫培養(yǎng)至OD≥0.8（以不接菌的LB液體培養(yǎng)基作空白對照），取菌液2 mL至已滅菌的離心管（規(guī)格2 mL），室溫條件下于12 000 r·min離心分離5 min。棄上清液后，加入滅菌的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol·L，pH 7.2），重懸后再次離心，重復(fù)3次后，用緩沖液定容至2 mL。

1.2 主要供試儀器與試劑

儀器：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀賽默飛世爾TEACE 1300-ISQLT；UV-5100紫外可見分光光度計(jì)、ZD-85雙功能氣浴恒溫振蕩器；H2100R離心機(jī)（湖南長沙湘儀）；ZHWY-2112恒溫振蕩培養(yǎng)箱、RE-52AA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

DEHP試劑：=1 g·mL，每瓶500 mL，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DEHP標(biāo)準(zhǔn)品：=1 000 mg·L，規(guī)格為每支1 mL；內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液[氘代鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯]：=1 000 mg·L，溶劑為乙酸乙酯，購于o2si公司（USA）。苯甲酸芐酯：色譜級，儲(chǔ)備液，=5 000μg·mL，購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，移取200μL儲(chǔ)備液于10 mL棕色容量瓶，用乙酸乙酯定容制備得到中間液（=100μg·mL）；移取2 mL中間液于10 mL棕色容量瓶，用乙酸乙酯定容制備得使用液（=20μg·mL）。正己烷（農(nóng)殘級）、乙酸乙酯（色譜純）購于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，無水硫酸鈉（分析純），550℃烘烤5 h，購于國藥集團(tuán)；質(zhì)譜調(diào)諧溶液：十氟三苯基膦（DFTPP），=5 mg·L。玻璃材質(zhì)弗羅里硅藻土小柱：填料500 mg，柱規(guī)格3 mL。高純氮?dú)猓杭兌取?9.999%。高純氦氣：純度≥99.999%。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol·L，pH7.2，規(guī)格500 mL）購自譜析-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DEHP降解菌的富集、馴化、分離與篩選

參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行DEHP降解菌的富集、馴化、分離與篩選。

DEHP降解菌的富集與馴化：稱取10 g土樣，加到100 mL（含DEHP 100 mg·L）BM培養(yǎng)基中，置于搖床振蕩培養(yǎng)7d（30℃、120 r·min），第7 d時(shí)取2 mL富集培養(yǎng)上清液接種于100 mL新鮮BM培養(yǎng)基（含DEHP 100 mg·L）中，采用梯度壓力馴化法，每7 d進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接時(shí)底物DEHP添加量逐次提高，即100、200、300、400、500、600 mg·L。取終期BM培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)液2 mL，離心收集菌體（12 000 r·min、5 min），用PBS緩沖液（pH 7.2）重復(fù)沖洗3次，將菌體重懸于PBS緩沖液（約2 mL）并接種至含100 mg·LDEHP的MSM培養(yǎng)基中，避光條件下進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)（30℃、120 r·min）7 d。采用梯度壓力馴化法，每7 d進(jìn)行一次轉(zhuǎn)接，按2%（體積比）接菌量逐次轉(zhuǎn)接至含有DEHP濃度分別為200、400、600、800、1 000 mg·L的100 mL MSM液體培養(yǎng)基中，避光恒溫振蕩培養(yǎng)（30℃、120 r·min）。

降解菌的分離與篩選：取MSM培養(yǎng)基中每個(gè)馴化周期的培養(yǎng)液0.1 mL，涂布至MSM培養(yǎng)基固體平板上，于恒溫（30℃）培養(yǎng)箱中避光倒置培養(yǎng)72 h，觀察平板中菌落生長狀況，篩選長勢好的單菌落，反復(fù)劃線至平板直至純化。挑取純化的單菌落接種至100 mL滅菌的LB液體培養(yǎng)基，以不接菌的LB液體培養(yǎng)基作對照，待菌體濃度達(dá)到OD=0.8后取2 mL菌懸液（重懸于PBS緩沖液），接種至100 mL含100 mg·LDEHP的MSM液體培養(yǎng)基中，以相同條件但不接菌作為對照，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d（30℃、120 r·min）后測定底物殘留量，篩選出降解菌。上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

降解菌降解能力驗(yàn)證：將篩選的降解菌接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)繁菌體后，取2 mL菌液用PBS緩沖液重懸菌體3次后，接入100 mL含100 mg·LDEHP的MSM液體培養(yǎng)基中，以不接菌的MSM液體培養(yǎng)基作為對照，所有處理組與對照均設(shè)3次重復(fù)，每12 h測定一次底物濃度及菌株生長情況（OD）。將具有降解能力的菌株進(jìn)行保存，選取降解效率最高、降解能力穩(wěn)定且生長狀況良好的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.2 菌株的鑒定

利用微生物生化鑒定試劑對菌株進(jìn)行生理生化特性的測定，委托上海派森諾基因科技有限公司測定菌株的16SrDNA序列，綜合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及16SrDNA序列分析結(jié)果，對菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3 環(huán)境條件對菌株降解DEHP的影響

1.3.3.1 pH

將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L的DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，用0.1 mol·LHCl和0.1 mol·LNaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH分別為5、6、7、8、9。在接菌量2%（體積比）、溫度35℃、轉(zhuǎn)速120 r·min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，測定DEHP含量和OD值。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，下同。

1.3.3.2 溫度

將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L的DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度分別為15、20、25、30、35℃。在接種量2%（體積比）、pH 7.0、轉(zhuǎn)速120 r·min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，測定DEHP含量和OD值。

1.3.3.3 接菌量

將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L的DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，接菌量分別設(shè)為1%、2%、3%、4%、5%（體積比）。在pH 7.0、溫度30℃、轉(zhuǎn)速120 r·min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，測定DEHP含量和OD值。

1.3.3.4 DEHP初始濃度

將菌懸液接種到初始濃度分別為50、100、200、500、1 000、2 000 mg·L的DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在pH 7.0、接菌量2%（體積比），溫度30℃、轉(zhuǎn)速120 r·min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，測定DEHP含量和OD值。

1.3.3.5 最佳條件下菌株對DEHP的降解性能

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳降解條件，將菌懸液接種到初始濃度為100 mg·L的DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d，分別在第0、2、3、4、5、7 d測定DEHP含量。

1.3.4 樣品制備

樣品提取參照楊婷和梁浩花等的方法。用移液管移取DEHP無機(jī)鹽培養(yǎng)基10 mL至100 mL棕色容量瓶，加入1 mL 100 mg·L苯甲酸芐酯（參照HJ 1184—2021，作為替代物），用二次蒸餾水稀釋定容并搖勻后轉(zhuǎn)移至磨口帶玻璃塞的250 mL錐形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯萃取，放入恒溫振蕩器中振蕩30 min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中振搖5 min，靜置，待樣品出現(xiàn)明顯分層后，進(jìn)行分液，棄下層水相，收集萃取液，再用30 mL乙酸乙酯沖洗3次，將沖洗液全部轉(zhuǎn)移到平底燒瓶中。取出弗羅里硅土凈化柱（粒徑250μm），先用10 mL乙酸乙酯預(yù)洗柱子，淋洗液廢棄，將平底燒瓶中收集的液體緩慢滴入凈化柱（60滴·min），再用50 mL乙酸乙酯洗脫小柱，收集全部洗脫液至雞心瓶中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約5 mL，過有機(jī)系0.22μm濾膜，收集過濾液并蒸發(fā)濃縮至約0.5 mL，用乙酸乙酯定容至1 mL，待GC-MS測定。

1.3.5 氣相色譜-質(zhì)譜條件

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度320℃，脈沖不分流進(jìn)樣；載氣為高純氦氣；柱流速1 mL·min（橫流模式），進(jìn)樣量為1.0μL；色譜柱為SH-Rxi-5Sil MS（30 m×0.25μm×0.25 mm）。程序升溫條件：70℃保持2 min，以20℃·min升到190℃保持1 min，再以8℃·min升到280℃保持3.5 min，以20℃·min升到300℃保持10 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊源（EI）；離子源溫度300℃；傳輸線溫度300℃；掃描模式為選擇離子掃描。內(nèi)標(biāo)法定量：萃取濃縮后，與標(biāo)曲統(tǒng)一加入相等含量的內(nèi)標(biāo)溶液上機(jī)測試，添加內(nèi)標(biāo)使用液[氘代鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯，=20.0 mg·L]，使其質(zhì)量濃度均為200μg·L。每批次樣品（＜20）分析一個(gè)樣品加標(biāo)，加標(biāo)回收率在60%～130%，方法檢出限為0.1μg·L。

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：將DEHP、替代物及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液分別用乙酸乙酯稀釋配制成濃度為5 mg·L的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，于安培瓶中低于-18℃的環(huán)境下避光保存。用乙酸乙酯作溶劑，配制成8個(gè)不同濃度（10、20、50、100、200、500、1 000、2 000μg·L）的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。測試前各濃度點(diǎn)均加入濃度為5 mg·L的內(nèi)標(biāo)使用溶液于標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中，混勻，使標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中內(nèi)標(biāo)濃度均為200μg·L。分別將標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按低濃度到高濃度依次置于GC-MS儀器樣品托盤內(nèi)，將GC-MS儀器調(diào)至最佳狀態(tài)，1.0μL進(jìn)樣測定。

以目標(biāo)化合物濃度和內(nèi)標(biāo)化合物濃度比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物定量離子響應(yīng)值和內(nèi)標(biāo)化合物定量離子響應(yīng)值的比值與內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度的乘積為縱坐標(biāo)，繪制校準(zhǔn)曲線。

定量分析：依托氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀賽默飛世爾TEACE 1300-ISQ LT定量分析軟件進(jìn)行自動(dòng)定量。替代物回收率為85%～110%。當(dāng)樣品中目標(biāo)化合物的定量離子有干擾時(shí)，允許使用輔助離子定量。樣品中目標(biāo)化合物的濃度按公式（1）計(jì)算：

式中：為樣品中DEHP的質(zhì)量濃度，μg·L；為根據(jù)內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中DEHP的濃度，μg·L；為測試樣品進(jìn)樣體積，本實(shí)驗(yàn)為1 mL；為樣品體積，100 mL；為樣品稀釋倍數(shù)，二次蒸餾水稀釋10倍。

1.3.6 降解率的計(jì)算

DEHP降解率計(jì)算公式為：

降解率=（-C）/×100%

式中：為DEHP初始檢測平均值濃度，μg·L；C為在第d時(shí)DEHP的檢測濃度，μg·L。

1.3.7 OD的測定

降解菌擴(kuò)繁O(jiān)D的測定：將獲得的純菌落接種至滅菌的LB液體培養(yǎng)基，以不接菌的LB液體培養(yǎng)基為對照，采用UV-5100紫外可見分光光度計(jì)，測量培養(yǎng)液在600 nm時(shí)的光密度值OD。

降解菌降解能力及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)OD的測定參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。采用UV-5100紫外可見分光光度計(jì)，測量培養(yǎng)液在600 nm時(shí)的光密度值OD，將菌懸液接入滅菌的MSM液體培養(yǎng)基，并以不接菌（含相同體積的緩沖液）的MSM液體培養(yǎng)基為對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

利用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）Durcan檢驗(yàn)，以確定不同處理組之間的差異，＜0.05表示處理間差異顯著。利用軟件Origin 9.0制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的分離與篩選

經(jīng)過富集、馴化、分離和純培養(yǎng)，獲得2株具有較好降解效果的DEHP降解菌，編號(hào)分別為C443和B6。菌株C443分離自窯泥溝濕地植物茨菰（L.）的根際土壤，B6分離自路居河濕地植物旱傘草（L.）的根際土壤。通過測定菌株的降解能力，結(jié)果顯示C443菌株7 d的降解率均值為90.15%，第7 d對菌體進(jìn)行再次平板涂布時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株未生長；B6可以在7 d降解97%以上的DEHP，并且菌體長勢較好。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選取B6為研究對象，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。典型濕地草本植物根際土壤樣品分離得到的DEHP降解菌及其降解率詳見表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制Table 1 Preparation of standard curve

表2 篩選出的DEHP降解菌的降解率Table 2 Isolation of DEHPdegrading strain and degradation rates

目前，從不同環(huán)境介質(zhì)中分離篩選到PAEs污染物的降解菌的報(bào)道較多，如南湖沉積物和水體中分離出假單胞菌strain CCNU-SK1、strain CCNU-SK2和strain CCNU-SK3可降解鄰苯二甲酸二乙酯（DEP），活性污泥中分離出的無色桿菌屬spRX可降解DEHP，農(nóng)業(yè)土壤中分離出的假節(jié)桿菌E5可降解鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）、DEHP、DEP等PAEs，白酒發(fā)酵劑中分離出的枯草芽孢桿菌BJQ0005可降解鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）、DBP、DEHP等，但從濕地草本植物根際土分離PAEs降解菌的研究甚少。從草本植物根際土壤篩選出DEHP的高效降解菌，可為人工濕地植物配置應(yīng)用于PAEs污染生態(tài)修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。同時(shí)，環(huán)境中經(jīng)常是多種PAEs污染物共存，因此今后可從草本植物根際土壤篩選更多的PAEs高效降解菌，為人工濕地在凈化有機(jī)污染物的應(yīng)用中提供更多科學(xué)依據(jù)。

2.2 菌株B6的16SrDNA鑒定與形態(tài)學(xué)特征

將獲得的16SrDNA基因片段（序列長度約為1 500 bp）測定結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比較，結(jié)果表明B6菌株與簡單芽孢桿菌有100%的相似性。芽孢桿菌隸屬于厚壁菌門（Fircutme）芽孢桿菌綱（Bacilli）芽孢桿菌目（Bacillales），是一類好氧或兼性厭氧的桿狀、產(chǎn)芽孢的重要微生物資源，是中國區(qū)域的芽孢桿菌優(yōu)勢種。研究已證實(shí)，來源于芽孢桿菌的酯酶可降解PAEs類污染物，莫哈韋芽孢桿菌B1811可降解DEHP。因此簡單芽孢桿菌具有降解DEHP的潛力，進(jìn)一步研究其降解性能，可為DEHP污染修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

菌株B6在平板上的菌落形態(tài)（圖1）為圓形、白色不透明、菌落光滑平整、邊緣整齊中間微微隆起、較濕潤。通過涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥，最后將制備好的樣片置于顯微鏡下觀察，細(xì)菌的形態(tài)為長桿狀、兩端齊平、無鞭毛。生理生化試驗(yàn)顯示菌株B6為革蘭氏陽性菌（圖2）、有芽孢、硝酸鹽還原陽性、葡萄糖發(fā)酵變黃產(chǎn)酸無氣泡產(chǎn)生。

圖1 B6菌株平板形態(tài)Figure 1 Plate morphology of strain B6

圖2 顯微鏡下B6革蘭氏染色和芽孢染色圖Figure 2 Gramstaining and spore staining of B6 under microscope

2.3 環(huán)境條件對菌株降解DEHP的影響

2.3.1 pH對菌株B6降解DEHP的影響

WU等篩選的sp.JDC-41對DnBP降解的研究表明，pH小于5或高于9時(shí)降解率驟降至2%，所以本研究考察了pH值在5～9之間時(shí)菌株降解DEHP的情況（圖3a）。

pH對DEHP穩(wěn)定性的影響：在不同初始pH培養(yǎng)基中，未接菌條件下DEHP相對較穩(wěn)定，所有檢測組DEHP降解率不足0.1%。

pH對降解菌生長的影響：圖3可看出，在pH為5～9時(shí)，菌株B6生長量先隨pH值升高而升高，并且在pH為7時(shí)達(dá)到最大值，隨后逐漸降低。說明菌株在中性或弱堿性環(huán)境下生長較好，pH過高或過低都不利于菌株的生長。

pH對降解菌降解效能的影響：圖3結(jié)果還表明，pH在6～8時(shí)，DEHP降解率無顯著差異，而當(dāng)pH＜6或pH＞8時(shí)，降解率都顯著降低。

降解菌生長與其降解效能的關(guān)系：從圖3可看出，在pH為7時(shí)，菌株B6的生長量和降解率均達(dá)到最大值，pH 7～8時(shí)，降解率和菌株生長較好，說明中偏堿性環(huán)境可以促進(jìn)菌株B6對DEHP的水解反應(yīng)，從而使生物量升高，且中性條件利于菌株對DEHP的降解。這與大部分研究報(bào)道的PAEs降解菌株的情況一致，如WANG等分離的DEHP降解菌株sp.RX在pH為7、溫度為30℃時(shí)降解率最高，梁浩花等分離的DEHP降解菌株MB1（sp.）、潘琪等篩選的DEHP降解菌株RXX-2（）和RXX-3（）均在中性偏堿性條件下對DEHP的降解效果顯著。

圖3 pH對菌株B6降解DEHP的影響Figure 3 Effects of pH on DEHPdegradation by strain B6

2.3.2 溫度對菌株B6降解DEHP的影響

溫度會(huì)影響酶的活性，從而影響菌株的生長和對有機(jī)物的降解能力。本實(shí)驗(yàn)研究了15～35℃下，菌株對DEHP的降解情況（圖4），結(jié)果表明隨溫度的升高，菌株B6的菌體密度和DEHP降解率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最適生長溫度為30℃，此溫度下B6菌株對DEHP的降解率達(dá)到最大，之后逐漸下降。該趨勢與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致。

溫度對DEHP穩(wěn)定性的影響：所有實(shí)驗(yàn)對照組在15～35℃溫度范圍內(nèi)，DEHP起始濃度和終濃度無明顯變化，較穩(wěn)定，降解率均小于0.5%。

溫度對降解菌生長的影響：由圖4可看出，在溫度為15～35℃時(shí)，菌株B6的菌體密度呈先上升后下降的趨勢，最適生長溫度為30℃。

溫度對降解菌降解效能的影響：由圖4可知，菌株B6對DEHP的降解率先隨溫度的升高而上升，且在30℃時(shí)達(dá)到最大值97.34%，隨后逐漸降低。

圖4 溫度對菌株B6降解DEHP的影響Figure 4 Effects of temperature on DEHPdegradation by strain B6

降解菌生長與其降解效能的關(guān)系：在15～35℃下，菌株的菌體密度與降解效能呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)性，且在30℃時(shí)B6菌株的生長量和對DEHP的降解率均達(dá)到最大值。

2.3.3 DEHP初始濃度對菌株B6降解DEHP的影響

DEHP初始濃度對B6降解DEHP的影響：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），DEHP初始濃度為50～2 000 mg·L時(shí)，隨初始濃度增大，菌株B6對DEHP的降解率呈逐漸下降趨勢，DEHP初始濃度＜500 mg·L時(shí)，降解率＞68%，DEHP初始濃度為1 000 mg·L時(shí)，降解率降至58.10%，隨后趨于平穩(wěn)。

圖5 初始濃度對菌株B6降解DEHP的影響Figure 5 Effects of initial concentration on DEHPdegradation by strain B6

DEHP初始濃度對B6生長的影響：圖5結(jié)果還表明，DEHP初始濃度為50～2 000 mg·L時(shí)，菌株B6生長量先隨DEHP初始濃度升高而升高，并且在DEHP初始濃度為1 000 mg·L時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸降低。說明DEHP初始濃度為低濃度時(shí)可以促進(jìn)菌株生長，而較高濃度則對菌株生長有抑制作用。

降解菌生長與其降解效能的關(guān)系：圖5結(jié)果表明，低濃度DEHP促進(jìn)B6生長，對DEHP的降解率高；高濃度DEHP可能抑制B6的生長，降解率也相對較低。B6對高濃度DEHP降解率低，這可能是因?yàn)樵谳^高濃度DEHP下，底物過剩，菌株B6難以在短期內(nèi)大量降解DEHP。許多學(xué)者也研究了降解菌在不同DEHP初始濃度下的降解效能：WANG等研究了100～2 000 mg·LDEHP對sp.Lff降解效能的影響，楊婧等研究了300～1000 mg·LDEHP對分枝桿菌sp.ASW6D降解效能的影響。本實(shí)驗(yàn)B6菌株降解DEHP的濃度范圍較前人的更寬，且效率更高。

2.3.4 接菌量對菌株B6降解DEHP的影響

從圖6可看出，接菌量對菌株B6降解DEHP的影響呈先上升后下降的趨勢，在接菌量為4%時(shí)，DEHP的降解率達(dá)到最大，之后下降，但差異不顯著。

接菌量對B6降解DEHP的影響：圖6顯示，在接菌量為1%～5%時(shí)，DEHP的降解率隨接菌量的增加顯著提高，在接菌量為4%時(shí)，降解率達(dá)到最大值97.91%，隨后逐漸降低。

圖6 接菌量對菌株B6降解DEHP的影響Figure 6 Effects of inoculation amount on DEHPdegradation by strain B6

接菌量對降解菌生長的影響：由圖6可看出，在接菌量為1%～5%時(shí)，隨著接菌量的增加，菌株B6的生物量也在增加，當(dāng)接菌量為4%時(shí)，菌體密度OD達(dá)到最大值，而接菌量為5%時(shí)，OD無顯著變化。

降解菌生長與其降解效能的關(guān)系：當(dāng)接菌量在1%～4%范圍內(nèi)，菌株密度與污染物降解呈一定正相關(guān)關(guān)系。隨著接菌量的不斷提高，當(dāng)接菌量超過4%后，接種量對B6生物量無顯著影響，但高濃度菌液使菌體間相互競爭空間和碳源能源，導(dǎo)致菌株降解活性降低，DEHP的降解率也隨著降低。

2.3.5 最適環(huán)境條件下菌株B6對DEHP的降解

對單因素實(shí)驗(yàn)得到的最適環(huán)境條件（pH 7.0、溫度30℃、接菌量4%、DEHP初始濃度100 mg·L）進(jìn)行試驗(yàn)研究，結(jié)果詳見圖7。降解空白對照實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)培養(yǎng)液中不添加降解菌時(shí)DEHP在自然狀態(tài)下幾乎不被降解，而培養(yǎng)液中添加降解菌時(shí)，菌株B6在生長過程中沒有明顯的停滯期：1～4 d為對數(shù)生長期，OD值快速上升到最大值；4～7 d時(shí)菌株處于穩(wěn)定期，OD值緩慢下降但差異不顯著。菌株B6對DEHP的降解隨時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢，第7 d時(shí)無機(jī)鹽培養(yǎng)液中DEHP的殘留濃度為2.09 mg·L，降解率達(dá)到97.91%，相比同類研究該菌具有較強(qiáng)的DEHP降解力。CHEN等從農(nóng)田土壤分離的DEHP降解菌E5的降解率為65.3%，WANG等從活性污泥中分離的DEHP降解菌RX的降解率為93.1%，F(xiàn)ENG等從污染水體中分離的DEHP（初始濃度500 mg·L）降解菌spstrain DNB-S3的降解率為59.2%，ZHANG等從紅土中分離的DEHP降解菌RL-JC02的降解率為91.8%。近年來分離的DEHP降解菌相關(guān)信息詳見表3。

表3 近年來分離的典型DEHP降解菌及其相關(guān)信息Table 3 Overview of typical DEHPdegradation strains isolates in recent years

圖7 最佳條件下菌株B6對DEHP的降解Figure 7 DEHPdegradation rates of strain B6 under the optimal conditions

3 結(jié)論

（1）從濕地典型草本植物根際土壤中篩選得到一株DEHP降解菌B6，菌株B6分離于路居河濕地旱傘草（L.）的根際土壤，經(jīng)過生理生化特征分析、形態(tài)學(xué)鑒定和16SrDNA序列鑒定，該菌株與簡單芽孢桿菌有100%的相似性。

（2）菌株B6最適降解條件：pH 7.0、溫度30℃、接菌量4%、DEHP初始濃度100 mg·L。在最適條件下，菌株B6的生長曲線隨時(shí)間變化呈先上升后下降的趨勢，對DEHP的降解隨時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢，第7 d時(shí)無機(jī)鹽培養(yǎng)液中DEHP的殘留濃度為2.09 mg·L，降解率為97.91%，該菌株對DEHP污染修復(fù)效果顯著，在DEHP污染修復(fù)中具有一定的應(yīng)用前景。