譚慧林, 吳忠紅, 金永生, 牛貴洋, 包東東, 陳海元, 張志東

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091; 2. 新疆阿克蘇食品安全檢測中心，新疆阿克蘇 843000； 3. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091；4. 阿克蘇地區(qū)檢驗(yàn)檢測中心，新疆阿克蘇 843000)

0 引 言

【研究意義】金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界空氣、水、土壤等環(huán)境中，其繁殖過程中會產(chǎn)生多種毒素和侵襲性酶。近年來，由金黃色葡萄球菌引起的感染已占世界第二位[1-5]。強(qiáng)化食品中的金黃色葡萄球菌檢測和相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控，對于消除重大食品安全隱患有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法有傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)法[6]、免疫法[7-8]和核酸檢測法[9-10]、生物傳感器檢測法[11]等。【本研究切入點(diǎn)】依照國標(biāo)GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，傳統(tǒng)培養(yǎng)法是檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢測食品中金黃色葡萄球菌普遍采用的方法，其檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但檢測周期長、過程繁瑣。選用簡單、快速、有效、準(zhǔn)確的金黃色葡萄球菌的檢測方法，對提高食品安全檢驗(yàn)和尤為重要。目前，采用凝膠培養(yǎng)法的金黃色葡萄球菌的快速檢驗(yàn)已經(jīng)建立，部分成熟可靠的技術(shù)已經(jīng)商品化[12-15]，該方法簡單、快速，但此類試劑盒在食品檢測中適用性和準(zhǔn)確度尚無相關(guān)評估?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用國標(biāo)方法GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和國家食品藥品監(jiān)督管理總局《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》[16]，測定選用的2種食品中金黃色葡萄球菌污染程度，并對其快檢試劑盒的靈敏度、特異性、假陽性率和假陰性率進(jìn)行分析，評估該快檢試劑盒，為金黃色葡萄球菌的快篩檢驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用蘋果脆片、真空包裝玉米，購自烏魯木齊市新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院周邊。

金黃色葡萄球菌測菌株(Staphylococcusaureus，ATCC25923)、表皮葡萄球菌菌株(Staphylococcusepidermidis， ATCC25285)、7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker 培養(yǎng)基、血平板、BHI 肉湯、營養(yǎng)瓊脂、兔血漿凍干粉，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；金黃色葡萄球菌快檢試劑盒，廣東達(dá)元綠洲食品安全科技股份有限公司。

滅菌鍋MJ78A，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；生化培養(yǎng)箱IPP260，美墨爾特(上海)貿(mào)易有限公司；生物安全柜HR50-IIA2，青島海爾特種電器有限公司；均質(zhì)器，生物梅里埃公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

無菌條件下，稱取25 g樣品置于盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液；吸取1∶10的樣品勻液1 mL，加至盛有9 mL的生理鹽水的無菌試管中，反復(fù)吹打混勻，制成1∶100的樣品勻液。

1.2.2 國際方法計(jì)數(shù)測定

按照國標(biāo)GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》中的檢驗(yàn)流程，分別吸取1 mL樣品勻液以0.3、0.3和0.4 mL接種量分別加入3塊Baird-Parker平板，涂布后，可將平板正放在培養(yǎng)箱36℃±1℃培養(yǎng)1 h，樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平板，倒置后于36℃±1℃培養(yǎng)24～48 h。選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀釋度2個(gè)平板上所有菌落數(shù)合計(jì)在20～200 CFU的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。

1.2.3 快檢方法計(jì)數(shù)測定

依照快檢試劑盒說明書，用無菌吸管吸取1 mL樣品勻液，緩慢均勻地滴加到快檢紙片上，然后再將其上層膜緩慢蓋下，每個(gè)濃度重復(fù)10次。將測試片疊在一起放入自封袋中并封口，37℃，培養(yǎng)24 h后，計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，其中紫紅色為金黃葡萄球菌，藍(lán)色為其它菌群。

1.2.4 典型菌落的確認(rèn)

從典型菌落中至少選5個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定。分別做染色鏡檢，血漿凝固酶試驗(yàn)。劃線接種到血平板36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)，并以表皮葡萄球菌作為對照。

1.2.5 快檢方法評估

將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種到營養(yǎng)肉湯中，36℃培養(yǎng) 24 h，按照 1∶10 的比例進(jìn)行梯度稀釋，獲得101～104CFU/mL菌懸液，分別添加至樣品勻液中，采用參比方法和快檢方法進(jìn)行菌落數(shù)計(jì)數(shù)，依據(jù)《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》的要求評價(jià)試劑盒的顯著性差異、靈敏度、特異性、假陰性率、假陽性率、相對準(zhǔn)確度。表1

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)計(jì)算采用Mcirosoft Excel 2010進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中金黃色葡萄球菌的國際法檢測

研究表明，所檢測的蘋果脆片中金黃色葡萄球菌含量為15～20 CFU/g，真空包裝的水果玉米中為30～50 CFU/g，小于國家標(biāo)準(zhǔn)GB 29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》要求規(guī)定即食果蔬制品金黃色葡萄球菌限量，檢驗(yàn)的蘋果脆片和水果玉米金黃色葡萄球菌均符合國標(biāo)GB 29921-2013標(biāo)準(zhǔn)限量要求。表2

2.2 樣品中金黃色葡萄球菌的快檢方法檢測

研究表明，蘋果脆片中金黃色葡萄球菌含量為20～30 CFU/g，真空包裝的水果玉米中為30～40 CFU/g。表3

2.3 不同人工污染水平金黃色葡萄球菌回收率

研究表明，回收率分別可達(dá)到93.3%和102.5%，回收率均高于90%，符合檢測分析要求。表4

2.4 靈敏性實(shí)驗(yàn)、假陽性實(shí)驗(yàn)、假陰性實(shí)驗(yàn)

研究表明，因在同一批次產(chǎn)品中，檢驗(yàn)的樣品數(shù)為5個(gè)樣品，最大可允許超出m值的樣品數(shù)為1，其中可接受水平的限量值m值為100 CFU/g，最高安全限量值M為1 000 CFU/g。當(dāng)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)<100 CFU/g時(shí)為陰性樣品。表5

靈敏度為93%，特異性為100%、假陰性率6.6%，假陽性率為0，顯著性差異為0.5，相對準(zhǔn)確度為96.7%。表6

表1 快速檢測方法性能指標(biāo)計(jì)算方法Table 1 The calculation of properties indexes of the rapid detection method

表2 國際法檢測樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)量Table 2 Amount of S.aureus in the samplesby the standard method

表3 快檢方法檢測樣品中金黃色葡萄球菌的數(shù)量Table 3 Amount of S.aureus in the samples by the rapid kit

表4 不同人工污染水平的金黃色葡萄球菌回收率Table 4 Average recovery in different spiked levels for S.aureus by the standard method

表5 快檢法與國標(biāo)法檢測結(jié)果對比Table 5 Comparison of results detectedby the standard method and the rapid kit

表6 金黃葡萄球菌快檢試劑盒的評估Table 6 Estimation and analysis the fast kit for S.aureusdetermination

3 討 論

根據(jù)國內(nèi)食品安全標(biāo)準(zhǔn)及食品安全監(jiān)督抽檢細(xì)則要求，其檢測依據(jù)為GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》。在GB 4789.10-2016中規(guī)定的3種檢驗(yàn)方法中，最終都要求快速準(zhǔn)確的從選擇性平板Baird-Parker中挑取菌落，經(jīng)純化后進(jìn)行血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。此方法要求檢驗(yàn)員具有較強(qiáng)的專業(yè)知識和長時(shí)間的實(shí)驗(yàn)室操作經(jīng)驗(yàn)，方能準(zhǔn)確的找到目標(biāo)菌，從而進(jìn)行生化分析，否則，容易造成檢驗(yàn)結(jié)果的誤判和定量檢驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確。在進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，采用分子生物學(xué)檢驗(yàn)食品中金黃色葡萄球菌的方法，主要參照為SN/T 4525.2-2016《出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第2部分：金黃色葡萄球菌》、SN/T 2754.1-2011 《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法第1部分：金黃色葡萄球菌》、 SN/T 4453-2016《出口食品中金黃色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型方法》，這些檢驗(yàn)方法檢出較快，但更需要專業(yè)的檢驗(yàn)人員熟練操作復(fù)雜的儀器設(shè)備，且所用的儀器設(shè)備和專業(yè)試劑也很昂貴，不適合在基層實(shí)驗(yàn)室開展快速篩查工作。此次試驗(yàn)采用的金黃色葡萄球菌快檢紙片，因加入了可與金黃色葡萄球菌顯色的特異底物，使其培養(yǎng)后菌落呈現(xiàn)獨(dú)特紫紅色，可更加快捷的判斷金黃色葡萄球菌，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，且操作簡便，不依賴復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的檢驗(yàn)人員，具有快速、低成本的特點(diǎn)，適于對金黃色葡萄球菌的快速篩查，適合基層開展食品安全抽檢的快速篩查，尤其是在食物中毒、應(yīng)急處置等病原微生物鑒定方面快檢具有良好的應(yīng)用前景[18,19]。

根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3266-2012《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》[20]，定性方法應(yīng)達(dá)到如下性能指標(biāo)：靈敏度≥98%，特異性≥90.4%，假陰性率<2%，假陽性率<9.6%, 相對準(zhǔn)確度≥94%。同時(shí)，根據(jù)《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，顯著性差異表示待確認(rèn)方法與參比方法的一致性比較，當(dāng)顯著性差異X2<3.84，表示待確認(rèn)方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異。此次實(shí)驗(yàn)靈敏度為93%，特異性為100%、假陰性率6.6%，假陽性率為0，顯著性差異為0.5，相對準(zhǔn)確度96.7%，其快檢方法與參比方法的顯著性差異為0.5，表示快檢方法與參比方法在95%的置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異?？鞕z方法雖然靈敏度、假陰性率指標(biāo)未達(dá)到《食品微生物檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》指標(biāo)要求，但檢測時(shí)間為36～48 h，比國標(biāo)方法72 h提前了24 h以上，可在日常的抽檢中能迅速尋找陽性樣品，保障食品安全。

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須滿足《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》的要求，也成為快檢技術(shù)的關(guān)鍵[24]。試驗(yàn)中，當(dāng)樣品金黃色葡萄球菌數(shù)在臨界值上時(shí)，此試劑盒的假陰性比較高，容易造成誤判。在開發(fā)食品中金黃色葡萄球菌快檢方法時(shí), 開發(fā)快速準(zhǔn)確的方法, 才能實(shí)現(xiàn)真正意義上的食品微生物的快速檢測。但另一方面，在實(shí)際食品樣品金黃色葡萄球菌檢測中，長期受其檢出率低困擾，在2018年大豐城區(qū)菜市場熟食中金黃色葡萄球菌的檢出率5.26%[21]， 2010～2016年金黃色葡萄球菌的檢出率為0.94%～4.11%[22]，2015～2016年淮安市食品中金黃色葡萄球菌檢出率為6.65%[23]，而此次采用快檢試劑盒在金黃色葡萄球菌的含菌量≥10 CFU/g時(shí)，可有效檢出，可作為一種有效的快檢手段，但當(dāng)快篩數(shù)據(jù)顯示異常時(shí)，應(yīng)盡快將樣品送至具有檢驗(yàn)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證，有效降低食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

4.1檢測市售的蘋果脆片和真空包裝水果玉米，均符合GB 29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》要求，兩者檢驗(yàn)結(jié)果一致。

4.2該試劑盒的靈敏度為93%，特異性為100%、假陰性率6.6%，假陽性率為0，顯著性差異為0.5，相對準(zhǔn)確度為96.7%，顯著性差異為0.5，其與國際法檢驗(yàn)結(jié)果一致性程度較高，且對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較低，操作簡單，檢驗(yàn)成本低，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間, 適于日常食品安全監(jiān)測工作和公共衛(wèi)生突發(fā)事件處理的快速檢測。