魯玉潔，周輝通,2，柯 娜，王繼卿，黃兆春，梁維煒，甄慧敏，羅玉柱，劉 秀，李少斌

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2 新西蘭林肯大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)學(xué)院，新西蘭 林肯 7647)

胴體性狀是綿羊育種和生產(chǎn)中的一個(gè)重要性狀，顯著影響綿羊的養(yǎng)殖效益。研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維數(shù)量和大小是影響綿羊產(chǎn)肉性能的關(guān)鍵因素[1]。在出生前后，動(dòng)物肌纖維的發(fā)育有明顯差異，在胚胎時(shí)期，肌纖維數(shù)量大量增加；個(gè)體出生后，肌纖維數(shù)量維持不變，但直徑顯著增大，導(dǎo)致個(gè)體產(chǎn)肉量不斷提高[2]。肌衛(wèi)星細(xì)胞是一種肌源性干細(xì)胞，在其發(fā)育為肌管的過程中，受到生肌調(diào)節(jié)因子家族(myogenic regulatory factors，MRFs)的影響[3]，生肌因子6(myogenic factor 6，MYF6)是其中的一員，MYF6基因由3個(gè)外顯子組成[4]。

MYF6基因在肌肉發(fā)生、肌管和肌纖維肥大等過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。敲除MYF6基因后，小鼠出現(xiàn)肌肉發(fā)育延遲、功能不全等現(xiàn)象[7]。另外，MYF6基因在小鼠胚胎期第16天(此時(shí)肌管大量分化)高度表達(dá)，說明該基因具有促進(jìn)肌管分化的作用[8]。除此之外，MYF6對動(dòng)物出生后肌肉的生長發(fā)育也至關(guān)重要，Yin等[9]發(fā)現(xiàn)，在肌纖維直徑較大的雞上，MYF6基因表達(dá)量顯著上調(diào)，這表明該基因可促進(jìn)雞肌纖維的發(fā)育。

MYF6基因的變異會顯著影響畜禽的產(chǎn)肉能力。Wyszynska-Koko等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MYF6基因的c.-335 T>C突變與波蘭大白豬的右半胴體質(zhì)量顯著相關(guān)(P<0.05)。賈偉德[11]研究發(fā)現(xiàn)，黃牛MYF6基因的131 T>G突變會影響肌內(nèi)脂肪含量等肉品質(zhì)性狀(P<0.05)。MYF6基因的核苷酸序列變異也顯著影響著鵝[12]、鴨[13]等動(dòng)物肌肉的生長發(fā)育和肉的品質(zhì)。目前，學(xué)者們已研究了綿羊MYF6基因的甲基化水平[14]及其在肌肉中的表達(dá)量[15]和其對綿羊部分屠宰性狀[1]的影響(P<0.05)，但尚未見關(guān)于其對綿羊胴體瘦肉性狀影響的研究報(bào)道。

本研究采用PCR-SSCP和測序等技術(shù)，檢測了第1外顯子和5′UTR區(qū)域的多態(tài)性，分析了序列變異對綿羊腰部瘦肉量等7種肌肉性狀的影響，并研究了MYF6基因在綿羊背最長肌等8個(gè)組織中的表達(dá)特征，以期為綿羊胴體性狀的改良提供有效的分子遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 羅姆尼羊胴體性狀數(shù)據(jù)和基因DNA的采集

以13只產(chǎn)肉性能優(yōu)良的羅姆尼公羊作為父本，采用人工授精技術(shù)與羅姆尼經(jīng)產(chǎn)母羊進(jìn)行配種。在所產(chǎn)后代羔羊中，挑選215只出生日期接近的公羔，詳細(xì)記錄其耳號、初生體質(zhì)量和出生等級(單羔、雙羔或多羔)。

用VIASCAN(Video Imaging Analysis System,VIASCAN)儀器測量羔羊胴體瘦肉率的精確度(達(dá)0.52)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的熱胴體質(zhì)量和GR值預(yù)測法(精確度均為0.19)，該方法還具有穩(wěn)定性高、節(jié)省人力、可預(yù)測脂肪深度等優(yōu)點(diǎn)，在自動(dòng)化預(yù)測產(chǎn)肉量方面具有巨大潛力[16]。本研究選取12周斷奶羔羊，稱取體質(zhì)量后立即屠宰，用VIASCAN儀器測定其肩部、腰部和后腿3個(gè)部位的瘦肉量(以瘦肉質(zhì)量占胴體質(zhì)量的百分比表示)，計(jì)算總瘦肉量(3個(gè)部位瘦肉量之和)及這3個(gè)部位瘦肉量占總瘦肉量的比例(瘦肉率)[17]。羔羊屠宰前采集血液，提取DNA[18]，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中綿羊MYF6基因序列(GenBank登錄號：NM_001134782.1)，設(shè)計(jì)3對特異性引物P1、P2和P3(表1)，其中P1和P2引物分別用于擴(kuò)增MYF6基因的第1外顯子(556 bp)和5′UTR(476 bp)區(qū)域，P3引物用于MYF6基因在各組織中表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測,內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。試驗(yàn)所用引物及其序列見表1。

表1 試驗(yàn)所用的引物信息Table 1 Primers used in the study

1.3 MYF6基因第1外顯子和5′UTR多態(tài)性的PCR-SSCP分析

PCR擴(kuò)增MYF6基因第1外顯子和5′UTR。反應(yīng)體系為：預(yù)混酶(10 U/μL)10 μL，上、下游引物(0.25 μmol/L)各0.8 μL，血液DNA(100 ng/μL) 0.8 μL， ddH2O 7.6 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，降溫至4 ℃結(jié)束。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物0.7 μL，加SSCP變性緩沖液7 μL，在PCR儀上于100 ℃條件下變性6 min之后，迅速點(diǎn)樣于聚丙烯酰胺凝膠中，在Bio-Rad(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)的Protean Ⅱ xi系統(tǒng)中進(jìn)行電泳。第1外顯子的電泳條件為：12%凝膠、14 ℃、390 V電泳18 h；5′UTR的電泳條件為：14%凝膠、25 ℃、200 V電泳18 h。對凝膠進(jìn)行銀染顯色[19]，讀取樣本的基因型。

1.4 等位基因序列測定

根據(jù)基因型，選擇適宜的方法測序：對于純合子，直接進(jìn)行Sanger測序；對于雜合子(無純合子個(gè)體)，則按照Gong等[20]建立的方法切取其中的純合型條帶進(jìn)行測序。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以保證結(jié)果的可靠性。

用DNAMAN(V.5.2.10)比對MYF6等位基因間核苷酸序列的差異，用POPGENE軟件(V.3.2)計(jì)算MYF6基因第1外顯子和5′UTR區(qū)域的等位基因頻率、基因型頻率、χ2值(Hardy-Weinberg平衡性檢驗(yàn))。

1.5 MYF6基因多態(tài)性對羔羊胴體性狀的影響

采用SPSS20.0軟件的一般線性混合效應(yīng)模型(general liner mixed-effect models,GLMMs)，分析第1外顯子基因型對公羔后腿、腰部、肩部瘦肉量及瘦肉比例和總瘦肉量等7個(gè)瘦肉性狀的影響。由于父本和初生體質(zhì)量影響了羔羊的瘦肉性狀(P<0.01)，因此在該模型中，將父本和初生體質(zhì)量作為隨機(jī)效應(yīng)。由于所有羔羊均飼養(yǎng)于同一農(nóng)場(飼養(yǎng)條件一致)，因此在模型中未考慮環(huán)境因素[17]。

1.6 MYF6基因在綿羊8個(gè)組織中的表達(dá)譜

在甘肅省武威市天祝縣一綿羊養(yǎng)殖場，選取3周歲、體況良好的3只小尾寒羊母羊。屠宰后采集其乳腺、肝臟、心臟、背最長肌、脾臟、肺臟、卵巢和腎臟等組織，去除表面雜質(zhì)和血漬后，放入液氮帶回實(shí)驗(yàn)室保存。用TRIzol Reagent(Invitrogen,CA,USA)試劑盒提取綿羊上述8個(gè)組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測MYF6基因在各組織中的表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系為：100ng/μL的cDNA 2μL，0.25 μmol/L的上、下游引物各0.4 μL，10 μmol/L的SYBR qPCR Master Mix 10 μL和RNase-free ddH2O 7.2 μL。RT-qPCR的具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算并比較MYF6基因在上述各組織中的相對表達(dá)量[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MYF6基因第1外顯子的遺傳特征

經(jīng)PCR-SSCP分析，MYF6基因第1外顯子檢測到A和B 2個(gè)等位基因，存在AA和AB 2種基因型(圖1)；測序結(jié)果表明，2個(gè)等位基因間存在c.129 C>T同義突變的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(single nucleotide polymorphism,SNP)(圖2)。等位基因A和B的頻率分別為89.30%和10.70%，基因型AA和AB的頻率分別為78.60%和21.40%，群體的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.08)。

1,2,4.AA基因型；3,5.AB基因型1,2,4.AA genotypes；3,5.AB genotypes圖1 綿羊MYF6基因第1外顯子區(qū)域的PCR-SSCP分析Fig.1 Analysis of the exon 1 region of MYF6 by PCR-SSCP

圖2 綿羊MYF6基因第1外顯子區(qū)域的SNP測序峰圖Fig.2 Sequencing of SNP in the exon 1 region of MYF6

2.2 MYF6基因5′UTR區(qū)域的遺傳特征

經(jīng)PCR-SSCP分析，在MYF6基因5′UTR區(qū)域檢測到C和D 2個(gè)等位基因，存在CC和DD 2種基因型(圖3)；測序結(jié)果(圖4)表明，與等位基因D的序列相比，等位基因C的序列中存在3 bp的堿基(c.-589～-590 del ATA)缺失。等位基因C和D的頻率分別為98.37%和1.63%,基因型CC和DD的頻率分別為96.74%和3.26%。在該研究區(qū)域，群體的基因型頻率也符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.82)。

圖4 綿羊MYF6基因5′UTR區(qū)域的測序峰圖Fig.4 Sequencing of 5′UTR region of MYF6

2.3 MYF6基因第1外顯子基因型對綿羊公羔胴體性狀的影響

在MYF6基因的第1外顯子區(qū)域上，2個(gè)基因型的頻率均大于5%，因此被用于對綿羊公羔胴體性狀的影響分析；而在5′UTR區(qū)域檢測到的2個(gè)基因型中，DD型的頻率小于5%，無法進(jìn)行相關(guān)分析。MYF6基因第1外顯子基因型對綿羊公羔胴體性狀影響的分析結(jié)果見表2。由表2可知，MYF6基因第1外顯子基因型對羔羊的后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量、總瘦肉量和腰部瘦肉比例均有極顯著影響(P<0.01)，AA型個(gè)體的后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量和總瘦肉量分別較AB型高0.5%，0.7%，0.5%和1.7%，但對后腿瘦肉比例和肩部瘦肉比例無明顯影響(P>0.05)。

1,2,4.CC基因型；3.DD基因型1,2,4.CC genotypes；3.DD genotypes

表2 MYF6基因第1外顯子基因型對羔羊瘦肉性狀的影響Table 2 Effect of genotypes in ovine MYF6 exon 1 on lean traits in male lambs

2.4 MYF6基因在綿羊8個(gè)組織中的相對表達(dá)量

由圖5可知，MYF6基因在綿羊背最長肌、卵巢、肺臟、脾臟、腎臟、肝臟和乳腺等8個(gè)組織中均有表達(dá)，但以背最長肌中的相對表達(dá)量最高，其余依次為卵巢、肺臟、脾臟、腎臟、肝臟、乳腺和心臟，其在背最長肌中的相對表達(dá)量分別是上述組織的86，104，108，109，171，1 308和13 841倍(P<0.01)。MYF6基因在卵巢、肺臟、脾臟和腎臟中的相對表達(dá)量之間無明顯差異(P>0.05)，但均顯著高于其在肝臟、乳腺和心臟組織中的相對表達(dá)量。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05) and difference capital letters indicate extremely significant difference (P<0.01)圖5 MYF6基因在綿羊不同組織中的表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of ovine MYF6 in different tissues

3 討 論

本研究在綿羊MYF6基因的第1外顯子上發(fā)現(xiàn)了1個(gè)同義突變的SNP(c.129 C>T)，雖然這個(gè)SNP不能改變編碼的氨基酸，但其作用不容忽視，因?yàn)樵揝NP有可能與MYF6基因其他重要區(qū)域的SNPs連鎖，從而調(diào)控MYF6基因的表達(dá)量或改變編碼蛋白的功能。有研究發(fā)現(xiàn)，同義突變的SNPs也能影響mRNA的生成效率和穩(wěn)定性，以及蛋白質(zhì)的生成效率和空間構(gòu)象，最終改變基因的功能[22]。Maak等[23]在人、小鼠、狗、雞和斑馬魚等物種上的研究發(fā)現(xiàn)，MYF6基因的啟動(dòng)子區(qū)域中存在7個(gè)SNPs。前人分別在山羊和雞MYF6基因的外顯子上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)和1個(gè)SNP[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)的SNPs在上述研究中均未報(bào)道，且此SNP形成的2個(gè)基因型間的部分胴體性狀存在顯著差異。本研究在5′UTR區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了1個(gè)3 bp的堿基缺失，但由于在本研究選用的215只羅姆尼羊中，這個(gè)核苷酸變異產(chǎn)生的等位基因D的頻率僅為1.63%，故無法研究該堿基缺失對綿羊胴體性狀的影響。前人對其他基因5′UTR區(qū)域的研究發(fā)現(xiàn)，此區(qū)域的堿基缺失具有重要作用，例如Bi等[26]對內(nèi)蒙古白絨山羊的研究發(fā)現(xiàn)，MSTN基因5′UTR區(qū)域的1個(gè)5 bp的堿基缺失對胸部深度有極顯著影響(P<0.01)；盧靖坤[27]在牛的MSTN上發(fā)現(xiàn)，5′UTR區(qū)域1個(gè)11 bp的堿基刪除造成了蛋白活性區(qū)域失活，最終形成了牛的雙肌表型。因此，建議將來在其他綿羊品種上，或用更多的綿羊樣本來進(jìn)一步研究MYF6基因5′UTR區(qū)域c.-589～-590 del ATA對綿羊胴體性狀的影響。

卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在綿羊MYF6基因的5′UTR區(qū)域和第1外顯子區(qū)域內(nèi)，羔羊的群體遺傳結(jié)構(gòu)符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。這說明本研究所使用的羅姆尼羊群體未受到明顯的人工選擇壓力，也未受到遷移、嚴(yán)格選配等其他因素的影響。因此，在以后的育種實(shí)踐中，建議加強(qiáng)人工選擇和選種選配，從而提高該群體的瘦肉量和瘦肉率。

王鑫等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，MYF6基因在山羊背最長肌中的表達(dá)量高于肝臟等其他組織。曹婷等[29]在豬上的研究發(fā)現(xiàn)，MYF6基因在肌肉中的表達(dá)量最高，在心臟中的表達(dá)量最低。本研究RT-qPCR結(jié)果顯示，MYF6基因在綿羊卵巢等8個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在背最長肌中的表達(dá)量最高，在心臟中的表達(dá)量最低(P<0.05)，這與其生物學(xué)作用有關(guān)。有研究表明，動(dòng)物出生后隨著肌纖維的發(fā)育，MYF6在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)量隨之增加[30]，說明MYF6基因在動(dòng)物生后肌纖維肥大過程中發(fā)揮著重要作用[5]。曹婷等[29]研究發(fā)現(xiàn)，MYF6在豬的肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中均有表達(dá)，但目前尚未見該基因在動(dòng)物卵巢和乳腺中表達(dá)情況的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，除了肌肉和心臟組織以外，MYF6在卵巢、乳腺、脾臟、肝臟、腎臟和肺臟中也有表達(dá)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MYF6基因的基因型對動(dòng)物肌肉量有顯著影響，如郭月英等[1]發(fā)現(xiàn)，AB型綿羊的眼肌面積大于AA型綿羊個(gè)體；孫文浩[25]發(fā)現(xiàn)，AA型雞具有更大的產(chǎn)肉量和胸肌、腰肌質(zhì)量(P<0.05)。本研究分析結(jié)果表明，MYF6第1外顯子的基因型對羔羊的瘦肉量有極顯著影響(P<0.01)，AA型個(gè)體的后腿瘦肉量、腰部瘦肉量、肩部瘦肉量和總瘦肉量分別較AB型高0.5%，0.7%，0.5%和1.7%。在發(fā)達(dá)國家的市售羊肉中，腰部和腿部的瘦肉都是肉質(zhì)較好的上等肉，特別是腰部的瘦肉，能被烹飪成法式羊排等附加值極高的食品。鑒于MYF6基因?qū)d羊后腿部、腰部和總瘦肉量的顯著影響，以及這3個(gè)部位瘦肉的良好品質(zhì)，該基因可以作為一個(gè)分子標(biāo)記，用于提高綿羊的胴體瘦肉量。

4 結(jié) 論

在綿羊MYF6基因的第1外顯子中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)SNP，在5′UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)了1個(gè)3 bp的堿基缺失(c.-589～-590 del ATA)。MYF6基因在綿羊背最長肌中的表達(dá)量最高，其基因型極顯著影響了羔羊的瘦肉性狀，可以作為分子標(biāo)記用于提高羔羊的酮體瘦肉量。