劉盼盼，孟肖冰，付 嬈，張 堯，常 瑋

(南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061)

大豆(Glycinemax)是植物蛋白和油脂的主要來源之一，也是生產(chǎn)生物柴油的重要原料。隨著人類消費和工業(yè)用料的快速增長，對大豆的需求也大幅增加，并將持續(xù)增長[1]。因此，提高產(chǎn)量潛力已成為大豆育種的長期目標(biāo)。大豆的產(chǎn)量潛力可以通過創(chuàng)造理想株型來提高，而大豆的理想株型包括株高適宜、節(jié)間距短、節(jié)數(shù)較多、分枝數(shù)少、每節(jié)莢數(shù)適中、結(jié)莢率高、四粒莢較多、百粒質(zhì)量適中、葉柄角小和葉柄長度短等特征[2]。其中葉柄角(leaf petiole angle，LPA)，即葉柄和主莖之間的傾角，是決定大豆和許多其他豆科植物株型的關(guān)鍵性狀。因此，挖掘與大豆葉柄角相關(guān)的基因并在此基礎(chǔ)上解析其調(diào)控機(jī)制，對改良大豆株型結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高產(chǎn)量具有重要意義。

目前，有關(guān)大豆LPA遺傳機(jī)制的研究鮮有報道。在基因定位研究方面，王存虎等[3]在大豆10條染色體上檢測到14個與LPA相關(guān)的QTL，其中Chr12上存在一個包含5個位點的QTL簇；王吳彬等[4]以栽培大豆為遺傳背景的野生大豆染色體片段代換系群體(SojaCSSLP1)為材料，檢測到5個LPA相關(guān)野生等位變異，其中Sat_286位點最高能解釋22%的表型變異。在功能基因研究方面，Gao等[5]利用輻射誘變獲得1個LPA增大的突變體，并挖掘到一個編碼APC8樣蛋白的基因GmILPA1，該基因突變后可使葉枕發(fā)育異常、葉柄角增大；進(jìn)一步研究表明，GmILPA1在不同葉夾角品種間表現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，且表達(dá)水平與葉夾角的大小相關(guān)。Chen等[6]2020年研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GmMYB14會上調(diào)GmBEN1基因的表達(dá)，后者主要參與內(nèi)源油菜素內(nèi)脂(brassinolipid，BR)的降解代謝，最終導(dǎo)致過表達(dá)植株BR含量降低、葉柄角變小，株型緊湊；該研究不僅證實了MYB轉(zhuǎn)錄因子在大豆株型調(diào)控中的重要作用，同時也表明大豆LPA與內(nèi)源BR含量有關(guān)。

BR是植物內(nèi)源激素，對植物的生長發(fā)育起著重要的調(diào)控作用[7]。如水稻BR在植株營養(yǎng)生長和籽粒發(fā)育過程中均發(fā)揮重要作用，擬南芥BR則在其光形態(tài)建成過程中對幼苗彎鉤打開和葉柄發(fā)育至關(guān)重要[8]。在水稻及玉米上的相關(guān)研究還表明，BR在葉片夾角調(diào)控中具有重要生理功能，而BR生物合成關(guān)鍵基因CYP則在該調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。有關(guān)豆科模式植物蒺藜苜蓿的最新研究也表明，CYP基因具有調(diào)節(jié)其羽狀復(fù)葉的小葉運動的功能[11]。但CYP基因在大豆LPA調(diào)控中的作用尚不清楚。為解決這一問題，本試驗擬在前人研究基礎(chǔ)上克隆大豆CYP基因，并分析其表達(dá)特性，以期為闡明大豆LPA調(diào)控分子機(jī)制及理想株型育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

大豆品種為鄭豆196，播種于河南陽師范學(xué)院科技示范農(nóng)場。于V3期移植一些幼苗至光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：光照12 h/黑暗12 h，溫度(25±1) ℃，光照強(qiáng)度20 klx，相對濕度60%。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞及克隆載體pEASY-T1均購于Transgen公司。

RNA提取試劑TranZOL Up、反轉(zhuǎn)錄試劑First-strand cDNA Synthesis SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)和Top Green qPCR SuperMix (+Dye Ⅰ)，均購于Transgen公司；凝膠回收試劑盒，購于Axygen公司；高純度質(zhì)粒小量提試劑盒，購自Solarbio公司。

1.2 大豆CYP基因的同源克隆

使用TranZOL Up試劑從大豆葉柄中提取總RNA，測定濃度后作為模板，合成cDNA第一鏈。登錄Phytozome基因組數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/)，以玉米BRD1基因氨基酸序列作為查詢序列(GRMZM2G103773)，利用在線BLAST程序中的TBLASTN工具比對大豆基因組(Glycine max Wm82.a2.v1)，獲得相似性最高的候選基因。

根據(jù)候選基因編碼蛋白(CDS)序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，根據(jù)pCAMBIA3301載體的多克隆位點，分別在上、下游引物的5′端加上EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點。經(jīng)優(yōu)化，上游引物序列為：5′-TAGGGAATTCCAACACAAGAGACT-3′，下游引物序列為：5′-CTACAAGCTTTTACATCTCATCTCATT-3′，預(yù)期產(chǎn)物長度為1 525 bp。

以合成第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增候選基因的目的片段，擴(kuò)增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃ 保存。擴(kuò)增體系50 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye) 25 μL，1×上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠回收后與T載體連接并進(jìn)行測序，將目標(biāo)基因命名為GmCYP85A2。

1.3 大豆GmCYP85A2基因的生物信息學(xué)分析

在獲得目的基因序列的基礎(chǔ)上，采用在線工具分析候選基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量及等電點(pI)等理化性質(zhì)(ProtParam，https://web.expasy.org/protparam/)，預(yù)測大豆候選基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)(SPOMA，https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)、功能位點(Prosite，http://prosite. expasy.org/)、三級結(jié)構(gòu)(SWISS-MODEL，https://www.swissmodel. expasy.org/)、跨膜結(jié)構(gòu)(TMHMM2.0，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)和亞細(xì)胞定位(BaCelLo，http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)。以候選基因氨基酸序列作為查詢序列，在NCBI上通過Blastp搜索其他物種的CYP蛋白序列并下載，利用MEGA v5.0軟件中的NJ算法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用在線軟件PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)對轉(zhuǎn)錄起始位置ATG上游2 kb的啟動子序列進(jìn)行分析，對候選基因的表達(dá)特性及調(diào)控模式進(jìn)行初步預(yù)測。

1.4 大豆GmCYP85A2基因的表達(dá)模式分析

于R3期分別提取大豆植株的根、莖、葉片、葉柄、花、花芽和長5 mm的豆莢，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，以葉柄中的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)研究GmCYP85A2基因的組織表達(dá)情況。將V3期大豆植株移植至光照培養(yǎng)箱中，主莖與水平面平行放置，用量角器測量發(fā)現(xiàn)，靠近光源一側(cè)的葉片會因向光運動導(dǎo)致葉柄角增大；分別在0(對照)，4，8，12，16，20，24 h后提取葉柄RNA，逆轉(zhuǎn)錄后作為PCR模板，研究GmCYP85A2基因響應(yīng)光照的表達(dá)特性。

以GmCYP85A2基因和大豆β-Actin基因CDS序列為模板，設(shè)計并合成GmCYP85A2基因特異引物(上游引物序列為：5′-CACAGTGGATTCCAGGCAAG-3′；下游引物序列為：5′-CAGTCACGGCCTAGTTAGTAAGATG-3′)，及β-Actin內(nèi)參基因特異引物(上游引物序列為：5′-GATCTACCATGTTCCCAAGT-3′；下游引物序列為：5′-ATAGAGCCACCAATCCAGAC-3′)，應(yīng)用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10 μL Top Green qPCR SuperMix (+Dye Ⅰ)，1 μL cDNA模板，上、下游引物各0.4 μL，8.2 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共 40 個循環(huán)；融解曲線分析條件為：94 ℃ 10 s，65 ℃ 34 s，94 ℃ 15 s。組織表達(dá)特性和光照響應(yīng)表達(dá)特性試驗中每處理均設(shè)3個樣本，每樣本設(shè)3個重復(fù)。用2-ΔΔCT法分析GmCYP85A2基因的相對表達(dá)情況。采用Excel 2019進(jìn)行相關(guān)分析及顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmCYP85A2基因的克隆

以合成第一鏈cDNA為模板，利用基因特異引物擴(kuò)增大豆候選基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1 000～2 000 bp有1條特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物長度相符(圖1)?；厥占兓疨CR產(chǎn)物后，經(jīng)測序產(chǎn)物長度為1 524 bp，將該基因命名為GmCYP85A2。

1.GmCYP85A2基因PCR產(chǎn)物；M.DL2000 Marker1.Production of GmCYP85A2；M.DL2000 Marker圖1 大豆GmCYP85A2基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR of GmCYP85A2 gene in soybean

2.2 大豆GmCYP85A2基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 測序結(jié)果 序列分析結(jié)果表明，GmCYP85A2基因開放閱讀框長1 401 bp，可編碼466個氨基酸。與參考基因Glyma.19G033900.1的CDS序列相比，GmCYP85A2基因在1 393 bp位置(參考基因終止密碼子上游3 bp)存在1個核苷酸的缺失，從而導(dǎo)致該位點發(fā)生移碼。與參考基因相比，GmCYP85A2基因編碼蛋白序列的第465個氨基酸由酪氨酸(UAC)變?yōu)樘K氨酸(ACU)，且多出1個天冬酰胺(AAC)(圖2)。

“*”表示一致的氨基酸，方框里面指終止密碼子“*”means induced amino acid，box refers to termination codon 圖2 大豆GmCYP85A2基因序列與參考序列Glyma.19G033900.1的比對Fig.2 Comparison of GmCYP85A2 gene sequence in soybean and reference sequence Glyma.19G033900.1

2.2.2 生物信息學(xué)特征 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，GmCYP85A2基因編碼蛋白分子質(zhì)量為53.4 ku，理論等電點(pI)為9.00。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)α螺旋所占比例最大，為51.07%；其次為無規(guī)卷曲，約占39.91%；β折疊所占比最小，約為9.01%。利用Prosite分析GmCYP85A2蛋白的功能位點發(fā)現(xiàn)，該蛋白的408～417氨基酸位點具有屬于P450家族的半胱氨酸血紅素鐵配體結(jié)構(gòu)，保守序列為FGGGTRQCPG。此外，蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測也表明該蛋白屬于P450蛋白家族(圖3)。

圖3 大豆GmCYP85A2蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of GmCYP85A2 protein in soybean

對GmCYP85A2基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析，該蛋白無信號肽，包含1個跨膜結(jié)構(gòu)，位于該蛋白N端的3～25氨基酸位點(FLMAIVVVGVVLVLCFCSALLRW)，共包含18個疏水氨基酸，且功能位點位于膜外，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示該蛋白為分泌型蛋白(圖4)。

圖4 大豆GmCYP85A2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.4 Transmembrane structure prediction of GmCYP85A2 protein in soybean

序列比對結(jié)果顯示，GmCYP85A2與野生大豆(Glycinesoja)CYP85A同源性最高，為97%。選擇與GmCYP85A2相似度最高的24個物種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化分析樹，結(jié)果(圖5)表明，25種植物可分為4個分支，第1個分支較大，包含栽培大豆、野生大豆、木豆、雞血藤、黧豆、綠豆、赤豆、非洲相思子、蒺藜苜蓿、鷹嘴豆和白羽扇豆等豆科植物；第2個分支包括薔薇科的櫻桃、歐洲甜櫻桃、扁桃，殼斗科的板栗，大葉櫟，栓皮櫟，蕁麻目的異色山黃麻和大麻，以及楊梅和核桃；豆科植物蔓花生、落花生、豇豆和菜豆則屬于第3個分支；豆科植物角豆樹則單獨在一個分支。

圖5 大豆CYP85A2基因編碼蛋白與其他植物CYP85A蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of GmCYP85A2 in soybean and CYP85A of plants

2.2.3GmCYP85A2基因啟動子分析 利用Pla-ntCARE對GmCYP85A2轉(zhuǎn)錄起始位置ATG上游2 kb的啟動子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，GmCYP85A2基因啟動子含有多個響應(yīng)光照的順式作用元件，如GT1、ACE、G-box、GA、Box 4、ATCT、I-box等。另外還含有與生長發(fā)育和逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如GARE響應(yīng)赤霉素、TCA響應(yīng)水楊酸信號(可能參與植物抗病反應(yīng))，而LTR則響應(yīng)低溫脅迫。

2.3 大豆GmCYP85A2基因的表達(dá)特性分析

2.3.1 組織表達(dá)特異性 qRT-PCR分析結(jié)果(圖6)表明，GmCYP85A2基因在不同組織中表達(dá)差異較大，且以花中的相對表達(dá)量最高，約為葉柄中表達(dá)量的6.5倍；其次是花芽和豆莢，分別為葉柄表達(dá)量的2.3和1.2倍；其他組織中的表達(dá)量均低于葉柄，且以葉片中的表達(dá)量最低。表明GmCYP85A2基因可能參與大豆花及幼胚發(fā)育過程；葉片與葉柄中表達(dá)量的差異則說明，大豆發(fā)育至V期時的各項生理活動所需CYP85A2蛋白可能來自于葉柄。

圖6 大豆GmCYP85A2基因的組織表達(dá)特異性Fig.6 Tissue expression characteristics of GMCYP85A2 gene in soybean

2.3.2 光照響應(yīng)特征 圖7顯示，將大豆主莖水平放置后，隨著時間延長，靠近光源一側(cè)的葉柄角逐漸變大，葉柄中GmCYP85A2的表達(dá)量在0～12 h呈上調(diào)趨勢，到12 h時約為對照的14倍；之后開始緩慢回落，但仍然維持較高的水平；至24 h時約為對照(0 h)的9.2倍。此結(jié)果表明，光照既能誘導(dǎo)大豆葉柄GmCYP85A2基因的表達(dá)，也能誘導(dǎo)葉柄角發(fā)生改變，且某時間段(0～12 h)葉柄角與該時段起點GmCYP85A2的表達(dá)量存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.77，0.05

圖7 大豆葉柄中GmCYP85A2基因的光照響應(yīng)特征Fig.7 Light response characteristics of GMCYP85A2 gene in soybean petiole

3 討 論

本研究得到的GmCYP85A2蛋白408～417氨基酸位點具有P450家族半胱氨酸血紅素鐵配體保守結(jié)構(gòu)，與Xu等[12]研究結(jié)果相似。近年的研究表明，目前大多數(shù)已知的植物P450被存在于N端的疏水肽錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的膜表面，形成跨膜片段[13]。本研究中的GmCYP85A2蛋白N端3～25氨基酸位點包含1個由18個疏水氨基酸組成的跨膜結(jié)構(gòu)，且該蛋白為分泌型蛋白，均符合植物P450的結(jié)構(gòu)特征。

細(xì)胞色素P450羥化酶超基因家族催化活性廣泛，無論在植物基礎(chǔ)代謝還是次級代謝過程中都具有重要作用[14]。植物細(xì)胞色素P450羥化酶數(shù)量龐大，根據(jù)氨基酸序列相似性可分為11個獨立的家族[15]。僅大豆中有功能注釋的基因就多達(dá)306個，但多數(shù)為生物學(xué)功能未知的基因[13]。少數(shù)幾個功能明確的基因被證實在大豆的多個生理過程中發(fā)揮重要作用，如CYP81E11[16]、CYP81E22[17]分別是大豆對鹽脅迫及除草劑苯達(dá)松高度敏感的關(guān)鍵基因，CYP86A37和CYP86A38在體內(nèi)發(fā)揮脂肪酸ω-羥化酶的作用[18]；雙子葉植物特有的CYP82家族基因則被證實參與了茉莉酸和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而增強(qiáng)了大豆對生物和非生物脅迫的抗性[19]。

本研究的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，大豆GmCYP85A2基因編碼蛋白與多種植物的CYP85蛋白具有較高的同源性。在植物中P450CYP85家族具有廣泛的底物特異性，催化BR生物合成中多個必要的C-6氧化反應(yīng)，是BR合成的關(guān)鍵酶[20-21]，具有調(diào)控株高、葉角和籽粒大小、開花、葉片衰老、花粉發(fā)育和雄性不育、葉綠體發(fā)育、根生長和發(fā)育、光形態(tài)建成的功能[22-28]，并在植物對生物和非生物脅迫的應(yīng)激反應(yīng)等生理過程中發(fā)揮著重要作用[29-31]。此外，CYP85基因還是植物二萜類化合物合成[32]以及皂角(GlehniaLittoralis)中呋喃香豆素(Furanocoumarin)生物合成途徑下游的關(guān)鍵酶基因[33]。

本研究對大豆GmCYP85A2基因的組織表達(dá)模式進(jìn)行了初步探索，結(jié)果表明，該基因具有組織特異性，主要在花、花芽、豆莢及葉柄等地上部分表達(dá)，與Bancos等[20]的“擬南芥CYP85A2轉(zhuǎn)錄本表達(dá)特性”研究結(jié)果一致。本研究中，與其他組織相比，GmCYP85A2在花中相對表達(dá)量明顯上調(diào)，表明該基因可能參與大豆花發(fā)育過程的調(diào)控。在擬南芥中，BES1轉(zhuǎn)錄因子受BR的調(diào)控而表達(dá)，再與ELF6和REF6等轉(zhuǎn)錄因子互作來調(diào)節(jié)開花時間[25]。推測大豆GmCYP85A2也可能通過調(diào)控BR的生物合成發(fā)揮開花調(diào)控功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmCYP85A2基因表現(xiàn)出一定的光照響應(yīng)表達(dá)特性，光照0～12 h葉柄中GmCYP85A2的表達(dá)量隨葉柄角逐漸變大而增大，表明該基因可能參與大豆葉柄角調(diào)控；12 h后表達(dá)量有一定程度下降，表明該基因轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。Bancos等[20]研究表明，在擬南芥中，CYP85A2基因不僅是BR生物合成的關(guān)鍵酶，同時BR也會對CYP85A2基因具有反饋調(diào)節(jié)作用，從而使該基因表達(dá)量下調(diào)。據(jù)此推測大豆GmCYP85A2基因可能是BR生物合成的關(guān)鍵基因，并對葉柄角有一定的調(diào)控作用，同時該基因表達(dá)會受到BR的反饋調(diào)節(jié)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，GmCYP85A2基因啟動子含有多個響應(yīng)光照的順式作用元件，如GT1、ACE、G-box、GA、Box 4、ATCT、I-box等；同時表達(dá)分析結(jié)果也表明，0～12 h葉柄中GmCYP85A2的表達(dá)量隨著光照時間推移而上調(diào)，并伴隨著葉柄角的逐漸增大，表明GmCYP85A2基因的表達(dá)受光照的調(diào)控，并對葉柄角作出調(diào)節(jié)，而該基因是否通過參與大豆BR生物合成來調(diào)控葉柄角還有待進(jìn)一步研究。此外，GmCYP85A2基因啟動子含有能夠響應(yīng)赤霉素、水楊酸信號及低溫脅迫信號的順式作用元件GARE、TCA及LTR，但該基因是否參與大豆生長發(fā)育調(diào)節(jié)以及抵抗生物和非生物逆境脅迫也有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究采用同源克隆技術(shù)克隆大豆GmCYP85A2基因，對其編碼蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，同時進(jìn)行基因組織表達(dá)和光照響應(yīng)表達(dá)特性分析，結(jié)果表明，GmCYP85A2基因編碼蛋白具有典型的P450超家族保守結(jié)構(gòu)和蛋白三級結(jié)構(gòu)，該基因啟動子區(qū)含有多個響應(yīng)光照的順式作用元件。R3期該基因主要在大豆花、花芽、豆莢及葉柄中表達(dá)，且以花中的表達(dá)量最大；而在V3期，葉柄中GmCYP85A2的表達(dá)量受光照影響而上調(diào)，并伴隨著葉柄角的變大。