王婷婷,陳鴿,包悅琳,金東淳

(延邊大學農學院,吉林 延吉 133000)

鐵是植物必需的微量營養(yǎng)素,在植物生長發(fā)育過程中參與光合作用、呼吸作用、葉綠素合成、氧化還原反應、氮固定等多種生理生化反應[1-2]。鐵缺乏將會導致植物生理生化發(fā)生不利改變,輕度缺鐵時植物光合速率降低,葉綠素合成減少,嚴重時葉片會出現黃化現象[3-4]。重度缺鐵時,植物新生葉片變黃,葉綠素合成停止,生物量大幅度下降,導致農作物產量和品質降低[5-6]。鐵在地殼中含量很高,但其主要以生物有效性低的三價鐵形式存在,特別是在堿性土壤中,堿性和高碳酸鹽嚴重降低了有效鐵的溶解度。由于缺鐵導致葉綠素生物合成受阻造成的植物缺鐵黃化癥(IDC),是一種功能性缺鐵,葉片失綠變黃[7]。缺鐵植物吸收土壤中鐵通常分為2種機制:非禾本科單子葉植物和雙子葉植物通常采用還原吸收機制,即缺鐵時,通過鐵螯合還原酶(FCR)將土壤中溶解度較低的Fe3+還原成易被植物吸收的Fe2+[8];禾本科植物主要采用螯合吸收機制,缺鐵時,植物會通過合成與分泌麥根酸(mugineic acid,MA)類物質并螯合鐵來滿足對鐵元素的需求[9]。依靠Fe3+還原系統吸收鐵的植物,如雙子葉植物大豆,往往比使用螯合吸收機制的禾本科植物對缺鐵更敏感[10]。在缺鐵條件下,大豆地上部幼葉脈間均勻失綠,葉脈正常,無斑、無畸形,隨著時間推移,病葉最后干枯;地下部根系發(fā)育較差,根短而細少,根瘤數量較少,嚴重時植株早期枯萎和死亡[11-12]。

近幾年,轉錄組測序技術已廣泛應用于大豆對缺鐵脅迫響應的研究[13-17]。O’Rourke等[13]通過轉錄組測序,發(fā)現鐵高效大豆品種‘Clark’在響應長期(14 d)缺鐵脅迫時,根系中與鐵吸收和穩(wěn)態(tài)、防御以及DNA復制、甲基化作用相關的基因表達有差異。Atwood等[14]進一步的研究表明,‘Clark’對缺鐵脅迫的應激反應中DNA復制基因的沉默導致與防御、免疫、衰老、死亡、蛋白質修飾、蛋白質合成、光合作用以及鐵攝取和轉運相關基因的大量轉錄重編程。Lauter等[15]通過轉錄組測序,發(fā)現‘Clark’在響應早期(1和 6 h)缺鐵脅迫時,在根系中參與防御、激素信號、鐵吸收的基因差異表達,在葉片中參與DNA復制和糖信號傳導的基因差異表達。Lauter等[16]通過轉錄組測序發(fā)現,‘Clark’在缺鐵脅迫30 min時就能檢測到參與鐵吸收和穩(wěn)態(tài)、防御以及DNA復制、甲基化作用的差異表達基因。這些研究表明,在長期和短期缺鐵脅迫下,鐵穩(wěn)態(tài)、防御和DNA復制、甲基化相關基因均參與了‘Clark’的缺鐵應激反應,說明大豆可能存在新的機制來響應缺鐵脅迫。目前,我國對大豆缺鐵脅迫的響應差異研究較少[17]。本研究對不同鐵效率大豆品種進行早期缺鐵脅迫處理,從分子水平解析我國大豆品種根系早期對缺鐵脅迫的響應差異,為了解我國大豆品種鐵吸收機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水培試驗于2020年在延邊大學農學院人工氣候室進行,供試材料為已鑒定的鐵高效大豆品種‘吉育99’和鐵低效大豆品種‘吉育93’[6]。在鐵缺乏(1 μmol·L-1Fe)營養(yǎng)液中培養(yǎng)20 d的2個品種植株表型見圖1。

圖1 在鐵缺乏(1 μmol·L-1 Fe)營養(yǎng)液中培養(yǎng)20 d時鐵高效品種‘吉育99’(A)和鐵低效品種‘吉育93’(B)V2期葉片顏色對比

1.2 試驗設計

為模擬堿性石灰性土壤,本試驗建立了一套水培體系。將常規(guī)發(fā)芽(芽長2～3 cm)且發(fā)育良好的大豆幼苗移至1 L含正常鐵含量(25 μmol·L-1Fe)的營養(yǎng)液中。營養(yǎng)液由1.5 mmol·L-1KNO3、0.8 mmol·L-1Ca(NO3)2、0.3 mmol·L-1(NH4)H2PO4、0.2 mmol·L-1MgSO4、25 μmol·L-1CaCl2、25 μmol·L-1H3BO3、2 μmol·L-1MnCl2、2 μmol·L-1ZnSO4、0.5 μmol·L-1Na2MoO4、0.1 μmol·L-1CuSO4、1 mmol·L-1MES緩沖液(pH5.5)和25 μmol·L-1Fe(Ⅲ)EDDHA構成,每4 d換1次營養(yǎng)液。水培16 d后即植株長出第1片三出復葉時,將所有幼苗的根系在蒸餾水中沖洗6次,然后分別轉入鐵正常(25 μmol·L-1Fe)和鐵缺乏(1 μmol·L-1Fe)營養(yǎng)液中,處理1 和6 h后取植株的完整根系,裝袋標記并在液氮中快速冷凍后置于-80 ℃保存,每個樣品3次重復。RNA提取、建庫和轉錄組測序均委托北京百邁客生物科技有限公司完成。

將‘吉育99’和‘吉育93’分別命名為T、S,各時間的處理組合如表1所示。

表1 試驗材料的處理組合

1.3 文庫構建

樣品檢測合格后,進行文庫構建:用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA,加入Fragmentation Buffer將mRNA隨機打斷,以mRNA為模板,用六堿基隨機引物(random hexamers)合成第1條cDNA鏈,加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成第2條cDNA鏈,利用AMPure XP beads純化 cDNA;純化的雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾并連接測序接頭,然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇;通過PCR富集得到cDNA文庫。文庫構建完成后,使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度(>2 nmol·L-1)進行準確定量,以保證文庫質量。庫檢合格后,不同文庫按照目標下機數據量進行pooling,用Illumina平臺進行測序。

1.4 測序數據質量控制

采用如下過濾方式對數據進行質量控制:去除含有接頭的Reads,去除低質量的Reads(包括去除N的比例大于10%的Reads、去除質量值Q≤10的堿基數占整條Read的50%以上的Reads),對高質量的Clean Data進行分析。

1.5 基因表達量與差異基因的篩選

抽取自一個轉錄本的片段數與測序數據(或Mapped Data)量、轉錄本長度、轉錄本表達水平都有關,為了讓片段數能真實地反映轉錄本表達水平,需要對樣品中的Mapped Reads數和轉錄本長度進行歸一化。StringTie通過最大流量算法,采用FPKM[18](fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)作為衡量轉錄本或基因表達水平的指標,FPKM計算公式如下:

式中:cDNA Fragments表示比對到某一轉錄本上的片段數,即雙端Reads數;Mapped Fragments(Millions)表示比對到轉錄本上的片段總數(106);Transcript Length(kb)表示轉錄本長度(103個堿基)。

將數據庫與大豆基因組數據庫(Wm82.a2.v1)進行對比,利用edgeR軟件[19]進行樣品組間的差異表達分析,在差異表達基因檢測過程中,將差異表達倍數(fold change)≥ 2且差異顯著性P<0.05作為篩選標準。差異表達倍數表示兩樣品(組)間表達量的比值。

1.6 差異表達基因GO分類

根據差異基因檢測結果,使用Blast2GO軟件[20]對差異表達基因進行GO功能注釋,再用WEGO軟件進行GO功能分類統計并繪圖。

1.7 差異表達基因KEGG通路富集分析

根據差異基因檢測結果,根據KEGG數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)對差異表達基因進行KEGG注釋,并利用KOBAS軟件[21]對檢測到的差異基因進行KEGG通路分類以及富集分析,本試驗以Q<0.05為閾值,將滿足該閾值的代謝通路定義為在差異表達基因中顯著富集的通路。

1.8 差異表達基因轉錄因子分析

對篩選到的差異表達基因進行轉錄因子分析,將差異表達基因比對到植物轉錄因子數據庫4.0(plant transcription factor database,PlantTFDB 4.0)(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/),所設閾值為E=1×10-5,獲得差異表達基因的轉錄因子分類與數目。

2 結果與分析

2.1 測序質量分析

本試驗分別對鐵高效、鐵低效大豆24個根系樣本進行有參轉錄組測序(表2),共獲得236.33 Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達到5.81 Gb,GC含量均在44.53%及以上,Q20堿基比例在96.74%及以上,Q30堿基比例在91.60%及以上。以上數據說明全部樣品轉錄組測序質量較高,可為后續(xù)的差異表達基因分析提供科學的依據。

表2 測序數據質量評估統計表

2.2 大豆根系響應早期缺鐵脅迫差異表達基因(DEG)數分析

從圖2可見:與對照(CK)相比,1 h鐵高效組共篩選出2 309個DEG,其中上調1 051個,下調1 258個;1 h鐵低效組共篩選出1 512個DEG,其中上調597個,下調915個;6 h鐵高效組共篩選出2 320個DEG,其中上調1 346個,下調974個;6 h鐵低效組共篩選出1 307個DEG,其中上調637個,下調670個。結果表明,缺鐵脅迫1 h時,鐵高效和低效大豆品種根系中差異表達基因多數為下調基因;缺鐵脅迫6 h時,鐵高效大豆品種的差異表達基因多數為上調,鐵低效大豆品種下調基因仍占多數。綜上,鐵高效大豆品種差異基因的數量和表達量隨著缺鐵脅迫時間的延長而增加,而鐵低效品種差異基因數量和表達量隨著脅迫時間的延長而降低。

圖2 缺鐵脅迫下不同鐵效率大豆品種差異表達基因數

2.3 大豆根系響應早期缺鐵脅迫DEG的GO功能分析

缺鐵脅迫處理1 h的鐵高效大豆品種在生物學過程中的細胞進程富集的DEG數為739個,代謝過程富集的DEG數為677個;細胞組分中的細胞和細胞成分富集的DEG數均為839個;分子功能中的結合富集的DEG數為841個,催化活性富集的DEG數為804個(圖3-A)。鐵低效大豆品種在生物學過程中的細胞進程富集的DEG數為449個,代謝過程富集的DEG數為410個;細胞組分中的細胞和細胞成分富集的DEG數均為506個;分子功能中的結合富集的DEG數為570個,催化活性富集的DEG數為513個(圖3-B)。

圖3 GO功能分類統計

缺鐵脅迫處理6 h的鐵高效大豆品種在生物學過程中的細胞進程富集的DEG數為734個,代謝過程富集的DEG數為676個;細胞組分中的細胞和細胞成分富集的DEG數均為802個;分子功能中的催化活性富集的DEG數為868個,結合富集的DEG數為857個(圖3-C)。鐵低效大豆品種在生物學過程中的細胞進程富集的DEG數為430個,代謝過程富集的DEG數為388個;細胞組分中的細胞和細胞成分富集的DEG數均為494個;分子功能中的結合富集的DEG數為521個,催化活性富集的DEG數為466個(圖3-D)。

差異表達基因的GO功能分析結果表明,不同鐵效率大豆品種根系在響應早期(1和6 h)缺鐵脅迫時,產生的差異表達基因均顯著富集在細胞進程、代謝過程、細胞和細胞成分以及分子結合和催化活性相關功能基因中,表明缺鐵脅迫對大豆的細胞及生理代謝過程存在較大的影響。

2.4 大豆根系響應早期缺鐵脅迫DEG的KEGG富集分析

由圖4-A可見:與對照相比,缺鐵脅迫處理1 h的鐵高效大豆品種共有774個DEG富集于117條通路中,鐵低效大豆共有522個DEG富集于113條通路中;缺鐵脅迫處理6 h的鐵高效大豆品種共有807個DEG富集于125條通路中,鐵低效品種共有472個DEG富集于115條通路中。在富集顯著性(Q<0.05)最可靠的前20條代謝通路中,缺鐵脅迫處理1 h的鐵高效大豆品種差異表達基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(63個)、倍半萜和三萜生物合成(16個)、植物病原體相互作用(111個)、植物MAPK信號通路(60個)、類黃酮生物合成(18個)、植物激素信號轉導(95個)、淀粉和蔗糖代謝(53個)等。缺鐵脅迫處理1 h的鐵低效大豆品種差異表達基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(36個)、倍半萜和三萜生物合成(9個)、植物病原體相互作用(92個)、植物MAPK信號通路(51個)、類黃酮生物合成(17個)、淀粉和蔗糖代謝(42個)、植物晝夜節(jié)律(19個)等(圖4-B)。

圖4 缺鐵脅迫處理1 h差異表達基因的KEGG富集分析

缺鐵脅迫處理6 h的鐵高效大豆品種差異表達基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(72個)、倍半萜和三萜生物合成(10個)、類黃酮生物合成(24個)、植物晝夜節(jié)律(23個)、糖酵解/糖異生(34個)、角質、木栓質和蠟的生物合成(13個)、半乳糖代謝(27個)等(圖5-A)。缺鐵脅迫處理6 h的鐵低效大豆品種差異表達基因顯著富集的代謝通路有苯丙烷生物合成(34個)、倍半萜和三萜生物合成(6個)、植物MAPK信號通路(36個)、類黃酮生物合成(10個)、亞油酸代謝(9個)、抗壞血酸和醛酸代謝(12)、谷胱甘肽代謝(14)等(圖5-B)。

圖5 缺鐵脅迫處理6 h差異表達基因的KEGG富集分析

綜上可知,不同鐵效率大豆品種在響應早期(1和6 h)缺鐵脅迫時,產生的差異表達基因均富集于苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成等代謝通路。

2.5 大豆根系響應早期缺鐵脅迫的轉錄因子分析

缺鐵脅迫處理1 h,鐵高效大豆品種存在轉錄因子的差異表達基因總共有273個,這些轉錄因子共劃分到41個轉錄因子家族中,其中,差異表達基因最多的轉錄因子家族是AP2/ERF-ERF(38個),其次為C2H2(27個)、MYB(26個)、WRKY(23個)、bHLH(23個)、NAC(12個)等(圖6-A);鐵低效大豆品種存在轉錄因子的差異表達基因總共有197個,共劃分到39個轉錄因子家族中,其中,差異表達基因最多的轉錄因子家族是AP2/ERF-ERF(26個),其次為MYB(20個)、WRKY(19個)、C2H2(15個)、bHLH(14個)、NAC(10個)等(圖6-B)。缺鐵脅迫處理6 h,鐵高效大豆品種存在轉錄因子的差異表達基因總共有217個,這些轉錄因子共劃分到42個轉錄因子家族中,其中,差異表達基因最多的轉錄因子家族是bHLH(25個),其次為WRKY(20個)、AP2/ERF-ERF(16個)、NAC(14個)、MYB(13個)、C2H2(12個)等(圖6-C);鐵低效大豆品種存在轉錄因子的差異表達基因總共有134個,共劃分到39個轉錄因子家族中,其中,差異表達基因最多的轉錄因子家族是bHLH(18個),其次為AP2/ERF-ERF(12個)、MYB(12個)、NAC(10個)、WRKY(9個)等(圖6-D)。結果表明,鐵高效大豆品種在響應缺鐵脅迫時,在1和6 h的差異表達基因所涉及的轉錄因子家族具有高度相似性,受缺鐵脅迫調控的轉錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、C2H2、MYB、WRKY、bHLH、NAC等。同樣,鐵低效大豆品種也具有高度相似性,受缺鐵脅迫調控的轉錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、bHLH、NAC等。

圖6 差異表達基因所屬轉錄因子家族分類

3 討論

不同鐵效率大豆品種對缺鐵黃化癥的耐受性存在顯著差異[22],為了解不同鐵效率大豆品種根系對早期缺鐵脅迫的響應差異,本研究對缺鐵脅迫下的鐵高效品種(吉育99)和鐵低效品種(吉育93)根系進行轉錄組測序。通過對不同鐵效率大豆品種在缺鐵脅迫條件下產生的差異基因數進行統計分析,結果表明,與對照(CK)相比,缺鐵脅迫處理1 h時,2個大豆品種根系中多數基因表達量降低,少數升高;缺鐵脅迫處理6 h時,鐵高效大豆品種大部分差異基因表達量顯著上升,多數為上調基因,而鐵低效大豆品種下調基因仍占多數。本研究發(fā)現,鐵高效大豆品種差異基因數和表達量隨著缺鐵脅迫時間的延長而增加,而鐵低效品種差異基因數和表達量隨著脅迫時間的延長而降低。差異基因在2個大豆品種中表達情況不一致,說明早期缺鐵脅迫對大豆相關基因表達量存在一定影響,且對不同鐵效率大豆品種的影響存在顯著差異。

脅迫可以引發(fā)植物的一系列反應。脅迫反應始于植物在細胞水平上對脅迫的識別,這種識別可以激活信號轉導途徑,從而在個體細胞內及整株植物中傳遞。在差異表達基因的GO功能分析中,主要涵蓋了生物學過程,細胞組分和分子功能三大類。本研究結果表明,不同鐵效率大豆品種受早期缺鐵脅迫影響產生的差異表達基因在生物學過程中的細胞進程、代謝過程,細胞組分中的細胞和細胞成分以及分子功能中的分子結合和催化活性比例較高。缺鐵脅迫處理1和6 h的不同鐵效率大豆品種差異表達基因富集情況一致,說明缺鐵脅迫對大豆的細胞及生理代謝過程存在一定的影響。翟麗紅[17]研究發(fā)現,在長期(12 d)缺鐵脅迫下,大豆差異表達基因顯著富集在細胞功能、分子結合、催化活性、細胞過程、代謝過程。這與本研究中短期(1和6 h)缺鐵脅迫差異基因功能注釋結果一致,說明該類功能基因在缺鐵脅迫1 h后就能對缺鐵脅迫作出響應。Lauter等[15]研究發(fā)現鐵高效大豆品種體內典型鐵吸收相關基因在缺鐵1 h后就能對缺鐵脅迫作出響應,本研究結果與之相一致。

通過差異表達基因的KEGG富集分析發(fā)現,缺鐵脅迫處理1 h,不同鐵效率大豆品種富集的差異表達基因數在苯丙烷生物合成(T1:63個,S1:36個)、倍半萜和三萜生物合成(T1:16個,S1:9個)、植物病原體相互作用(T1:111個,S1:92個)、植物MAPK信號通路(T1:60個,S1:51個)、淀粉和蔗糖代謝(T1:53個,S1:42個)等代謝通路中有顯著差異(P<0.05)。缺鐵脅迫處理6 h,不同鐵效率大豆品種富集的差異表達基因數在苯丙烷生物合成(T6:72個,S6:34個)、倍半萜和三萜生物合成(T6:10個,S6:6個)、類黃酮生物合成(T6:24個,S6:10個)、谷胱甘肽代謝(T6:21個,S6:14個)等代謝通路中有顯著差異(P<0.05)。綜上,不同鐵效率大豆品種差異表達基因富集的代謝通路中苯丙烷生物合成、倍半萜和三萜生物合成等代謝通路在1和6 h富集的差異表達基因數均存在顯著差異。說明早期缺鐵脅迫對大豆苯丙烷類和萜類等次生代謝產物的生物合成途徑有影響,且對不同鐵效率大豆品種的影響存在差異。Piotrowska-Niczyporuk等[23]研究發(fā)現植物處于鉛重金屬脅迫時,其生長發(fā)育會受到抑制,而植物體內次生代謝產物含量會有顯著變化。Waters等[10]研究發(fā)現大豆在堿性和低鐵條件下,苯丙素合成途徑中的基因會顯著上調。Schmid等[24]研究發(fā)現缺鐵條件下擬南芥中苯丙素合成途徑的基因表達會增加。本研究發(fā)現,苯丙烷生物合成途徑是富集差異基因數較多且差異最顯著的一條代謝通路,說明不同鐵效率大豆品種在響應早期缺鐵脅迫時,苯丙烷生物合成途徑存在顯著差異。

轉錄因子是植物應答非生物脅迫過程中的關鍵調控因子,研究表明植物體內某些特定的轉錄因子表達量變化能提高其適應逆境的能力[25]。當植物鐵供應不足或過量時,植物中的轉錄因子能誘導或抑制許多鐵穩(wěn)態(tài)相關基因的表達。對差異表達基因進行轉錄因子分析,結果表明鐵高效大豆品種受早期缺鐵脅迫調控的轉錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、C2H2、MYB、WRKY、bHLH、NAC等,鐵低效大豆品種的轉錄因子家族主要有AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、bHLH、NAC等。Li 等[26]通過對轉基因大豆過表達轉錄因子GmbHLH57和GmbHLH300的研究發(fā)現,2個轉錄因子的過表達上調了下游Fe攝取基因,增加了轉基因植物中的鐵含量;與野生型相比,這些雙過表達的轉基因植物對缺鐵脅迫的耐受性更強,并發(fā)現這 2種轉錄因子在根和結節(jié)中表達,并由鐵缺乏誘導。Yuan等[27]研究發(fā)現bHLH38蛋白與FIT蛋白相互作用來控制擬南芥中大部分鐵攝取反應。bHLH38/39/100/101與 FIT同屬于bHLHIb亞家族,bHLH38、bHLH39 在葉和根中都表達,且都被缺鐵強烈誘導[28]。Zhang等[29]研究發(fā)現bHLH104和bHLH105通過直接激活bHLH38/39/100/101和PYE的轉錄,正向調控Fe穩(wěn)態(tài)。Stein等[30]發(fā)現MYB72基因因擬南芥根部缺鐵而上調。Scully等[31]研究發(fā)現擬南芥MYB58和MYB63以及高粱MYB60轉錄因子過表達導致擬南芥和高粱的苯丙烷途徑的表達和木質素的合成增加。Waters等[10]研究發(fā)現大豆中有些MYB轉錄因子在缺鐵或堿性脅迫下上調,并與苯丙烷類合成基因上調一致。本研究發(fā)現缺鐵脅迫處理1 h的不同鐵效率大豆品種的轉錄因子數量在AP2/ERF-ERF(T1:38個,S1:26個)、C2H2(T1:27個,S1:15個)、bHLH(T1:23個,S1:14個)等轉錄因子家族中存在顯著差異,缺鐵脅迫處理6 h的不同鐵效率大豆品種的轉錄因子數量在WRKY(T6:20個,S6:9個)、C2H2(T6:12個,S6:5個)、bHLH(T6:25個,S6:18個)等轉錄因子家族中存在顯著差異。說明在缺鐵脅迫下,不同鐵效率大豆品種對轉錄因子表達的調控存在顯著差異。

本研究利用轉錄組測序技術分析了不同鐵效率大豆品種根系響應早期缺鐵脅迫的差異表達基因,通過GO功能注釋、KEGG代謝通路富集分析、轉錄因子分析,發(fā)現缺鐵脅迫1 h后大豆就能對缺鐵脅迫作出響應,且不同鐵效率大豆品種在苯丙烷生物合成、轉錄因子調控等相關基因的表達存在顯著差異。