孫美杰,姜君,徐詣軒,李志鵬,申軍士,朱偉云

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心/江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/動(dòng)物科技學(xué)院消化道微生物研究室,江蘇 南京 210095)

近年來(lái),隨著我國(guó)牛、羊等反芻動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,對(duì)蛋白質(zhì)等飼料原料的需求日益增大。但我國(guó)大豆等蛋白質(zhì)資源緊缺,進(jìn)口量大且依賴(lài)度高,已成為制約我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展主要瓶頸之一。瘤胃作為反芻動(dòng)物特有的消化器官,其不僅可以消化粗纖維,還可以利用非蛋白氮(NPN)合成微生物蛋白,借助這一特性,在反芻動(dòng)物日糧中補(bǔ)充N(xiāo)PN,可以有效緩解我國(guó)蛋白質(zhì)飼料緊缺的問(wèn)題。尿素作為一種性?xún)r(jià)比高的NPN,在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中已被廣泛使用。前人研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加尿素可提高水牛[1]、肉牛[2]和駱駝[3]等動(dòng)物的采食量、養(yǎng)分消化率和生長(zhǎng)性能。但Wang等[4]在綿羊上研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)日糧中尿素添加量達(dá)25 g·kg-1時(shí),動(dòng)物干物質(zhì)采食量(DMI)和平均日增重(ADG)均降低。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),在低蛋白日糧基礎(chǔ)上,育肥湖羊DMI和ADG隨尿素添加量的增加(10、20、30 g·kg-1)呈二次曲線變化,其中以10 g·kg-1日糧組最高,但30 g·kg-1日糧組的DMI和ADG并未顯著降低[5]。造成上述結(jié)果不一致的原因可能與試驗(yàn)所選的動(dòng)物種類(lèi)和尿素添加水平有關(guān)。日糧的改變會(huì)直接影響瘤胃內(nèi)環(huán)境和微生物的結(jié)構(gòu)和組成[6]。目前,關(guān)于不同尿素添加水平對(duì)反芻動(dòng)物瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)影響已有研究,前人在肉牛(n=4～6)[7]、牦牛(n=3)[8]和綿羊(n=6)[9]等反芻動(dòng)物上的研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加不同水平尿素會(huì)在一定程度上影響瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)。反芻動(dòng)物個(gè)體間瘤胃微生物結(jié)構(gòu)存在的差異較大,3～6個(gè)重復(fù)數(shù)可能很難反映出不同日糧處理的有效差異。因此,針對(duì)上述問(wèn)題,本研究擬在前期湖羊飼養(yǎng)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)口腔胃管大規(guī)模采集飼養(yǎng)試驗(yàn)動(dòng)物的瘤胃內(nèi)容物,以探究不同尿素添加水平對(duì)育肥湖羊瘤胃發(fā)酵及微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響,為實(shí)際生產(chǎn)中合理使用尿素提供更多的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物管理

將70只體重相近(23.6～26.0 kg)、健康的3～4月齡公湖羊,按照隨機(jī)區(qū)組、同欄大小相近的原則,根據(jù)體重分為2個(gè)區(qū)組(低體重區(qū)組,40只;高體重區(qū)組,30只),共計(jì)35欄,每欄飼養(yǎng)2只羊。然后隨機(jī)分為5個(gè)處理,每個(gè)處理7欄(低體重區(qū)組4欄、高體重區(qū)組3欄),分別飼喂以下5種日糧:正常豆粕(SBM)組(170 g·kg-1SBM,陽(yáng)性對(duì)照),低豆粕(40 g·kg-1)日糧基礎(chǔ)上分別添加0 g·kg-1尿素(U0組,陰性對(duì)照)、10 g·kg-1尿素(U10組)、20 g·kg-1尿素(U20組)和30 g·kg-1尿素(U30組)。各組日糧能量水平相近,但粗蛋白(CP)水平不同,其中SBM組(CP=17.6%)和U20組(CP=17.3%)粗蛋白水平相近,滿足育肥肉羊蛋白需求《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn):NY/T 816—2004》,而U0組(CP=11.6%)和U10組(CP=14.5%)低于育肥肉羊蛋白需求,U30組(CP=20.1%)高于育肥肉羊蛋白需求。具體日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平與前期飼養(yǎng)試驗(yàn)一致[5]。預(yù)飼期SBM組、U10組、U20組和U30組在U0組日糧的基礎(chǔ)上,分4個(gè)階段逐步過(guò)渡為試驗(yàn)日糧,每階段2 d。正試期每天飼喂全混合日糧(精粗質(zhì)量比為55∶45),自由采食和飲水。試驗(yàn)預(yù)飼期1周,正試期8周。

1.2 樣品的采集

試驗(yàn)第8周最后一天,對(duì)每組的14頭湖羊在晨飼后3～5 h用瘤胃導(dǎo)管經(jīng)口腔抽取瘤胃液。為減少唾液污染,舍棄前80 mL瘤胃液。將采集的瘤胃液一部分分裝用于微生物DNA提取,其余部分經(jīng)4層紗布過(guò)濾后,立即用pH計(jì)(Ecoscan pH 5,新加坡)測(cè)定pH值,然后進(jìn)行分裝,保存于-20 ℃冰箱,用于后續(xù)發(fā)酵指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 瘤胃液發(fā)酵參數(shù)的測(cè)定

瘤胃液樣品經(jīng)流水解凍后,參照Chaney等[10]的方法,以氯化銨為標(biāo)準(zhǔn)品,用比色法測(cè)定NH3-N的濃度。參照秦為琳[11]的方法進(jìn)行揮發(fā)性脂肪酸(VFA)測(cè)定,樣品經(jīng)12 000 r·min-1離心5 min,上清液經(jīng)0.22 μm針式濾器過(guò)濾后,使用氣相色譜儀(Agilent 7980A,美國(guó))測(cè)定。具體測(cè)定條件:柱箱溫度 110 ℃,進(jìn)樣口溫度220 ℃,檢測(cè)器溫度220 ℃,分流比30∶1,載氣為氮?dú)狻?/p>

1.4 瘤胃微生物菌群定量及細(xì)菌多樣性分析

1.4.1 DNA的提取瘤胃液樣品經(jīng)流水解凍,參照Z(yǔ)oetendal等[12]的方法加入1 mL 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)混勻并轉(zhuǎn)移至鋯珠管中,經(jīng)Bead-beating和DNA提取液處理后,提取瘤胃液微生物DNA。使用Nano-Drop 2000c分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))檢測(cè)所提樣品DNA的濃度,確保D260/D280值在1.8～2.0,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 Real-time PCR菌群定量參照申軍士等[13]的方法構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系(2 μL DNA模板、10 μL SYBR GREEN、0.4 μL ROX、0.4 μL引物R、0.4 μL引物F、6.8 μL雙蒸水),使用ABI7500 Real-time PCR儀對(duì)瘤胃液樣品中的總菌[14]、真菌[14]、原蟲(chóng)[15]和甲烷菌[16]進(jìn)行熒光定量PCR分析。分別以總菌的16S rRNA、真菌和原蟲(chóng)的18S rRNA及甲烷菌的甲基輔酶M還原酶(mcrA)基因構(gòu)建質(zhì)粒并以此作為模板制作各目標(biāo)菌定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 瘤胃細(xì)菌MiSeq高通量測(cè)序與分析選取細(xì)菌16S rDNA的V3—V4可變區(qū)域?yàn)槟康钠?對(duì)瘤胃液微生物DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中引入不同樣本的接頭(8 bp堿基序列)和測(cè)序引物對(duì)(5′-ACTCCTRCGGGAGGCAGCAG-3′/5′-GGACTACCVGGGTATCTAAT-3′)。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系,包括:4 μL 5×FastPfu Buffer,2 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1),0.4 μL FastPfu聚合酶(北京全式金生物技術(shù)有限公司),上游和下游引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL,總DNA模板10 ng,補(bǔ)ddH2O至 20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,重復(fù)27個(gè)循環(huán);72 ℃ 20 min。擴(kuò)增完成后,采用 20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,切膠并采用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences,美國(guó))進(jìn)行回收,使用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè),按照測(cè)序要求進(jìn)行Illumian-MiSeq高通量測(cè)序。

對(duì)測(cè)序完成的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行如下處理:運(yùn)用QIIME 1.9.10軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行片段拼接和質(zhì)量過(guò)濾;使用Usearch軟件基于UCHIME算法得到有效序列,再以97%的序列相似性將有效序列聚類(lèi)成不同操作分類(lèi)單元(OTU),再將每個(gè)OTU的代表序列與Silva 16S rRNA 128數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、分類(lèi)和注釋;使用Mothur軟件對(duì)樣品進(jìn)行α多樣性分析(包括OTU數(shù)、覆蓋率、豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù))和基于Bary-Curtis距離算法進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA);使用Canoco 5.0軟件對(duì)瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬與瘤胃環(huán)境因子之間的關(guān)系作冗余分析(redundancy analysis,RDA)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)瘤胃功能菌群的實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換以提高其正態(tài)性。利用SAS 9.4軟件一般線性模型(GLM)對(duì)瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物定量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以羊?yàn)橛^察單位,分析模型以處理為固定效應(yīng),以區(qū)組、圈×區(qū)組×處理、羊(圈×區(qū)組×處理)為隨機(jī)效應(yīng)。利用SPSS 20.0軟件對(duì)瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)和細(xì)菌門(mén)、屬水平相對(duì)豐度進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)分析。采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表1可知:與U10組相比,U20和U30組瘤胃液pH值顯著升高(P<0.05),而U0和SBM(正常豆粕)組無(wú)顯著變化(P>0.05)。與SBM組相比,U20和U30組瘤胃NH3-N質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05)。隨尿素添加水平的提高,NH3-N質(zhì)量濃度顯著升高(P<0.05)。各處理組育肥湖羊瘤胃內(nèi)TVFA、乙酸、丙酸和戊酸濃度差異不顯著(P>0.05),但SBM和U10組TVFA濃度高于其他處理組。此外,SBM組丁酸、異丁酸濃度顯著高于U0和U10組(P<0.05),與U20和U30組差異不顯著。在相對(duì)濃度上,SBM組異丁酸比例較U10組顯著提高(P<0.05)。各處理組育肥湖羊瘤胃內(nèi)乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和異戊酸比例無(wú)顯著差異(P>0.05),但SBM組丁酸比例有高于其他處理組的趨勢(shì)。

表1 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃發(fā)酵特性的影響

2.2 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃功能菌群數(shù)量的影響

由圖1可知:與SBM、U10和U20組相比,U0和U30組瘤胃總菌、甲烷菌和原蟲(chóng)數(shù)量顯著降低(P<0.05),U30組真菌數(shù)量顯著降低(P<0.05),U0組真菌數(shù)量稍有降低,但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃功能菌群數(shù)量的影響

2.3 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌菌群α多樣性的影響

采用16S rRNA測(cè)序,在70個(gè)瘤胃液樣本中共得到3 395 648條優(yōu)化序列,優(yōu)化序列的平均長(zhǎng)度為418.67 bp。所有樣本共獲得5 121個(gè)OTU,覆蓋率均在98%以上。圖2展示了不同尿素添加量對(duì)育肥湖羊瘤胃菌群α多樣性的影響。如圖2所示,不同處理組間的OTU值、Chao 1指數(shù)、ACE指數(shù)及Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05),但U30組Shannon指數(shù)顯著高于U0和U10組(P<0.05),而其他各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌菌群α多樣性的影響

2.4 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌菌群β多樣性的影響

圖3展示了基于Bary-Curtis距離算法的主坐標(biāo)分析圖(principal coordinate analysis,PCoA),表2展示了基于相似性分析(analysis of similarities,ANOSIM)的不同處理間的相似性得分。PCoA結(jié)果顯示各組間明顯區(qū)分。ANOSIM顯示,SBM組與其他各組瘤胃微生物群落組成之間差異顯著(P<0.05);U0組與U20、U30組存在差異顯著(P<0.05),但與U10組差異不顯著(P>0.05);U10組與U20、U30組之間差異顯著(P<0.05),而U20與U30組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖3 育肥湖羊瘤胃食糜中細(xì)菌菌群的PCoA分析

表2 不同處理組微生物群落間(R)相似性分析(ANOSIM)

2.5 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度的影響

由圖4可知:瘤胃細(xì)菌的主要菌門(mén)有擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、螺旋菌門(mén)(Spirochaetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres)等,不同處理間細(xì)菌組成存在差異。但各處理組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為Bacteroidetes(52.4%～64.7%)和Firmicutes(21.8%～37.2%),兩者相對(duì)豐度達(dá)86.5%以上。從圖5可知:存在顯著差異的菌門(mén)中,U10組Bacteroidetes的相對(duì)豐度顯著高于其他處理組(P<0.05),Firmicutes的相對(duì)豐度與U0組差異不顯著(P>0.05),卻顯著低于SBM、U20和U30組(P<0.05)。與U0組相比,U20和U30組Actinobacteria的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

圖4 瘤胃細(xì)菌在門(mén)水平上的組成(>1%)

圖5 在門(mén)水平上受尿素添加影響顯著的細(xì)菌

2.6 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度的影響

由表3可知:各處理組的主要優(yōu)勢(shì)菌屬為Prevotella1(27.96%～42.93%)、Muribaculaceae norank(3.36%～5.13%)、Treponema2(3.63%～4.10%)、Rikenellaceae RC9 gut group(3.41%～6.18%)和Christensenellaceae R-7 group(2.52%～5.46%)。U10組Prevotella1的相對(duì)豐度顯著高于U20和U30組(P<0.05);U30組Rikenellaceae RC9 gut group、Christensenellaceae R-7 group和Ruminococcaceae NK4A214 group的相對(duì)豐度顯著高于U0和U10組(P<0.05);SBM組Lachnospiraceae NK3A20 group的相對(duì)豐度顯著高于U10組(P<0.05),但與其他組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度(>1%)的影響

2.7 瘤胃內(nèi)環(huán)境對(duì)細(xì)菌菌群組成的影響

冗余分析(redundancy analysis,RDA)展示瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度>1%)與瘤胃環(huán)境因子(pH、NH3、TVFA)間的相關(guān)關(guān)系。由圖6可知:pH值、NH3和TVFA均影響瘤胃微生物菌群組成,貢獻(xiàn)度分別為67.0%、18.3%和14.7%。其中pH值的影響程度最為顯著(P<0.01),并且Rikenellaceae RC9 gut group、Christensenellaceae R-7 group和Ruminococcaceae NK4A214 group等屬水平細(xì)菌與pH值呈正相關(guān)關(guān)系。

圖6 瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬(相對(duì)豐度大于1%)與瘤胃環(huán)境因子之間的冗余分析

3 討論

3.1 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

氨氮是瘤胃微生物合成菌體蛋白的主要氮源,其濃度高低可以直接反映瘤胃氨的產(chǎn)生與瘤胃微生物對(duì)氨利用的動(dòng)態(tài)情況。本研究發(fā)現(xiàn)U20和U30組瘤胃NH3-N濃度顯著高于SBM組。并且隨著尿素添加量的增加,各尿素處理組瘤胃NH3-N濃度也相應(yīng)顯著增加,這與Jin等[17]報(bào)道的結(jié)果相同。說(shuō)明隨著尿素添加量的升高,在瘤胃內(nèi)水解成氨的速率逐漸大于瘤胃微生物對(duì)氨的利用速率,造成氨的盈余。瘤胃pH值是反映瘤胃發(fā)酵水平的另一重要指標(biāo),其對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝和結(jié)構(gòu)組成起主導(dǎo)作用。本試驗(yàn)RDA分析結(jié)果也表明pH值顯著影響了瘤胃菌群的組成。一般來(lái)說(shuō),瘤胃pH值的正常生理范圍為6.1～6.8[18],本試驗(yàn)各組瘤胃液pH值均在正常范圍內(nèi),表明不同劑量尿素均未對(duì)瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生不良影響。但U20和U30組pH值顯著高于U0和U10組,分析可能是由尿素水解呈弱堿性所致。瘤胃內(nèi)VFA主要由微生物發(fā)酵碳水化合物而來(lái),是反芻動(dòng)物重要的能量來(lái)源。本研究發(fā)現(xiàn),各組間TVFA、乙酸、丙酸和戊酸濃度無(wú)顯著差異,這與Currier等[19]的研究結(jié)果相一致,說(shuō)明添加尿素并沒(méi)有對(duì)育肥湖羊的能量供應(yīng)產(chǎn)生影響。此外,我們還發(fā)現(xiàn)SBM組丁酸和異丁酸的濃度和比例高于尿素處理組,這可能與豆粕中支鏈氨基酸的脫氨基作用有關(guān)。以上結(jié)果表明,瘤胃內(nèi)氨氮濃度會(huì)隨尿素添加量的增加發(fā)生相應(yīng)改變并最終引起瘤胃pH值的變化,但尿素添加并未影響瘤胃內(nèi)碳水化合物的代謝。

3.2 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃功能菌群數(shù)量的影響

日糧的營(yíng)養(yǎng)組成對(duì)瘤胃微生物具有非常重要的影響。有研究表明,日糧蛋白含量和碳水化合物水平與反芻動(dòng)物瘤胃微生物的生長(zhǎng)密切相關(guān)[20]。它們提供微生物生長(zhǎng)所需的氮源和能量,當(dāng)?shù)春湍芰康墓?yīng)達(dá)到同步時(shí),會(huì)促進(jìn)瘤胃微生物快速生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中,U30組的NH3-N濃度顯著高于U10和SBM組,但功能菌群的數(shù)量卻顯著降低。分析原因可能是在各處理組能量水平基本一致的情況下,氨態(tài)氮濃度的高低可能成為影響各功能菌群的主要因素。在滿足瘤胃微生物能量供應(yīng)的前提下,U10和SBM組相較其他各組的氨氮水平更為適宜,所以瘤胃內(nèi)微生物可以最大程度利用氨氮來(lái)促進(jìn)自身的生長(zhǎng)繁殖,而U30組氨氮含量超過(guò)了瘤胃微生物的可利用能力,過(guò)量未被利用的氨反而對(duì)瘤胃微生物產(chǎn)生抑制作用。從本實(shí)驗(yàn)室前期在生產(chǎn)性能等方面的結(jié)果[5]也發(fā)現(xiàn),U10組育肥湖羊的DMI和ADG在所有處理組中表現(xiàn)最好,而尿素高劑量U30組這2個(gè)指標(biāo)反而降低,此結(jié)果進(jìn)一步印證上面觀點(diǎn)。因此,瘤胃氨濃度過(guò)低不能滿足瘤胃微生物的生長(zhǎng)需求,過(guò)高又會(huì)造成氨的浪費(fèi),不利于微生物正常功能的運(yùn)行,只有在合適的氨濃度范圍內(nèi),瘤胃微生物才可以高效利用氨合成微生物蛋白。

3.3 尿素對(duì)育肥湖羊瘤胃細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)所獲得的16S rRNA基因覆蓋瘤胃98%以上的細(xì)菌群落,說(shuō)明測(cè)序結(jié)果基本可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況。本研究發(fā)現(xiàn),添加不同水平尿素均沒(méi)有對(duì)瘤胃菌群豐富度產(chǎn)生顯著影響,但是多樣性存在差異,U30組Shannon指數(shù)要顯著高于U0組和U10組。此外,ANOSIM分析結(jié)果顯示,各組瘤胃微生物群落組成之間存在差異。以上結(jié)果說(shuō)明,在育肥湖羊日糧中添加尿素會(huì)影響瘤胃細(xì)菌的多樣性,但并未改變其豐富度。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在門(mén)水平上,各處理組瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為Bacteroidetes和Firmicutes,這與已有的研究結(jié)果基本一致[7,17,21]。Bacteroidetes是一類(lèi)革蘭氏陰性菌,主要功能是參與含氮類(lèi)物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、氨基酸和尿素等)和非纖維類(lèi)碳水化合物(如淀粉)的降解。Firmicutes的優(yōu)勢(shì)菌屬主要是一些纖維分解菌,如溶纖維丁酸弧菌屬(Butyrivibriofibrisolvens)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)和Ruminococcaceae等,它們共同參與降解飼料中的纖維物質(zhì)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),U10組Bacteroidetes相較于其他各組相對(duì)豐度顯著升高,而Firmicutes有所降低,這可能與Bacteroidetes的生長(zhǎng)條件有關(guān),表明添加10 g·kg-1尿素可以促進(jìn)瘤胃微生物對(duì)含氮類(lèi)物質(zhì)和非纖維類(lèi)物質(zhì)的降解。非纖維物質(zhì)最終會(huì)降解為短鏈脂肪酸,本研究中U10組TVFA、乙酸和丙酸濃度高于其他處理組也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。這與Zhou等[7]的結(jié)果不完全一致,推測(cè)可能是因?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物品種和日糧配方不同從而導(dǎo)致瘤胃菌群組成存在差異。

在屬水平上,各處理組優(yōu)勢(shì)菌屬均為Prevotella1,這與Henderson等[22]、Wirth等[23]、趙佳琦等[24]報(bào)道的結(jié)果一致。Prevotella屬于Bacteroidetes,是反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)數(shù)量最多的菌屬。有研究報(bào)道,Prevotella在介導(dǎo)瘤胃中氨基酸脫氨以及蛋白質(zhì)降解等方面發(fā)揮重要作用,該屬中的棲瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)和布氏普雷沃氏菌(Prevotellabryantii)是最為常見(jiàn)的參與氮代謝的細(xì)菌[25]。Prevotella也是瘤胃內(nèi)主要的淀粉降解菌,參與降解淀粉、果糖和木聚糖等多糖[26]。在本試驗(yàn)結(jié)果中,U10組Prevotella1的相對(duì)豐度顯著高于U20和U30組。Zhou等[7]在育肥牛飼糧中添加尿素也得到了與本試驗(yàn)相似的結(jié)果。推測(cè)可能是在此尿素劑量條件下比較適宜Prevotella的生長(zhǎng),尿素水解的氨能夠更大程度地被Prevotella降解用于合成微生物蛋白,進(jìn)一步提高對(duì)飼料底物的降解并產(chǎn)生短鏈脂肪酸,U10組瘤胃TVFA濃度高于其他尿素添加組的結(jié)果也可以印證。Christensenellaceae R-7 group屬于Firmicutes,有研究發(fā)現(xiàn),它參與調(diào)節(jié)瘤胃VFA和NH3-N的代謝,維持腸道功能穩(wěn)定[27]。Ruminococcaceae主要參與氮代謝,能夠促進(jìn)氮的吸收利用,有研究表明其在盲腸中的豐度與氮利用率呈正相關(guān)關(guān)系[28-29]。Rikenellaceae參與降解可溶性多糖。本研究發(fā)現(xiàn)U30組Rikenellaceae RC9 gut group、Christensenellaceae R-7 group和Ruminococcaceae NK4A214 group的相對(duì)豐度顯著升高,且RDA結(jié)果顯示這3個(gè)菌屬與瘤胃pH值呈正相關(guān)關(guān)系,表明這 3個(gè)菌屬可以適應(yīng)高劑量尿素引起瘤胃pH升高的環(huán)境,因此這3個(gè)菌屬的生長(zhǎng)沒(méi)有受到抑制。曾鈺等[27]也發(fā)現(xiàn),Ruminococcaceae和Christensenellaceae與瘤胃pH值呈顯著正相關(guān)關(guān)系,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Lachnospiraceae屬于Firmicutes的一種,其與瘤胃內(nèi)碳水化合物的降解和VFA的產(chǎn)生密切相關(guān)[30]。Fraga等[31]研究發(fā)現(xiàn),未分類(lèi)的毛螺菌科(unclassified Lachnospiraceae)與丁酸之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)中,SBM組Lachnospiraceae NK3A20 group的相對(duì)豐度明顯高于其他處理組,同時(shí)其丁酸含量也是所有處理組最高的,說(shuō)明Lachnospiraceae確實(shí)可以在一定程度上促進(jìn)丁酸的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明,不同添加水平的尿素對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響存在差異,適宜的尿素添加水平會(huì)增加瘤胃優(yōu)勢(shì)菌屬Prevotella1的相對(duì)豐度,促進(jìn)瘤胃氮代謝及對(duì)相關(guān)代謝產(chǎn)物的吸收利用;隨著尿素劑量的升高瘤胃細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成發(fā)生改變,而部分細(xì)菌對(duì)高劑量尿素引起的瘤胃pH值升高具有正相關(guān)關(guān)系。

綜上,在低豆粕(40 g·kg-1)日糧基礎(chǔ)上添加10 g·kg-1的尿素可使育肥湖羊瘤胃內(nèi)功能菌群數(shù)量增加,促進(jìn)瘤胃內(nèi)相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與利用;而當(dāng)尿素添加量達(dá)到30 g·kg-1時(shí),會(huì)導(dǎo)致瘤胃pH值和NH3-N濃度升高,進(jìn)而降低功能菌群數(shù)量和改變瘤胃細(xì)菌的結(jié)構(gòu)組成。