李菲,戶倩,翟怡雯,陳發(fā)棣,蔣甲福

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)原產(chǎn)于我國(guó),為菊科菊屬多年生宿根草本花卉,是世界重要盆栽、切花和地被花卉,具有很高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。觀賞花卉的花期對(duì)其觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值至關(guān)重要。菊花多為短日照品種,于秋季開放。為最大限度地開發(fā)菊花的觀賞價(jià)值,滿足市場(chǎng)的周年供應(yīng),挖掘與菊花成花轉(zhuǎn)變相關(guān)的新基因?qū)﹂_展菊花的花期育種意義重大[1-2]。

蛋白質(zhì)異戊二烯化是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用,由法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶(FTase)或牻牛兒酰牻牛兒基蛋白轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和Ⅱ(GGTase-Ⅰ和GGTase-Ⅱ)催化,向蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)添加法尼基或牻牛兒酰牻牛兒基2種聚異戊二烯基團(tuán)的過(guò)程。在擬南芥中,ENHANCED RESPONSE TO ABA(ERA1,At5g40280)編碼法尼基的β亞基,ERA1基因之所以如此命名,是因?yàn)樵摶虻那贸蛔凅w在種子萌發(fā)和氣孔關(guān)閉試驗(yàn)中對(duì)脫落酸(ABA)的反應(yīng)增強(qiáng)[3-4]。在突變體era1中,ABI3的表達(dá)上調(diào),側(cè)根增多,植物的抗旱性增加[5]。有報(bào)道稱這種對(duì)ABA的超敏反應(yīng)是由于era1中油菜素甾醇(BR)合成受阻而間接引起的[6],CYP85A2(CaaX=CSPY)經(jīng)過(guò)異戊二烯化后能夠準(zhǔn)確靶向在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間隔中,從而促進(jìn)油菜素內(nèi)酯生物合成的最后一步。近期的研究表明,法尼基轉(zhuǎn)移酶能通過(guò)介導(dǎo)BRI1-EMS-SUPPRESSOR1(BES1)的表達(dá)以及BES1蛋白的降解參與BR信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),在era1突變體中BES1蛋白的積累能夠?qū)е翨R信號(hào)的增強(qiáng)[7]。

ERA1還能通過(guò)法尼基轉(zhuǎn)移酶對(duì)腺苷磷酸-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT)的修飾,參與細(xì)胞分裂素的合成。類異戊二烯細(xì)胞分裂素生物合成途徑的第一步中,AMP/ADP/ATP與二甲基烯丙基二磷酸反應(yīng)生成相應(yīng)的異戊烯基腺苷-5磷酸,隨后代謝為單磷酸鹽。腺苷磷酸酯的異戊烯化由IPT催化。在擬南芥中,IPT蛋白由7個(gè)基因家族編碼(AtIPT1和AtIPT3—AtIPT8)。其中AtIPT3含有法尼基轉(zhuǎn)移酶典型的CaaX=CLVA識(shí)別序列,表明該蛋白是蛋白法尼基轉(zhuǎn)移酶(PFT)的底物[8]。

法尼基轉(zhuǎn)移酶對(duì)BR信號(hào)通路的調(diào)控是ERA1參與開花調(diào)控的一種方式,另一種則是通過(guò)法尼基轉(zhuǎn)移酶的底物,HSP40蛋白J3實(shí)現(xiàn)的[9]。J3是連接光周期和溫度路徑的樞紐,J3在長(zhǎng)日照下受晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)被誘導(dǎo),能夠在長(zhǎng)日照條件下促進(jìn)下游基因SUPPRESSOROVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)、FLOWERINGLOCUST(FT)的表達(dá),促進(jìn)開花,同時(shí)J3能與SHORT VEGETATIVE GROWTH(SVP)互作并參與調(diào)控開花的過(guò)程[10]。擬南芥中花分生組織特征基因AP1也是法尼基轉(zhuǎn)移酶的底物,這些表明ERA1在光溫協(xié)同調(diào)控開花的過(guò)程中起到重要的作用[11]。

在擬南芥中,計(jì)算機(jī)輔助數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已經(jīng)鑒定出119種潛在的法尼基轉(zhuǎn)移酶底物蛋白,它們?cè)贒NA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),依賴GTP的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,細(xì)胞周期調(diào)節(jié),細(xì)胞壁修飾,植物花期調(diào)控與花發(fā)育等生物和非生物反應(yīng)中起著重要作用[12-14]。而在菊花中編碼法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶亞基的基因功能還未見報(bào)道。本文從菊花品種‘神馬’克隆了ERA1同源基因CmERA1,對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,分析其組織表達(dá)特異性及響應(yīng)光周期的表達(dá)變化,為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為菊花品種‘神馬’,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國(guó)菊花種質(zhì)資源保存中心提供。所用煙草為本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。

1.2 基因克隆

1.2.1 總RNA的提取及第1鏈cDNA的合成取菊花‘神馬’葉片,經(jīng)液氮速凍后手動(dòng)研磨。采用北京華越洋公司的RNA提取試劑盒提取菊花葉片總RNA后,用核酸儀檢測(cè)其濃度,經(jīng)計(jì)算后取總RNA 1 000 ng,用PrimeScriptTMRT reagent(with gDNA Eraser)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2CmERA1基因的克隆在菊花‘優(yōu)香’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào):SRP076366)中檢索法尼基轉(zhuǎn)移酶β亞基序列,以此設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物并合成。以菊花‘神馬’cDNA為模板,由Phusion高保真DNA聚合酶催化全長(zhǎng)擴(kuò)增反應(yīng)。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建和序列分析

使用NCBI的BLASTp工具篩選出18條CmERA1同源序列。用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)以及進(jìn)化分析。使用ExPASy ProtParam tool在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。使用SOPMA和Phyre 2對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 CmERA1轉(zhuǎn)錄激活活性分析

使用內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ(TaKaRa公司)構(gòu)建酵母單雜交系統(tǒng)pGBKT7-CmERA1載體。測(cè)序結(jié)果顯示正確后將質(zhì)粒pGBKT7-CmERA1、陽(yáng)性對(duì)照pCL1、陰性對(duì)照pGBKT7分別轉(zhuǎn)化酵母Y2H菌株。帶有陽(yáng)性質(zhì)粒pCL1質(zhì)粒的菌液涂布于缺陷培養(yǎng)基SD/-Leu,帶有陰性質(zhì)粒及pGBKT7-CmERA1的菌液涂布于缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp,30 ℃條件下暗培養(yǎng)3 d。將菌落轉(zhuǎn)移至包含/不包含X-α-Gal成分的SD/-Ade/-His培養(yǎng)基上,若包含pGBKT7-CmERA1質(zhì)粒的菌落與陽(yáng)性對(duì)照一樣在SD/-Ade/-His+X-α-Gal上顯藍(lán)色,則具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

1.5 CmERA1亞細(xì)胞定位

使用內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ對(duì)CmERA1ORF產(chǎn)物和pORE-R4空載體進(jìn)行雙酶切并連接,構(gòu)建帶有融合綠色熒光蛋白的GFP標(biāo)簽載體:pORE-R4-CmERA1。通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,將分別含有pORE-R4-CmERA1、P19、帶有融合紅色熒光蛋白OsD53-mCherry的菌液暗培養(yǎng)3 h后,注射葉齡為3周左右的煙草葉片。注射后煙草植株暗培養(yǎng)過(guò)夜,而后轉(zhuǎn)至光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h的培養(yǎng)室中培養(yǎng)48 h,隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察核定位信號(hào)以及綠色熒光信號(hào)。

1.6 菊花CmERA1基因的啟動(dòng)子克隆

在甘野菊的基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mum-garden.kazusa.or.jp/cgi-bin/blast.cgi,Cse_sc000677.1)查到CmERA1的啟動(dòng)子序列,使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物克隆并測(cè)序后,使用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)菊花CmERA1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.7 組織定量分析

分別取有8～10片展開葉且處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期和生殖生長(zhǎng)時(shí)期的野生型菊花‘神馬’的根、莖、葉片(從上至下第5片葉)、頂芽、舌狀花、管狀花樣本,液氮速凍并手動(dòng)研磨后提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8 長(zhǎng)日照和短日照條件下CmERA1表達(dá)模式分析定量

采集生長(zhǎng)狀況良好的野生型‘神馬’的插穗扦插于基質(zhì)中(蛭石與營(yíng)養(yǎng)土體積比3∶1),放置于光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h、溫度為22 ℃、相對(duì)濕度為65%～70%的人工氣候培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待長(zhǎng)至10片成熟葉時(shí),選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株分別移至生長(zhǎng)溫度為22 ℃的長(zhǎng)、短日照光照培養(yǎng)箱中。長(zhǎng)日照處理的光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h,短日照處理的光照/黑暗時(shí)間為8 h/16 h。預(yù)培養(yǎng)1周后,以開始光照處理為ZT(zeitgeber time)0,每隔4 h取樣1次,取樣時(shí)間持續(xù)2個(gè)生物鐘周期,即ZT48。取樣部位為從上至下第3片完全展開葉,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),液氮速凍并手動(dòng)研磨后提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。

1.9 菊花CmERA1基因的表達(dá)量測(cè)定及分析

根據(jù)測(cè)序所得CmERA1全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物,在甘野菊的基因組公共數(shù)據(jù)庫(kù)中查到CmCO的序列并設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1),以1.3和1.4節(jié)中反轉(zhuǎn)錄所得cDNA模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增以鑒定定量引物是否可用。使用Eppendorf Real Time PCR熒光定量?jī)x,以CmEF1α的擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)參,設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT的方法[15]計(jì)算。

表1 本研究所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花CmERA1基因的克隆

根據(jù)菊花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(登錄號(hào):SRP076366),克隆所得菊花中法尼基轉(zhuǎn)移酶β亞基序列,開放閱讀框?yàn)? 356 bp,共編碼451個(gè)氨基酸,命名為CmERA1(圖 1-A)。進(jìn)一步用NCBI保守結(jié)構(gòu)域工具對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè),顯示該蛋白屬于ISOPREN_C2_like超級(jí)家族成員,第14～449位氨基酸處有保守的PLN02710結(jié)構(gòu)域。使用ExPASy ProtParam tool對(duì)其氨基酸的性質(zhì)進(jìn)行分析,顯示CmERA1相對(duì)分子質(zhì)量為50.0×103,理論pI為5.12。其中亮氨酸(Leu)和絲氨酸(Ser)在全部氨基酸中比例較高,分別為10.2%和9.8%。該蛋白脂肪指數(shù)為81.29,親水性平均指數(shù)為-0.322,預(yù)測(cè)其為親水性蛋白。菊花 CmERA1與其他18個(gè)物種的ERA1蛋白進(jìn)化分析結(jié)果(圖1-B)表明,CmERA1與青蒿的蛋白親緣關(guān)系最近,其次是向日葵,而與擬南芥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),暗示法尼基轉(zhuǎn)移酶β亞基在菊科植物中進(jìn)化較為保守。

圖1 CmERA1基因的克隆(A)與不同物種中ERA1的系統(tǒng)進(jìn)化分析(B)

2.2 CmERA1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用 SOPMA網(wǎng)站對(duì) CmERA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,其蛋白主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成,比例分別為47.67%、42.67%、4.88%和4.88%(圖2)。

圖2 CmERA1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 CmERA1轉(zhuǎn)錄激活活性分析

酵母單雜交系統(tǒng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄激活活性試驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示,所有質(zhì)粒均能夠在單缺陷培養(yǎng)基SD/-Leu或SD/-Trp上生長(zhǎng)。含有陽(yáng)性對(duì)照pCL1質(zhì)粒的菌落能夠在SD/-Ade/-His缺陷培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),且在X-α-Gal+SD/-Ade/-His培養(yǎng)基中變藍(lán)。含有陰性對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7及含有質(zhì)粒pGBKT7-CmERA1的菌落無(wú)法在SD/-Ade/-His缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng),也無(wú)法在X-α-Gal+SD/-Ade/-His培養(yǎng)基中變藍(lán)(圖3)。這表明CmERA1編碼的蛋白沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖3 CmERA1轉(zhuǎn)錄激活活性分析

2.4 CmERA1亞細(xì)胞定位

在激光共聚焦顯微鏡下可見,陽(yáng)性對(duì)照定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核,CmERA1則定位于細(xì)胞核中(圖4)。

圖4 35S∷GFP-CmERA1在煙草亞細(xì)胞的定位

2.5 CmERA1啟動(dòng)子元件分析

在CmERA1啟動(dòng)子區(qū)域序列設(shè)計(jì)引物,以‘神馬’DNA為模板進(jìn)行克隆,得到CmERA1的ATG上游啟動(dòng)子序列2.0 kb(圖5)。由圖6可見:CmERA1基因啟動(dòng)子含有脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、分生組織表達(dá)元件CAT-box和典型的CAAT-box和TATA-box元件,并含有Box 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、TCT-motif等多種光響應(yīng)元件和參與光響應(yīng)的順式作用元件。

圖5 菊花CmERA1基因啟動(dòng)子的克隆

圖6 CmERA1基因啟動(dòng)子所含元件模型圖

2.6 CmERA1基因表達(dá)模式分析

2.6.1 組織特異性表達(dá)分析由圖7可見:在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期,CmERA1在不同組織中表達(dá)量由高到低依次為葉、莖、莖尖、根;在生殖生長(zhǎng)時(shí)期,在不同組織中表達(dá)量由高到低依次為根、葉、管狀花、莖、葉、舌狀花。

圖7 菊花CmERA1在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期(A)和生殖生長(zhǎng)時(shí)期(B)各組織的表達(dá)量

2.6.2 不同光周期下的表達(dá)變化以響應(yīng)晝夜節(jié)律的光周期路徑關(guān)鍵基因CmCO為對(duì)照,對(duì)CmERA1進(jìn)行節(jié)律表達(dá)模式分析。由圖8可見:CmCO在不同光周期下的表達(dá)具有明顯的節(jié)律性。在長(zhǎng)日照條件下,CmERA1對(duì)晝夜節(jié)律的響應(yīng)不明顯;在短日照條件,CmERA1在一天的開始(ZT0)以及一天的結(jié)束(ZT24)表達(dá)量達(dá)到峰值;在開始日照后第4小時(shí)(ZT4)表達(dá)量達(dá)到谷值。據(jù)此推測(cè)CmERA1可能參與光周期調(diào)控菊花開花過(guò)程。

圖8 CmERA1和CmCO在長(zhǎng)日照(LD)和短日照(SD)條件下的表達(dá)模式分析

3 討論

光周期路徑、春化路徑、溫度路徑、年齡路徑、自主路徑和赤霉素路徑是擬南芥中主要的6條開花路徑[16]。在擬南芥中,法尼基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控開花的是其推定靶標(biāo)J3(CaaX=CAQQ)介導(dǎo)的光周期路徑[9,16-18]。ERA1敲除突變體era1-2具有花期推遲、蓮座葉和花瓣數(shù)隨機(jī)增加的表型,與J3的法尼基缺陷突變體j2/j3+J3C417S的開花表型相同[9]。而J3在長(zhǎng)日照下受晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)被誘導(dǎo),促進(jìn)下游基因SOC1、FT的表達(dá)從而促進(jìn)開花[9]。菊花是短日照植物,受短日照的誘導(dǎo)而開花[19]。CONSTANS(CO)是光周期路徑的核心基因[20]。本研究表明,CmCO在菊花‘神馬’中的表達(dá)也具有明顯的節(jié)律性。以CmCO為參考,對(duì)CmERA1在不同光周期下的表達(dá)分析表明,在短日條件下CmERA1響應(yīng)晝夜節(jié)律。這與CmERA1啟動(dòng)子中具有Box 4、G-Box、GT1-motif、LAMP-element、TCT-motif等多個(gè)光響應(yīng)元件相符。這些暗示了CmERA1可能參與光周期調(diào)控菊花開花的過(guò)程。

本研究中,CmERA1的啟動(dòng)子中還包含分生組織特征元件CAT-box、響應(yīng)水楊酸的元件TCA-element和響應(yīng)ABA信號(hào)的元件ABRE。在擬南芥中,法尼基轉(zhuǎn)移酶既可以修飾IPT3(CaaX=CLVA)調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的植物發(fā)育,也可以修飾AP1(CaaX=CFAA)調(diào)節(jié)生殖生長(zhǎng)時(shí)期的花發(fā)育[8,11]。本研究組織定量分析中,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期CmERA1在莖尖的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在根中的表達(dá)量,而在生殖生長(zhǎng)時(shí)期,CmERA1在舌狀花和管狀花中的表達(dá)量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于根中的表達(dá)量,這暗示著CmERA1負(fù)調(diào)控菊花的花芽分化。

本研究從‘神馬’菊花中克隆獲得編碼法尼基轉(zhuǎn)移酶β亞基的CmERA1全長(zhǎng)序列,其與同為菊科的青蒿中的ERA1基因親緣關(guān)系最近,序列相似性高達(dá)93.53%,暗示其功能保守。CmERA1蛋白不具有轉(zhuǎn)錄激活活性,在細(xì)胞中定位于細(xì)胞核,說(shuō)明其主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。關(guān)于CmERA1基因其余功能是否像在擬南芥中一樣保守,是否能夠通過(guò)修飾J3而介導(dǎo)菊花的開花過(guò)程,還待后續(xù)的研究驗(yàn)證?？傊?本研究為研究‘神馬’菊花CmERA1基因調(diào)控開花的功能奠定了基礎(chǔ)。