易凌榮，譚波濤，劉媛，殷櫻，虞樂華*

1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400010；2陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究部，重慶 400042

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)損傷性疾患，軸突斷裂是其基本病理表現(xiàn)之一，由于成體軸突再生困難，SCI患者難以完全康復(fù)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控與生長發(fā)育相關(guān)的通路可增強成體哺乳動物軸突的內(nèi)源性再生能力[2-3]，有望成為SCI新的治療策略。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可整合神經(jīng)元活動和各種突觸輸入，調(diào)控蛋白質(zhì)合成，影響細胞的增殖和存活[4-5]。敲除磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)可有效激活A(yù)KT/mTOR通路，增強神經(jīng)元內(nèi)源性再生能力，促進CNS軸突再生[6]；敲除細胞因子信號抑制物3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)，解除其對JAK/STAT通路的抑制，可展現(xiàn)出對SCI神經(jīng)元的保護作用，并可有效增強軸突再生效應(yīng)[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，同時敲除PTEN和SOCS3可顯著促進成體小鼠視神經(jīng)損傷后的軸突再生[8]。由此推測，聯(lián)合調(diào)控AKT/mTOR和JAK/STAT信號通路能提升SCI后的軸突再生能力。本研究通過聯(lián)合抑制PTEN和SOCS3的表達，探索聯(lián)合激活mTOR和STAT通路對成體SCI小鼠軸突再生和運動功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 戊巴比妥鈉、多聚甲醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；鹽酸緩沖鹽溶液(PBS，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；AAV9-U6-PTEN-RNAi-CAG-eGFP、AAV9-U6-SOCS3-RNAi-CAG-mCherry、AAV9-U6-CNO305-CAG-eGFP對照病毒(上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司)；GFP蛋白一抗(英國Abcam公司)；mCherry蛋白一抗(美國Invitrogen公司)；p-S6蛋白一抗、p-STAT3蛋白一抗(美國CST公司)；DAPI(美國Sigma公司)；GFAP蛋白一抗、生物素化葡聚糖胺(BDA)、Alexa-594 Streptavidin(美國Thermo Fisher公司)；Alex fluor-488偶聯(lián)驢抗雞IgG(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司)；Alex fluor-488、Alex fluor-594、Alex fluor-647偶聯(lián)驢抗大鼠和兔IgG(美國Jackson Laboratories公司)。SI-7腦立體定位儀(日本Narishige公司)；CryoStarNX50HOP冷凍切片機(蘇州賽默飛世爾儀器有限公司)；A1+R激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 SPF級健康雌性C57/BL小鼠40只，6～8周齡，體重20～25 g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)特色醫(yī)學(xué)中心實驗動物中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005]。分籠飼養(yǎng)，食物和水按時攝入，規(guī)律晝夜節(jié)律。隨機分為PTEN/SOCS3組、PTEN組、SOCS3組與對照組，每組10只，并按照分組注射相對應(yīng)的病毒。本研究通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批[科倫預(yù)審第(2020)007號]，所有操作均遵守國家實驗動物飼養(yǎng)健康指南規(guī)范。

1.2.2 初級運動皮質(zhì)病毒注射 PTEN/SOCS3組注射PTEN抑制病毒和SOCS3抑制病毒，PTEN組注射PTEN抑制病毒，SOCS3組注射SOCS3抑制病毒，對照組注射陰性對照病毒。1%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.1 ml/20 g)麻醉小鼠，剃除頭部毛發(fā)，消毒后沿矢狀線切開頭部皮膚，3% H2O2去除頭部筋膜，暴露前囟，牙科鉆去除左側(cè)運動皮質(zhì)區(qū)顱骨。將小鼠和微量注射器固定在立體定位儀上，吸取2.4 μl病毒溶液，注入運動皮質(zhì)第Ⅴ層中(坐標(biāo)為前囟前面0 mm、0.5 mm，左側(cè)0.8 mm、1.2 mm，深度0.7 mm)，每只小鼠4個點，0.6 μl/點，速度0.2 μl/min，注射完成后滯針3 min，緩慢出針。所有點注射完成后，縫合頭部皮膚，消毒后保暖直至蘇醒。

1.2.3 脊髓損傷造模 病毒注射2周后，采用隨機雙盲實驗法對所有小鼠進行C5脊髓鉗夾損傷。小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，固定于手術(shù)臺上。切開頸部皮膚，鑷子鈍性分離兩側(cè)筋膜和肌肉，直至暴露頸部椎板。用咬骨鉗去除C5椎板，26號針刺破小鼠脊髓后角灰質(zhì)軟脊膜，將改良的FST DUMONT 5號手術(shù)鉗沿軟脊膜刺破部分刺入兩側(cè)背角灰質(zhì)(1 mm)，對背側(cè)皮質(zhì)脊髓束行鉗夾損傷，維持15 s，共2次。然后將改良的FST DUMONT 5號手術(shù)鉗一側(cè)尖端刺入右側(cè)脊髓背側(cè)針孔(0.8 mm)，另一側(cè)尖端留于脊髓外面，鉗夾紅核脊髓束和皮質(zhì)脊髓側(cè)束，維持15 s，共2次。手術(shù)完成后，縫合頸部肌肉和皮膚，消毒后保暖直至蘇醒[9]。

1.2.4 皮質(zhì)脊髓束順行示蹤 損傷后6周，小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，剃除頭部毛發(fā)，消毒后沿矢狀線切開頭部皮膚，吸取2.4 μl 10% BDA溶液緩慢注射至大腦運動皮質(zhì)區(qū)域，坐標(biāo)與病毒注射部位相同。每個點0.6 μl，共4個點，速度0.2 μl/min，注射完成后滯針3 min，緩慢出針。所有點注射完成后，縫合頭部皮膚，消毒后保暖直至蘇醒。

1.2.5 行為學(xué)檢測 分別于損傷前及損傷后1、2、4、6周進行行為學(xué)檢測，包括水平樓梯實驗和圓筒攀爬探索實驗。

1.2.5.1 水平樓梯實驗檢測小鼠在水平樓梯上的行走控制能力 兩塊有機玻璃板(長80 cm，寬50 cm)構(gòu)成1.3 cm寬的水平橫梯跑道，跑道末端放置動物飼養(yǎng)籠，促使動物跑過橫梯跑回飼養(yǎng)籠，攝像機記錄動物跑過25根橫梯制成的不規(guī)則跑道的情況。然后逐幀分析損傷側(cè)肢體踩空和滑落橫梯的情況，計算踏空錯誤率。踏空錯誤率(%)=錯誤步數(shù)/總步數(shù)×100%。

1.2.5.2 圓筒攀爬探索實驗檢測小鼠在直立狀態(tài)下使用上肢的偏好 將小鼠放于透明的有機玻璃圓筒(15 cm×20 cm：D×H)內(nèi)，攝像機記錄15 min內(nèi)小鼠直立狀態(tài)下使用上肢攀爬圓筒壁的偏好程度，然后分析前10次的攀爬情況。每次攀爬時小鼠直立后第1次使用上肢攀爬圓筒壁的行為存在左、右、雙側(cè)3種選擇，由此計算使用上肢的頻率。肢體使用頻率(%)=該側(cè)肢體使用次數(shù)/攀爬總次數(shù)×100%。

1.2.6 組織標(biāo)本制備 損傷后8周，小鼠全身麻醉后固定于操作臺上，行心臟灌注，顯微鏡下取腦組織和脊髓頸段組織，4 ℃下4% PFA固定24 h，18%、24%、30%蔗糖梯度脫水，包埋組織，腦組織沿冠狀面、脊髓頸段組織沿失狀面進行冷凍切片(厚度18 μm)。

1.2.7 免疫熒光染色檢測運動皮質(zhì)病毒轉(zhuǎn)染和通路激活效果 腦組織切片室溫復(fù)溫30 min至1 h；0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；0.3% Triton溶液室溫孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；吸除多余液體后，5%驢血清封閉30 min；加入一抗[GFP抗體(1∶2000)、mCherry抗體(1∶1500)、p-S6抗體(1∶100)、p-STAT3抗體(1∶100)]室溫孵育過夜；次日0.01 mol/L PBS洗滌5min×3次；加入相應(yīng)的Alex fluor-488偶聯(lián)驢抗雞(1∶200)、Alex fluor-594偶聯(lián)驢抗大鼠(1∶400)、Alex fluor-647偶聯(lián)驢抗兔(1∶400)IgG二抗，室溫孵育45 min；0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次；加入0.5 μg/ml的DAPI室溫孵育2 min；0.01 mol/L PBS洗滌5 min×3次。晾干后，甘油封片。使用共聚焦顯微鏡采集圖像，通過ImageJ軟件分析熒光強度，以檢測病毒轉(zhuǎn)染效果和通路激活情況。

1.2.8 軸突再生情況檢測 頸髓組織切片行免疫熒光染色，具體操作如1.2.7所述，使用的一抗為GFAP抗體(1∶2000)，然后加入Alex fluor-488偶聯(lián)驢抗兔IgG二抗(1∶400)和BDA顯色劑Alexa-594 Streptavidin (1∶200)。在共聚焦顯微鏡采集的圖像上沿損傷處向損傷吻側(cè)縱向疊加長為5個100 μm的矩形框，用ImageJ軟件測定每個矩形框內(nèi)BDA的總熒光強度；從損傷處開始向病灶尾側(cè)每間隔100 μm與皮質(zhì)脊髓束垂直劃線，計數(shù)橫跨垂線的軸突數(shù)量。計算吻側(cè)軸突密度指數(shù)[10](該處矩形框內(nèi)BDA總熒光強度/500 μm處矩形框內(nèi)BDA總熒光強度)和尾側(cè)軸突指數(shù)(再生軸突數(shù)量/500 μm處矩形框內(nèi)BDA總熒光強度)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，若計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以Bonferroni檢驗方法進行兩兩事后檢驗。若不符合正態(tài)分布或方差齊性，多組間比較采用非參檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元AKT/mTOR和JAK/STAT信號通路激活情況 采用免疫熒光染色檢測小鼠感覺運動皮質(zhì)區(qū)域(M1)病毒轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示，低倍鏡下該區(qū)域可觀察到明顯的病毒標(biāo)簽表達(圖1)；高倍鏡下進一步觀察顯示，PTEN/SOCS3組神經(jīng)元成功轉(zhuǎn)染AAV9-PTEN-RNAi病毒(GFP)和AAV9-SOCS3-RNAi病毒(mCherry)(圖2A、圖3A)，表明病毒被注射到相應(yīng)腦區(qū)并成功向周圍擴散轉(zhuǎn)染錐體神經(jīng)元。免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，PTEN/SOCS3組和PTEN組皮質(zhì)神經(jīng)元p-S6表達明顯增加，其熒光強度[分別為(25.429±2.991) AU、(26.171±2.140) AU]明顯高于SOCS3組和對照組[分別為(9.544±2.474) AU、(9.558±1.650) AU]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖2B)；PTEN/SOCS3組和SOCS3組p-STAT3表達增加，其熒光強度[分別為(48.900±6.310) AU、(46.721±5.169) AU]明顯高于PTEN組和對照組[分別為(12.952±1.282) AU、(14.394±1.983) AU]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖3B)。

圖1 脊髓損傷小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元病毒轉(zhuǎn)染情況Fig.1 Virus transfection effects in injured cortex neurons of mice with spinal cord injury

圖2 脊髓損傷小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元p-S6免疫熒光染色結(jié)果(n=10)Fig.2 p-S6 immunofluorescence staining results in injured cortex neurons of mice with spinal cord injury in each group (n=10)

圖3 脊髓損傷小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元p-STAT3免疫熒光染色結(jié)果(n=10)Fig.3 p-STAT3 immunofluorescence staining results in injured cortex neurons of mice with spinal cord injury in each group (n=10)

2.2 各組小鼠脊髓組織軸突再生情況 采用免疫熒光染色檢測皮質(zhì)脊髓束軸突再生情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，各干預(yù)組中損傷軸突均出現(xiàn)再生，再生軸突越過損傷位置并向遠端延伸，其中PTEN/SOCS3組再生軸突數(shù)量最多、距離最遠(圖4A)。在損傷吻側(cè)100 μm處，與對照組(0.330±0.025)相比，PTEN/SOCS3組(0.506±0.042)、PTEN組(0.471±0.054)和SOCS3組(0.508±0.042)軸突存活較多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0 0 1，圖4 B)。在損傷尾側(cè)，P T E N/SO CS 3 組可觀察到長約5 5 0 μ m 的軸突再生，而P T E N 組和S O C S 3 組再生軸突多在0～2 0 0 μ m 范圍內(nèi)。對再生軸突的數(shù)量進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，在損傷處和1 0 0 μ m 處，PTEN/SOCS3組(0.038±0.014、0.097±0.031)、PTEN組(0.024±0.011、0.057±0.025)和SOCS3組(0.029±0.014、0.057±0.020)的軸突指數(shù)高于對照組(0.003±0.002、0.008±0.007)(P＜0.05)，其中在100 μm處PTEN/SOCS3組的軸突指數(shù)高于PTEN組和SOCS3組(P＜0.05)；在200、300、400和500 μm處，PTEN/SOCS3組的軸突指數(shù)明顯高于其他3組(PTEN/SOCS3組vs. PTEN組、SOCS3組和對照組，200 μm處：0.082±0.043vs.0.042±0.026、0.038±0.015、0.005±0.007；300 μm處：0.041±0.034vs. 0.006±0.004、0.010±0.006、0.0 0 2±0.0 0 3；4 0 0 μ m 處：0.0 2 6±0.0 2 4vs.0.000±0.000、0.000±0.000、0.000±0.000；500 μm處：0.015±0.016vs. 0.000±0.000、0.000±0.000、0.000±0.000)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4C)。

圖4 脊髓損傷小鼠皮質(zhì)脊髓束再生情況(n=10)Fig.4 Axon regeneration of corticospinal tract of SCI mice in each group (n=10)

2.3 增強內(nèi)源性再生能力對小鼠上肢運動功能恢復(fù)的影響 損傷前各組小鼠在水平樓梯和圓筒攀爬探索中的運動表現(xiàn)無明顯差異(P＞0.05)。損傷后，小鼠經(jīng)過水平樓梯時右側(cè)肢體的踏空錯誤率升高(P＜0.01)，隨后逐漸恢復(fù)(P＜0.05，表1)。圓筒攀爬探索實驗顯示，小鼠在SCI后1周使用右側(cè)攀爬筒壁的頻率明顯低于損傷前(P＜0.01)，之后逐漸增加，但損傷后各時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表2)。各個時間點小鼠在水平樓梯和圓筒攀爬探索中的運動表現(xiàn)組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，表1－2)。

表1 不同時間點脊髓損傷小鼠水平樓梯實驗右前肢踏空錯誤率比較(%, ±s, n=10)Tab.1 Comparison of right forelimb error rate in the horizontal ladder tests of SCI mice at various time points (%, ±s, n=10)

表1 不同時間點脊髓損傷小鼠水平樓梯實驗右前肢踏空錯誤率比較(%, ±s, n=10)Tab.1 Comparison of right forelimb error rate in the horizontal ladder tests of SCI mice at various time points (%, ±s, n=10)

SCI. 脊髓損傷；與損傷前比較，(1)P＜0.01；與損傷后1周比較，(2)P＜0.01，(3)P＜0.05

組別損傷前損傷后1周損傷后2周損傷后4周損傷后6周對照組4.3±2.930.3±6.5(1)26.6±4.5(1)19.2±7.3(1)(2)23.4±4.3(1)SOCS3組3.6±2.434.5±8.7(1)21.4±3.4(1)(2)21.2±7.4(1)(2)17.3±4.4(1)(2)PTEN組3.2±3.331.9±8.4(1)23.8±4.0(1)(3)16.7±7.0(1)(2)20.7±5.8(1)(2)PTEN/SOCS3組3.7±2.432.6±7.9(1)24.1±4.4(1)(2)18.9±4.8(1)(2)19.1±5.3(1)(2)F 0.2360.4832.6490.7670.175 P 0.8700.6960.0640.5200.913

表2 不同時間點脊髓損傷小鼠圓筒攀爬探索實驗右前肢使用率比較(%, ±s, n=10)Tab.2 Comparison of right forelimb usage rate in the rearing tests of SCI mice at various time points (%, ±s, n=10)

表2 不同時間點脊髓損傷小鼠圓筒攀爬探索實驗右前肢使用率比較(%, ±s, n=10)Tab.2 Comparison of right forelimb usage rate in the rearing tests of SCI mice at various time points (%, ±s, n=10)

SCI. 脊髓損傷；與損傷前比較，(1)P＜0.01，(2)P＜0.05

組別損傷前損傷后1周損傷后2周損傷后4周損傷后6周對照組23.0±8.22.0±4.2(1)4.0±7.0(1)10.0±8.2(1)8.0±9.1(1)SOCS3組24.0±7.03.0±4.3(1)6.7±7.1(1)13.0±11.69.0±11.0(1)PTEN組19.0±9.93.0±4.8(1)7.0±6.7(2)12.0±11.49.0±9.9 PTEN/SOCS3組21.0±9.94.0±7.0(1)6.0±5.2(1)10.0±9.411.0±9.9 F 0.9470.0680.1700.0801.038 P 0.4280.9770.9160.9710.387

3 討 論

本研究結(jié)果表明，siRNA干擾能有效提高抑制干預(yù)組小鼠皮質(zhì)錐體神經(jīng)元p-S6及p-STAT3的表達水平，明確了使用siRNA干擾這種非轉(zhuǎn)基因技術(shù)能成功在體內(nèi)抑制PTEN和SOCS3，同時有效激活皮質(zhì)錐體神經(jīng)元的AKT/mTOR和JAK/STAT信號通路；聯(lián)合激活A(yù)KT/mTOR和JAK/STAT通路對于成體脊髓損傷小鼠具有良好的軸突再生促進效應(yīng)，但水平樓梯實驗和圓筒攀爬探索實驗并未顯示軸突再生能力增強為動物帶來更好的早期肢體功能恢復(fù)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，條件性敲除神經(jīng)元PTEN基因、激活mTOR通路可有效促進損傷的神經(jīng)軸突發(fā)芽和再生，增高神經(jīng)細胞存活率[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，使用siRNA抑制PTEN的表達可有效促進成體小鼠皮質(zhì)脊髓束的軸突再生和病灶吻側(cè)損傷軸突側(cè)枝發(fā)芽[13]。因此，調(diào)控mTOR通路是激活內(nèi)源性軸突再生能力的重要方式。由于軸突完全修復(fù)需要長距離再生，而既往研究中軸突再生較少超過2 mm，提示單獨調(diào)控軸突mTOR尚不能滿足臨床需求。JAK/STAT途徑是另一條調(diào)控軸突再生的通路，具有保護神經(jīng)元和促進軸突再生的雙重作用[14]。PTEN和SOCS3雙缺失增加了蛋白質(zhì)翻譯與基因轉(zhuǎn)錄之間的協(xié)調(diào)性，可誘導(dǎo)再生啟動程序高效且持久地激活，協(xié)同促進中樞神經(jīng)再生[15]。以視神經(jīng)損傷為例，Sun等[8]證實，雙敲除PTEN和SOCS3可實現(xiàn)視神經(jīng)強大而持續(xù)的軸突再生，使再生軸突數(shù)量增加10倍以上，且超過20%的再生軸突到達視交叉附近。另有研究發(fā)現(xiàn)，在單側(cè)脊髓損傷的轉(zhuǎn)基因小鼠中，雙敲除健側(cè)神經(jīng)元的PTEN和SOCS3可增加未受傷皮質(zhì)脊髓束軸突的內(nèi)源性生長能力，其發(fā)芽反應(yīng)明顯強于SOCS3單獨缺失，且?guī)缀醯竭_了整個皮質(zhì)脊髓束區(qū)域，支配失神經(jīng)支配的靶細胞，改善行為學(xué)表現(xiàn)[16]。因此，本研究采用聯(lián)合激活A(yù)KT/mTOR和JAK/STAT通路的方式治療脊髓損傷，結(jié)果顯示聯(lián)合激活促進軸突再生的效果明顯優(yōu)于單一通路激活；免疫熒光染色結(jié)果表明，損傷的皮質(zhì)脊髓束軸突再生的數(shù)量最多、距離最遠，與前期報道一致。因此，聯(lián)合激活A(yù)KT/mTOR和JAK/STAT通路對脊髓損傷后的軸突再生治療具有重要意義。

既往針對PTEN和SOCS3的再生研究大多使用轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對象，使其臨床轉(zhuǎn)化受到了極大限制。本研究選用siRNA技術(shù)持續(xù)調(diào)控PTEN和SOCS3的表達，發(fā)現(xiàn)可有效激活目標(biāo)通路，獲得刺激軸突再生的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合激活可誘導(dǎo)長約550 μm的再生軸突，這與既往采用轉(zhuǎn)基因小鼠的再生研究結(jié)果具有一定距離[17]，考慮可能與siRNA技術(shù)對目的基因的抑制效率不如轉(zhuǎn)基因技術(shù)有關(guān)[18]。另外，本研究觀察時長為6周，較其他發(fā)現(xiàn)長距離軸突再生的研究觀測時間(超過8周)短。作為細胞增殖和生長的調(diào)控基因，PTEN和SOCS3被永久性敲除潛在增加了腫瘤、癲等疾病的發(fā)生風(fēng)險，后續(xù)研究應(yīng)注意優(yōu)化干預(yù)策略，采用更加高效、可控的方式激活相關(guān)通路。

皮質(zhì)脊髓束是控制精細運動的主要神經(jīng)束[19]。本研究采用水平樓梯和圓筒攀爬探索實驗評估動物損傷早期(6周)對損傷側(cè)肢體的使用意愿及控制能力，以探討提升內(nèi)源性再生能力可否促進功能恢復(fù)。結(jié)果顯示，再生能力的提高不能促進損傷早期運動功能的恢復(fù)，分析原因可能與以下因素有關(guān)：(1)再生皮質(zhì)脊髓束軸突距離不夠長，沒有延伸到目標(biāo)神經(jīng)元所在位置[20]。(2)再生的軸突并不沿其原始的投射軌跡延伸，而是雜亂無章地向損傷尾側(cè)生長。視神經(jīng)損傷模型中，約有35%的軸突在視交叉處錯誤投射，無法正確找到目標(biāo)神經(jīng)元，導(dǎo)致功能再生失敗[21]。(3)模型動物缺乏康復(fù)訓(xùn)練。康復(fù)訓(xùn)練是引導(dǎo)再生軸突與靶標(biāo)神經(jīng)元之間重新形成突觸連接的有效措施[22]。(4)再生軸突的髓鞘缺失。Bei等[23]發(fā)現(xiàn)，再生的軸突普遍缺乏髓鞘包裹，導(dǎo)致無法有效傳導(dǎo)動作電位，可能是長距離的視神經(jīng)再生無法誘導(dǎo)動物視覺的原因[24-25]。最近研究發(fā)現(xiàn)，脫髓鞘軸突的再髓鞘化是脊髓損傷功能恢復(fù)的重要環(huán)節(jié)[26]。后續(xù)研究需要綜合考慮軸突再生、髓鞘修復(fù)、康復(fù)鍛煉之間的相互關(guān)系，探索最佳的促進軸突再生和功能恢復(fù)的策略。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，聯(lián)合激活A(yù)KT/mTOR和JAK/STAT信號通路能提高神經(jīng)元內(nèi)源性再生能力，有效地促進成體嚙齒動物的皮質(zhì)脊髓束再生，值得進一步探索。