姜玉秋,唐橋斐,閆智永,張爽
變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是個(gè)體受到過(guò)敏原刺激后,由IgE 介導(dǎo)的炎性疾病。在過(guò)去的十年中,我國(guó)鼻炎的發(fā)病率從11%升高至17%[1]。盡管鼻炎不是嚴(yán)重的疾病,但卻是多種疾病的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量和工作效率[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)是長(zhǎng)度>200 個(gè)堿基的不編碼蛋白質(zhì)的RNA。研究表明LncRNA PVT1 參與多種炎性疾病進(jìn)展[3]。LncRNA PVT1在過(guò)敏性哮喘時(shí)表達(dá)量增高,可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)下游miRNA的表達(dá)加劇哮喘期間的炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞屏障損傷,進(jìn)而加速哮喘進(jìn)展[4-5],推測(cè)其可能與AR 發(fā)展也密切相關(guān)。MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼的小RNA,其結(jié)合至mRNA 的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。課題組前期研究已經(jīng)證實(shí),miR-149-5p 在AR小鼠鼻黏膜組織中表達(dá)減少,并通過(guò)靶向Notch1調(diào)控下游蛋白Foxp3和RORγt表達(dá),影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)∕輔助性T細(xì)胞17(Th17)平衡,從而改善AR小鼠鼻部過(guò)敏癥狀[7]。幾丁質(zhì)酶-3 樣蛋白1(CHI3L1)屬于糖苷水解酶18 家族蛋白,與哮喘、關(guān)節(jié)炎、鼻炎等疾病密切相關(guān)[8-11]。在嗜酸性粒細(xì)胞型鼻竇炎中CHI3L1 的表達(dá)量升高,抗炎分子Clara細(xì)胞10 ku 蛋白(CC10)可通過(guò)降低CHI3L1 的表達(dá)達(dá)到抑制炎癥的作用,提示CHI3L1可作為嗜酸性粒細(xì)胞型鼻竇炎的新型分子標(biāo)志[9]。本研究旨在探究LncRNA PVT1 作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-149-5p而上調(diào)靶基因CHI3L1在AR中的作用。
1.1 材料 5 周齡SPF 級(jí)BALB∕c 小鼠24 只,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[合格證號(hào):SCXK(遼)2020-0001],于18~22 ℃、50%~60%濕度的環(huán)境中飼養(yǎng),自由飲食和飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。人源性胚胎腎細(xì)胞株293T 購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。蘇木精、SYBR Green(Solarbio,中國(guó)),曙紅Y、miRNA 第一鏈cDNA 合成(加尾法)試劑盒(Sangon,中國(guó)),TRIpure(BioTeke,中國(guó)),BeyoRT ⅡM-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(碧云天,中國(guó)),全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、ECL發(fā)光液、二抗羊抗兔IgG-HRP均購(gòu)自中國(guó)萬(wàn)類(lèi)生物,CHI3L1抗體(Abclonal,中國(guó))、PVDF 膜(Millipore,美國(guó))、脫脂奶粉(伊利,中國(guó)),小鼠IgE、白細(xì)胞介素(IL)-5、腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒(中國(guó)聯(lián)科),熒光素酶檢測(cè)試劑盒(凱基,中國(guó)),慢病毒載體pLVXshRNA1(豐暉生物,中國(guó)),氫氧化鋁、卵白蛋白(OVA)購(gòu)自阿拉?。ㄖ袊?guó)),LncRNA PVT1 沉默序列、引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 造模及分組 24 只BALB∕c 小鼠,采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取6只作為對(duì)照組(不造模),余18只小鼠建立AR模型,采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為模型組、空載體對(duì)照(AR+NC)組、LncRNA PVT1 沉默(AR+shPVT1)組,每組6 只。模型建立:在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1、7、14 天腹腔注射500 μL 含有10 μg OVA和1 mg 氫氧化鋁的PBS 溶液(作為基礎(chǔ)致敏);從第21~27天每天給予建模小鼠鼻飼20μL 含有500μg OVA 的PBS 溶液(激發(fā)致敏)。在實(shí)驗(yàn)第22、24、26 天時(shí),于OVA 激發(fā)前2 h 向AR+NC 組小鼠尾靜脈注射空載體慢病毒(109TU∕mL,100μL∕次)[12],向AR+shPVT1組小鼠尾靜脈注射同等劑量的LncRNA PVT1干擾載體慢病毒,向模型組小鼠尾靜脈注射等體 積 的 PBS 溶 液。 LncRNA PVT1 沉 默 序 列 5'-CCCGGATGAAGAGAAGCTACGAACTTCAAGAGAGTTCGTA GCTTCTCTTCATCCTTTTT-3'。對(duì)照組小鼠給予等體積的PBS溶液。
1.2.2 行為學(xué)評(píng)分 于末次致敏20 min后,觀察并記錄各組小鼠流涕、鼻癢狀況和打噴嚏次數(shù)。流涕評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):流至前鼻孔計(jì)1分,超出前鼻孔計(jì)2分,涕流滿(mǎn)面計(jì)3分。鼻癢評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):輕搔鼻1~2次計(jì)1分,介于輕搔鼻和劇烈抓撓鼻面不止之間計(jì)2 分,劇烈抓撓鼻面不止計(jì)3 分。噴嚏評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):1~3個(gè)計(jì)1 分、4~10 個(gè)計(jì)2 分,11 個(gè)以上計(jì)3 分,以上3 項(xiàng)指標(biāo)合計(jì)為總分,總分范圍1~9分,超過(guò)5分說(shuō)明造模成功[13]。
1.2.3 HE染色觀察鼻黏膜組織形態(tài) 小鼠鼻黏膜組織采用4%多聚甲醛溶液固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后制作切片,切片脫蠟至水后進(jìn)行HE染色,切片脫水透明處理后中性樹(shù)膠封片;于光學(xué)顯微鏡下觀察鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)變化。
1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p 及CHI3L1 mRNA 表達(dá) 于慢病毒注射48 h 后腹腔注射過(guò)量的戊巴比妥鈉(150 mg∕kg)處死小鼠。取各組小鼠的鼻黏膜組織,提取總RNA,檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用SYBR Green 染料法進(jìn)行Real time PCR。反應(yīng)條件:94 ℃5 min;94 ℃10 s,60 ℃20 s,72 ℃10 s,40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)結(jié)果的Ct 值采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算LncRNA PVT1、miR-149-5p 及CHI3L1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。qPCR引物序列見(jiàn)表1。
Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列
1.2.5 Western blot檢測(cè)鼻黏膜組織中CHI3L1蛋白表達(dá) 取鼻黏膜組織,加入RIPA裂解液冰上靜置5 min,4 ℃,12 000 r∕min,離心10 min,抽取上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),PVDF 膜轉(zhuǎn)印,5%脫脂奶粉封閉1 h,一抗(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜后加入二抗(1∶5 000),37 ℃孵育45 min,洗膜后均勻撒上ECL化學(xué)發(fā)光液靜置5 min,轉(zhuǎn)入暗盒中,暗室進(jìn)行曝光。將膠片進(jìn)行掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer 軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度(OD)值,計(jì)算CHI3L1 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
1.2.6 ELISA 檢測(cè)血清中IgE、IL-5、TNF-α 的水平 于慢病毒注射后48 h 取各組小鼠眼眶靜脈血1 mL,分離管分離血清,按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,檢測(cè)各組小鼠血清中IgE、IL-5、TNF-α的水平,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo),校準(zhǔn)后的OD值為橫坐標(biāo),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出IgE、IL-5、TNF-α的水平。
1.2.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1 的靶向調(diào)控關(guān)系 根據(jù)文獻(xiàn)[14]及預(yù)測(cè)軟件RNAhybrid(https:∕∕bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de∕rnahybrid∕)的結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建LncRNA PVT1 野生型(WT)和突變型(MT)熒光素酶報(bào)告載體,分別與miR-149-5p mimic 或NC mimic共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組如下:LncRNA PVT1-WT+NC mimic 組、LncRNA PVT1-WT+miR-149-5p mimic 組、LncRNA PVT1-MT+NC mimic 組、LncRNA PVT1-MT+miR-149-5p mimic 組。分別構(gòu)建CHI3L1野生型和突變型熒光素酶報(bào)告載體,與miR-149-5p mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,此外在上述共轉(zhuǎn)染細(xì)胞組額外增加LncRNA PVT1-WT 或LncRNA PVT1-MT 熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組如下:miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT 組、miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR MT 組、miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1 WT 組、miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1 MT 組。上述各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后,收集細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液,按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作分別加入各檢測(cè)試劑,使用酶標(biāo)儀讀取各組細(xì)胞海腎和螢火蟲(chóng)熒光強(qiáng)度,以海腎熒光值作為內(nèi)參,計(jì)算各組細(xì)胞熒光素酶活性的比值。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,所有檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在相同條件下獨(dú)立重復(fù)3次,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用Tukey-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 行為學(xué)評(píng)分 18 只造模小鼠均出現(xiàn)不同程度的流涕、鼻癢和打噴嚏,成功建立AR 模型。與對(duì)照組相比,模型組小鼠行為學(xué)評(píng)分明顯提高(P<0.05);與模型組比較,AR+NC 組行為學(xué)評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,AR+shPVT1組行為學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖1。
Fig.1 Comparison of behavioral scores between the four groups圖1 各組小鼠行為學(xué)評(píng)分比較
2.2 組織病理學(xué)改變 對(duì)照組鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)清晰完整,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與對(duì)照組相比,模型組鼻黏膜組織厚度變薄,組織結(jié)構(gòu)致密無(wú)序,2個(gè)表面的柱狀細(xì)胞層大部分減少或丟失淺染,有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);AR+NC 組與模型組類(lèi)似,表面的柱狀細(xì)胞層丟失,細(xì)胞排列散亂,組織結(jié)構(gòu)有丟失,伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較,AR+shPVT1組鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)分層明顯,柱狀細(xì)胞數(shù)量恢復(fù),層次清晰,染色分明,見(jiàn)圖2。
Fig.2 HE staining of mouse nasal mucosa in each group(×200)圖2 各組小鼠鼻黏膜組織HE染色(×200)
2.3 鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p 和CHI3L1表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較,模型組鼻黏膜組織中LncRNA PVT1 和CHI3L1 mRNA 表達(dá)升高,miR-149-5p mRNA 表達(dá)下降(P<0.05);與模型組相比,AR+shPVT1 組小鼠鼻黏膜組織LncRNA PVT1 和CHI3L1 mRNA 的表達(dá)水平降低,miR-149-5p 的表達(dá)升高(P<0.05);AR+NC 組和模型組鼻黏膜 組 織 中LncRNA PVT1、miR-149-5p、CHI3L1 mRNA 的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);見(jiàn)表2。Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,模型組鼻黏膜組織中CHI3L1 蛋白的表達(dá)升高(P<0.05);與模型組相比,AR+shPVT1 組小鼠鼻黏膜組織中CHI3L1 蛋白的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。
Tab.2 Relative mRNA expressions of LncRNA PVT1,miR-149-5p and CHI3L1 in nasal mucosal tissues in each group表2 各組小鼠鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p和CHI3L1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況 (n=3,±s)
Tab.2 Relative mRNA expressions of LncRNA PVT1,miR-149-5p and CHI3L1 in nasal mucosal tissues in each group表2 各組小鼠鼻黏膜組織中LncRNA PVT1、miR-149-5p和CHI3L1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況 (n=3,±s)
**P<0.01;a與對(duì)照組比較,b與模型組比較,c與AR+NC 組比較,P<0.05。
組別對(duì)照組模型組AR+NC組AR+shPVT1組F LncRNA PVT1 1.00±0.00 3.51±0.59a 3.58±0.63a 0.75±0.14bc 34.470**miR-149-5p 1.00±0.00 0.31±0.06a 0.33±0.06a 0.71±0.16abc 41.684**CHI3L1 1.00±0.00 3.12±0.56a 3.09±0.51a 1.83±0.37bc 18.164**
Fig.3 Expression of CHI3L1 protein in mucosa of mice圖3 小鼠鼻黏膜組織CHI3L1蛋白的表達(dá)
2.4 血清中IgE、IL-5、TNF-α 的表達(dá)水平 ELISA結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠血清IgE、IL-5、TNF-α 水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);AR+shPVT1組與模型組相比,血清IgE、IL-5、TNF-α水平均降低(P<0.05),見(jiàn)表3。
Tab.3 Comparison of serum IgE,IL-5 and TNF-α levels between the four groups of mice表3 各組小鼠血清IgE、IL-5、TNF-α水平比較(n=3,±s)
Tab.3 Comparison of serum IgE,IL-5 and TNF-α levels between the four groups of mice表3 各組小鼠血清IgE、IL-5、TNF-α水平比較(n=3,±s)
**P<0.01;a與對(duì)照組比較,b與模型組比較,c與AR+NC 組比較,P<0.05。
組別對(duì)照組模型組AR+NC組AR+shPVT1組F IgE(μg∕L)33.77±5.59 111.38±17.30a 105.46±16.30a 51.29±8.66bc 26.882**IL-5(ng∕L)23.35±3.60 102.54±17.37a 96.96±15.66a 44.21±7.03bc 30.090**TNF-α(ng∕L)54.61±9.17 227.49±37.36a 235.78±39.65a 103.26±16.70bc 29.465**
2.5 LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1 的靶向調(diào)控關(guān)系 RNAhybrid 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示LncRNA PVT1 和miR-149-5p 以及miR-149-5p 和CHI3L1 之間存 在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖4。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與LncRNA PVT1-WT+NC mimic 組相比,LncRNA PVT1-WT+miR-149-5p mimic組的熒光素酶相對(duì)活性降低(P<0.05),證實(shí)LncRNA PVT1 與miR-149-5p 存在靶向關(guān)系,見(jiàn)圖5A。miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT 組和miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR MT 組相比,熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),表明CHI3L1是miR-149-5p的靶基因。miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1-MT 組與miR-149-5p mimic+CHI3L1 3'UTR WT+LncRNA PVT1-WT 組相比,熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),證實(shí)LncRNA PVT1 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-149-5p,上調(diào)miR-149-5p 靶基因CHI3L1 的表達(dá),見(jiàn)圖5B。
長(zhǎng)期以來(lái),非編碼RNA已被證明在多種人類(lèi)免疫及炎性疾病中起重要作用,一些非編碼RNA已經(jīng)成為炎癥相關(guān)介質(zhì)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑[15-16]。一項(xiàng)針對(duì)鼻炎患者鼻黏膜中LncRNA 表達(dá)譜的分析發(fā)現(xiàn),與非過(guò)敏對(duì)照組相比,鼻炎患者鼻黏膜中存在76個(gè)差異表達(dá)的LncRNA,結(jié)合GO和通路分析表明這些差異表達(dá)的LncRNA 在多個(gè)與炎癥有關(guān)的通路中富集[15]。
miRNA 作為小分子非編碼RNA 參與各種細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及代謝的進(jìn)展[17-18]。有研究證實(shí),在哮喘、過(guò)敏性鼻炎和特應(yīng)性皮炎中存在特定的miRNA表達(dá)譜,并且一些miRNA有望成為過(guò)敏性疾病的生物標(biāo)志及治療的主要靶點(diǎn)[19]。本課題前期研究已經(jīng)證明,在鼻炎小鼠模型中,miR-149-5p 可通過(guò)抑制其下游靶基因Notch1 的表達(dá)影響Treg∕Th17 細(xì)胞的免疫平衡,從而改善鼻炎小鼠的鼻部過(guò)敏癥狀[7]。Ma等[4]研究發(fā)現(xiàn),過(guò)敏性哮喘中LncRNA PVT1的表達(dá)量增高,并通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶向miRNA的表達(dá)加劇哮喘期間的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞屏障損傷,進(jìn)而加速哮喘的進(jìn)展;但LncRNA PVT1在鼻炎中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期通過(guò)在線(xiàn)生物信息學(xué)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1 與miR-149-5p 存在結(jié)合位點(diǎn),因此推測(cè)LncRNA PVT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-149-5p而參與調(diào)節(jié)AR 的進(jìn)展。本研究采用OVA 致敏建立AR小鼠模型,行為學(xué)評(píng)分結(jié)果表明模型組小鼠流涕和打噴嚏的次數(shù)明顯增多并伴有劇烈抓撓鼻面的行為,qPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LncRNA PVT1 在小鼠鼻黏膜組織中的表達(dá)明顯升高,而miR-149-5p則顯著降低,因此本研究推測(cè)LncRNA PVT1可能加速鼻炎的發(fā)生。
Fig.4 The binding sites of LncRNA PVT1 with miR-149-5p and the binding sites of miR-149-5p and CHI3L1圖4 LncRNA PVT1和miR-149-5p結(jié)合位點(diǎn)及miR-149-5p和CHI3L1結(jié)合位點(diǎn)
Fig.5 The targeted regulation of LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1圖5 LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1的靶向調(diào)控關(guān)系
本研究發(fā)現(xiàn),敲低LncRNA PVT1后鼻炎小鼠流涕和打噴嚏的頻率較模型組有所降低,小鼠鼻黏膜炎性反應(yīng)減輕,上皮結(jié)構(gòu)趨于完整。ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明,LncRNA PVT1 低表達(dá)后血清IgE 和炎性細(xì)胞因子IL-5、TNF-α 水平降低,表明干預(yù)LncRNA PVT1表達(dá)對(duì)鼻炎小鼠的炎癥具有一定的緩解作用。ceRNA 是Salmena 等[20-21]于2011 年提出的非編碼RNA(ncRNA)和信使RNA(mRNA)之間的調(diào)節(jié)機(jī)制,LncRNA 可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA 來(lái)減輕miRNA 對(duì)靶基因的抑制作用。目前已在多個(gè)領(lǐng)域?qū)υ摍C(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究,如LncRNA MEG3 作為miRNA“海綿”競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-17,上調(diào)其靶基因RORγt 的表達(dá),從而影響過(guò)敏性哮喘的炎性細(xì)胞平衡[22]。有文獻(xiàn)表明,由巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等細(xì)胞分泌的CHI3L1 在組織損傷、炎癥、組織修復(fù)和重塑中起到重要的作用[8];此外,CHI3L1 在哮喘患者的血清和肺組織中表達(dá)升高,且CHI3L1的表達(dá)水平與鼻炎及哮喘疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[9,23]。本研究發(fā)現(xiàn),模型小鼠的鼻黏膜組織中CHI3L1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著增加,敲低LncRNA PVT1的表達(dá)后CHI3L1 的表達(dá)水平明顯降低,并與miR-149-5p呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。為了深入探究LncRNA PVT1、miR-149-5p 與CHI3L1 之間的相互作用機(jī)制,本課題組又通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上驗(yàn)證LncRNA PVT1 可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-149-5p 而促進(jìn)CHI3L1的表達(dá)。
本研究發(fā)現(xiàn),在AR 小鼠中高表達(dá)的LncRNA PVT1 可通過(guò)ceRNA 機(jī)制抑制miR-149-5p 的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致CHI3L1的表達(dá)升高,鼻黏膜組織炎癥反應(yīng)增加,因而在鼻炎中具有潛在的促炎性作用,LncRNA PVT1∕miR-149-5p∕CHI3L1 通 路 也有 望 成為鼻炎治療的新靶點(diǎn)。