陳哲，張靈，袁小飛，劉潔，高炳華，張斌

急性髓系白血?。ˋML）是成人常見的急性白血病，發(fā)病率隨著年齡的增長逐漸增高［1］。AML 發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，預(yù)后較差，大多數(shù)患者在達(dá)到完全緩解后還會出現(xiàn)復(fù)發(fā)。靶向治療策略如干擾重要信號傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞周期調(diào)控的小分子藥物開發(fā)為AML的治療提供了新方法［2-4］。針對AML發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)的研究可能對AML 的治療有重要意義［5］。Toll樣受體（TLR）4信號通路與AML髓系細(xì)胞分化及存活有關(guān)［6］。白細(xì)胞介素-1 受體（IL-1R）可參與調(diào)控TLR 信號通路，在癌癥、代謝及炎癥性疾病中有重要調(diào)節(jié)作用［7-8］。白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶（IRAK）1∕4抑制劑與B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抑制劑ABT-737協(xié)同使用，對T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷能力［9］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）6參與細(xì)胞內(nèi)免疫過程、炎癥反應(yīng)和自噬效應(yīng)等多條信號通路的傳導(dǎo)［10］。目前關(guān)于IRAK1∕TRAF6 通路在AML中作用機(jī)制的研究較少。本研究旨在分析AML 患者骨髓單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)情況，同時通過體外培養(yǎng)人AML細(xì)胞，轉(zhuǎn)染IRAK1重組質(zhì)粒，觀察IRAK1∕TRAF6 通路對AML 細(xì)胞增殖、凋亡的影響，探討其在AML發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018 年5 月—2021 年2 月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血液科收治的54例AML 患者為研究對象（AML組），其中男29例，女25例，年齡20~75歲，平均（48.32±13.56）歲。AML初診患者18例，完全緩解者20例，復(fù)發(fā)時未經(jīng)治療者16例，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合成人AML 中國診療指南［11］。另選取同期30例于本院治療的因單純含鐵食物攝入不足、月經(jīng)量增多或痔瘡出血所致缺鐵性貧血患者作為對照組，其中男17例，女13例，年齡19~75歲，平均（47.26±12.71）歲。2組研究對象年齡（t=0.351）、性別（χ2=0.068）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對象及其家屬知情并同意參與此次研究，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 材料 人AML 細(xì)胞系HL-60（批號SCSP-5017）、KG-1（批號SCSP-7522）、U937（批號SCSP-0095）和人正常單核細(xì)胞系THP-1（批號GNO-19）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司；Lipofectamine 3000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；RNAiso Plus 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TAKARA公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）購自美國Abcam公司；兔源TLR4 一抗、Annexin V-FITC∕PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗、細(xì)胞蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自南通碧云天生物技術(shù)公司；兔源β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、Bcl-2、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、髓樣分化因子88（MyD88）、IRAK1、磷酸化IRAK1（p-IRAK1）、TRAF6、核因子-κB（NFκB）、β-肌動蛋白（β-actin）一抗購自美國cell signaling technology 公司；IRAK1、TRAF6、GAPDH 引物序列及IRAK1短發(fā)夾RNA（shRNA）質(zhì)粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。實(shí)時熒光定量PCR（qPCR）儀（型號CFX384）購自美國伯樂公司；酶標(biāo)儀（型號M5）購自美國Molecular Devices公司；流式細(xì)胞儀（型號Attune NxT）、蛋白凝膠成像儀（型號F1500）購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 單核細(xì)胞提取 所有受試者于髂前上棘部位進(jìn)行穿刺，收集骨髓4 mL置于EDTA抗凝管中，采用Nycodenz-NaCl密度滲透壓介質(zhì)離心法分離單核細(xì)胞［12］。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 對HL-60、KG-1、U937和THP-1細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)復(fù)蘇，轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，每2~3 d更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞生長良好且達(dá)對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.3.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 轉(zhuǎn)染前24 h，取1.3.2中處于對數(shù)生長期的HL-60 細(xì)胞接種至6 孔板中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為5×105個∕孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到60%時，棄去6 孔板中培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 3000 試劑盒說明書對HL-60 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將HL-60細(xì)胞分為空白組（轉(zhuǎn)染Lipofectamine 3000試劑）、陰性對照（NC）組（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）、IRAK1 shRNA 組（轉(zhuǎn)染IRAK1 shRNA）。

1.3.4 qPCR 檢測各組細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA 的表達(dá)水平 取1.3.1中提取的單核細(xì)胞、1.3.2及1.3.3中各組細(xì)胞。按照RNAiso Plus 試劑盒說明書進(jìn)行總RNA 提取，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的細(xì)胞總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后行qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃60 s；變性95 ℃30 s，退火60 ℃45 s，延伸72 ℃30 s，共計40 個循環(huán)。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計算各組細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence表1 引物序列

1.3.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況 取1.3.3 中各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個∕孔加至96 孔板中，每組設(shè)置6 個重復(fù)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入10μL CCK-8試劑，37 ℃遮光培養(yǎng)2 h，棄上清。酶標(biāo)儀450 nm 處檢測光密度（OD）值，計算細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（空白組OD值-實(shí)驗組OD值）∕空白組OD值］×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取1.3.3中各組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個∕mL，每組重復(fù)6 次，吸取200μL 細(xì)胞懸液至新離心管中，預(yù)冷PBS 重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕混均勻，4 ℃遮光孵育15 min；加入PI染液，輕混均勻，流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7 蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 取1.3.3中各組細(xì)胞，調(diào)整密度為5×105個∕mL，每孔100 μL 加至96 孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄上清，PBS洗滌2次，重懸細(xì)胞，蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定提取總蛋白濃度，蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉遮光封閉2 h；分別加入增殖相關(guān)蛋白抗體（兔抗鼠βcatenin、CyclinD1 單抗）、凋亡相關(guān)蛋白抗體（兔抗鼠Bcl-2、Bax單抗）及兔抗鼠TLR4、MyD88、p-IRAK1、IRAK1、TRAF6、NF-кB、β-actin單抗，均為1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗稀釋液（1∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次。蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達(dá)水平。每組設(shè)置6個重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用例表示，組間比較采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和AML組IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組比較，AML 組單核細(xì)胞中IRAK1 mRNA（1.62±0.07vs.0.97±0.04）和TRAF6 mRNA（1.56±0.06vs.0.99±0.03）表達(dá)水平顯著升高（t分別為46.720和48.671，P＜0.01）。

2.2 不同AML細(xì)胞系IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)水平比較 與THP-1 細(xì)胞比較，KG-1、U937、HL-60細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)水平顯著升高，且HL-60細(xì)胞最高（P＜0.05），選取HL-60細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗，見表2。

Tab.2 Comparison of IRAK1 mRNA and TRAF6 mRNA expression levels between the four groups of cells表2 各組細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

Tab.2 Comparison of IRAK1 mRNA and TRAF6 mRNA expression levels between the four groups of cells表2 各組細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與THP-1 細(xì)胞比較，b與KG-1 細(xì)胞比較，c與U937 細(xì)胞比較，P＜0.05。

組別THP-1 KG-1 U937 HL-60 F n6 6 6 6 IRAK1 mRNA 1.00±0.02 1.48±0.04a 1.52±0.05a 3.53±0.06abc 3 739.728＊＊TRAF6 mRNA 1.01±0.03 1.64±0.07a 1.48±0.08a 3.66±0.09abc 1 625.488＊＊

2.3 沉默IRAK1 對HL-60 細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平的影響 與空白組和NC 組比較，IRAK1 shRNA 組細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平顯著降低，見表3。

Tab.3 Effects of silencing IRAK1 on the expressionlevels of IRAK1 mRNA and TRAF6 mRNA in the three groups of cells表3 沉默IRAK1各組細(xì)胞中IRAK1 mRNA、TRAF6 mRNA表達(dá)水平的影響 （±s）

Tab.3 Effects of silencing IRAK1 on the expressionlevels of IRAK1 mRNA and TRAF6 mRNA in the three groups of cells表3 沉默IRAK1各組細(xì)胞中IRAK1 mRNA、TRAF6 mRNA表達(dá)水平的影響 （±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與NC組比較，P＜0.05。

組別空白組NC組IRAK1 shRNA組F n6 6 6 IRAK1 mRNA 1.00±0.00 1.03±0.07 0.51±0.03ab 264.517＊＊TRAF6 mRNA 1.00±0.00 1.04±0.08 0.32±0.02ab 433.412＊＊

2.4 沉默IRAK1 對HL-60 細(xì)胞增殖和凋亡的影響 空白組、NC 組與IRAK1 shRNA 組的細(xì)胞增殖抑制率分別為0、（1.41±1.22）%、（61.58±1.88）%，與空白組和NC 組比較，IRAK1 shRNA 組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高（n=6，F(xiàn)=4 428.514，P＜0.05）?？瞻捉M、NC 組與IRAK1 shRNA 組的細(xì)胞凋亡率分別為（4.34±1.56）%、（3.86±1.22）%和（17.49±1.13）%，與空白組和NC 組比較，IRAK1 shRNA 組細(xì)胞凋亡率顯著升高（n=6，F(xiàn)=207.119，P＜0.05），見圖1。

2.5 沉默IRAK1對HL-60細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白組和NC組比較，IRAK1 shRNA組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白β-catenin、CyclinD1 及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見表4、圖2。

2.6 沉默IRAK1 對HL-60 細(xì)胞IRAK1∕TRAF6 通路蛋白表達(dá)的影響 3 組細(xì)胞TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組和NC 組比＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與NC組比較，P＜0.05。較，IRAK1 shRNA 組p-IRAK1∕IRAK1、TRAF6、NFκB蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見表5、圖3。

Fig.1 Flow cytometry of HL-60 cell apoptosis in each group圖1 各組HL-60細(xì)胞凋亡流式圖

Tab.4 Effects of silencing IRAK1 on proliferation and apoptosis protein expression in cells of each group表4 沉默IRAK1對各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

Tab.4 Effects of silencing IRAK1 on proliferation and apoptosis protein expression in cells of each group表4 沉默IRAK1對各組細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 （±s）

組別空白組NC組IRAK1 shRNA組F n6 6 6 β-catenin 0.53±0.08 0.54±0.09 0.21±0.03ab 41.182＊＊CyclinD1 0.62±0.10 0.64±0.11 0.32±0.05ab 23.512＊＊Bcl-2 0.69±0.12 0.68±0.10 0.29±0.04ab 36.023＊＊Bax 0.16±0.02 0.17±0.03 0.75±0.13ab 112.846＊＊

Fig.2 Western blot assay of proliferation and apoptosis protein expression of HL-60 cells in each group圖2 各組HL-60細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)印跡圖

Tab.5 Effects of silencing IRAK1 on the expression of IRAK1/TRAF6 pathway protein in cells of each group表5 沉默IRAK1對各組細(xì)胞IRAK1/TRAF6通路蛋白表達(dá)的影響 （n=6，±s）

Tab.5 Effects of silencing IRAK1 on the expression of IRAK1/TRAF6 pathway protein in cells of each group表5 沉默IRAK1對各組細(xì)胞IRAK1/TRAF6通路蛋白表達(dá)的影響 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與NC組比較，P＜0.05。

組別空白組NC組IRAK1 shRNA組F TLR4 0.76±0.12 0.74±0.13 0.79±0.15 0.212 MyD88 0.68±0.12 0.71±0.13 0.72±0.11 0.180 p-IRAK1∕IRAK1 0.84±0.14 0.82±0.12 0.61±0.10ab 6.641＊＊TRAF6 0.63±0.09 0.65±0.09 0.42±0.07ab 13.848＊＊NF-κB 0.81±0.16 0.79±0.18 0.35±0.07ab 19.345＊＊

Fig.3 Western blot assay of IRAK∕TRAF6 pathway protein expression in HL-60 cells of each group圖3 各組HL-60細(xì)胞IRAK∕TRAF6通路蛋白表達(dá)印跡圖

3 討論

AML 是一種高度異質(zhì)性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，預(yù)后較差，因此尋找治療AML的有效靶點(diǎn)具有重要意義。IRAK1 是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，能夠調(diào)控多種病原體反應(yīng)和細(xì)胞因子反應(yīng)［13］。IRAK1與多種血液惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Seltzer等［14］通過成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）∕CRISPR相關(guān)蛋白9（Cas9）技術(shù)在BCBL-1Cas9 和BC-1Cas9 細(xì)胞中產(chǎn)生穩(wěn)定的缺失IRAK1克隆，發(fā)現(xiàn)IRAK1的缺失能夠阻斷IL-1β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能在原發(fā)性滲出性淋巴瘤的早期發(fā)展中發(fā)揮作用。Hosseini 等［15］研究表明IRAK1在AML中存在過表達(dá)，有助于AML細(xì)胞的存活。本研究結(jié)果顯示，AML 患者骨髓單核細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，提示IRAK1∕TRAF6 可能參與AML 的發(fā)生；另外，通過測定不同AML 細(xì)胞系和人正常單核細(xì)胞系中IRAK1、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示KG-1、U937、HL-60 細(xì)胞中IRAK1、TRAF6 mRNA 表達(dá)水平均顯著高于THP-1細(xì)胞，其中HL-60升高水平最顯著。

骨髓和外周血中未成熟髓系細(xì)胞異常增殖是AML 的主要特征［16］。Dussiau 等［17］研究表明，敲除IRAK1 能夠誘導(dǎo)T-ALL 細(xì)胞系HPB-ALL 和Jurkat細(xì)胞株細(xì)胞凋亡，并維持細(xì)胞周期停滯。本研究結(jié)果顯示，IRAK1 shRNA 組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著高于空白組和NC 組，與空白組和NC 組比較，IRAK1 shRNA組細(xì)胞增殖蛋白β-catenin、CyclinD1、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著升高。Li等［18］研究表明IRAK1∕4信號通路能夠促進(jìn)T-ALL 的發(fā)展，抑制該途徑可能增強(qiáng)化療療效，促進(jìn)AML細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖，可能是治療AML的潛在靶點(diǎn)。

IRAK1 是TLR4∕MyD88 信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因子，TLR4 受外界刺激后激活MyD88 依賴途徑，募集MyD88 形成復(fù)合體，IRAK1 與該受體復(fù)合物結(jié)合后，引起IRAK1 的磷酸化，之后從復(fù)合體上解離，活化TRAF6，激活NF-кB信號通路［19-20］。Su等［21］研究表明，清除劑受體∕TLR9激動劑（C-miR146a）可以通過抑制miR-146a 的靶點(diǎn)IRAK1、TRAF6，阻斷靶細(xì)胞中NF-кB的激活，從而抑制AML的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，IRAK1 shRNA 組細(xì)胞TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)與空白組和NC 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而p-IRAK1∕IRAK1、TRAF6、NF-кB蛋白表達(dá)顯著低于空白組和NC 組，提示抑制IRAK1 可能在TLR4∕MyD88 通路下游發(fā)揮作用，通過抑制IRAK1 的表達(dá)降低NF-кB 表達(dá)，從而抑制炎癥信號的激活，可能是AML治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，IRAK1∕TRAF6通路與AML的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，抑制IRAK1∕TRAF6通路可能是AML治療的新靶點(diǎn)。然而，由于IRAK 有不同分子類型，本研究僅針對沉默IRAK1對AML細(xì)胞增殖和凋亡的影響，未對其他分子類型進(jìn)行研究，因此還需進(jìn)一步研究IRAK2、IRAK3、IRAK4在AML患者及體外細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)一步分析IRAK 在AML 發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。