朱麗亞

摘要：目的：當(dāng)前動(dòng)物疫病已成為規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要威脅之一，特別是豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征（藍(lán)耳病）、豬偽狂犬病，已經(jīng)成為目前中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的3種重要傳染病。檢測(cè)這三種疾病的免疫抗體，可及時(shí)了解豬藍(lán)耳病及豬瘟抗體水平，盡早發(fā)現(xiàn)免疫是否存在不足，了解母豬群免疫狀態(tài)，母豬群是否存在免疫問題及潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)。方法：采取90頭份豬的血清，進(jìn)行豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等疾病免疫抗體檢測(cè)，而偽狂犬進(jìn)行野毒感染抗體檢測(cè)。結(jié)果：（1）母豬三種疾病整體陽(yáng)性率，藍(lán)耳抗體陽(yáng)性率為96.29%、豬瘟陽(yáng)性率為94.81%、偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為14.82%。（2）不同生產(chǎn)階段三種疾病的抗體陽(yáng)性率，妊娠30～60d母豬藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率分別為97.77%、91.10%、22.23%;而妊娠60～90d藍(lán)耳病與豬瘟抗體陽(yáng)性率分別為100.00%和93.33%，偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為8.9%;哺乳15d母豬三種疾病的陽(yáng)性率分別為91.10%、100.00%、13.33%。（3）不同生產(chǎn)線三種疾病的抗體陽(yáng)性率，生產(chǎn)一線母豬藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率分別為100.00%、88.90%、0.00%;生產(chǎn)二線藍(lán)耳病與豬瘟抗體陽(yáng)性率分別為95.53%和100.00%，偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為4.47%;生產(chǎn)三線三種疾病的陽(yáng)性率分別為93.33%、95.53%、40.00%。結(jié)論：本場(chǎng)豬瘟、藍(lán)耳病整體疫苗免疫較好，但第三線哺乳階段藍(lán)耳病免疫較差，需要重新免疫，偽狂犬野毒處于低水平感染;整體豬場(chǎng)免疫效果比較好。

關(guān)鍵詞：母豬;抗體;檢測(cè);分析

隨著生豬養(yǎng)殖規(guī)?；?、集團(tuán)化的發(fā)展，生豬的飼養(yǎng)密度越來越高，這就導(dǎo)致豬群活動(dòng)量減少、抵抗力下降。如果疾病早期發(fā)現(xiàn)不及時(shí)，這就導(dǎo)致疾病傳播速度快，波及范圍廣;進(jìn)而引起巨大的損失，阻礙了我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。最近幾年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，因各種豬疫病造成的生豬死亡率占全部死亡生豬的10%以上，給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前動(dòng)物疫病已成為規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要威脅之一，現(xiàn)今疾病的種類繁多，病原變異頻繁，耐藥性增強(qiáng)，混合感染易發(fā)等不利因素使得規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)面臨重大的挑戰(zhàn)。據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì)近期豬新傳染病多達(dá)20種，其中豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病是目前中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的3種重要傳染病。其中豬瘟與豬繁殖與呼吸綜合征是《2012 國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》中的必須進(jìn)行強(qiáng)制免疫的兩種傳染病，可見其重要性。

但目前豬場(chǎng)發(fā)病情形越來越復(fù)雜，其中主要以混合感染和繼發(fā)感染的為主，很難看到豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬等病的典型病例，根據(jù)臨床癥狀和病理解剖也很難對(duì)疾病進(jìn)行診斷?？梢酝ㄟ^實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測(cè)來了解3種病的流行動(dòng)態(tài)，再結(jié)合臨床情況來初步診斷。對(duì)于偽狂犬、豬瘟，我們可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA ）檢測(cè)方法來鑒別診斷，而且 ELISA 檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確，目前已成為確診疾病的有效手段。

疫苗免疫是規(guī)?；i場(chǎng)防控重要?jiǎng)游锛膊〉闹匾侄危绊懨庖咝Ч囊蛩乇姸?，因此，抗體的監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。本次試驗(yàn)通過檢測(cè)豬藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬野毒等疾病免疫抗體;及時(shí)了解豬藍(lán)耳病及豬瘟抗體水平，盡早發(fā)現(xiàn)免疫是否存在不足，了解母豬群免疫狀態(tài);而對(duì)偽狂犬野毒進(jìn)行檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)母豬群是否存在免疫問題及潛在的感染風(fēng)險(xiǎn)。以便更好的指導(dǎo)母豬群管理工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集與處理

采集山東某規(guī)模豬場(chǎng)母豬群血清，采樣方式為按照50%預(yù)期流行率、95%置信區(qū)間確定仔豬樣本量，按照15%預(yù)期流行率、95%置信區(qū)間確定母豬采樣量三個(gè)階段合計(jì)為90個(gè)樣本。通過耳緣靜脈采血，凝血處理，分離血清后置于-20℃冰箱凍存待檢。

1.1.2 主要試劑及儀器

MEDIAN公司豬瘟病毒（CSFV）抗體檢測(cè)試劑盒、藍(lán)耳病病毒（PRRSV）抗體檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病病毒gE（PRVgE）抗體檢測(cè)試劑盒，以及每個(gè)試劑盒相對(duì)應(yīng)的稀釋液、洗滌液、TMD底物、終止液、陰性、陽(yáng)性對(duì)照以及抗原包被板等。

酶標(biāo)儀、Eppendorf移液器、恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)洗板機(jī)以及振蕩器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將采集到的豬的血液，傾斜45°放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置 1～2h，待自然凝固析出血清后;吸取上清液轉(zhuǎn)至新準(zhǔn)備的干凈的1.5ml離心管并編號(hào)，離心3～5min，分離血清，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗(yàn)操作

本次試驗(yàn)是通過ELISA方法檢測(cè)豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬野毒的抗體水平，三種試劑盒在使用前，須恢復(fù)到正常溫室（18～25℃），具體操作步驟如下：

（1）先將待檢樣品在96孔板架上擺好，從E1的位置開始S型依次排列;取出抗原包被板，拿出待檢樣品需要的孔條，多余的孔條密封（放入密封袋中，密封袋中加入干燥劑）后放入2～8℃冰箱保存。在記錄表上記錄樣本的位置。

（2）樣品稀釋：用樣品稀釋液將待檢樣品進(jìn)行40倍稀釋。先在一次性稀釋板上與待檢樣品相應(yīng)的位置加入195μl樣品稀釋液，再在相應(yīng)的位置依次加入5μl待檢樣品。加完后在微量振蕩器上震蕩10s混勻。每個(gè)樣品都要更換槍頭，不要稀釋陰陽(yáng)性對(duì)照。

（3）A1和B1的孔加入100μl無(wú)稀釋的陰性對(duì)照溶液，而陽(yáng)性對(duì)照位于C1和D1的位置，分別加入無(wú)稀釋的陽(yáng)性對(duì)照溶液100μl。避免產(chǎn)生氣泡。

（4）從E1的位置開始，在對(duì)應(yīng)的孔中加入100 μl已稀釋好的樣品，排槍加樣，加樣前在孔內(nèi)吹打3次，采用倒吸法加入，避免產(chǎn)生氣泡。

（5）蓋上板蓋或貼上封板膜在22～25℃（室溫達(dá)不到時(shí)，放25℃恒溫箱）條件下孵育30±2 min，嚴(yán)格計(jì)時(shí)。

（6）之后，板蓋或封板膜去掉，洗滌4次。洗板機(jī)洗板：將反應(yīng)板放在洗板機(jī)上，洗滌4次，最后一次在吸水紙（棉墊上放3張干凈吸水紙）上拍干（吸水紙上無(wú)明顯水漬，反應(yīng)板底部無(wú)肉眼可見水漬，若孔內(nèi)有氣泡，用一次性槍頭刺破，再次拍干）。手動(dòng)洗板：將反應(yīng)板快速翻轉(zhuǎn)至水平，甩掉孔內(nèi)液體至廢液筒。用300μl排槍每孔內(nèi)加入300μl洗液，水平輕搖5s，甩掉孔內(nèi)液體至廢液筒，如此反復(fù)洗滌4次。最后一次在吸水紙（棉墊上放3張干凈吸水紙）上拍干（吸水紙上無(wú)明顯水漬，反應(yīng)板底部無(wú)肉眼可見水漬，若孔內(nèi)有氣泡，用一次性槍頭刺破，再次拍干）。

（7）每孔必須立即加入100μl酶標(biāo)抗體。避免產(chǎn)生氣泡。

（8）蓋上板蓋或貼上封板膜22～25℃（室溫達(dá)不到時(shí)，放25℃恒溫箱）條件下孵育30±2min，嚴(yán)格計(jì)時(shí)。重復(fù)步驟6）。

（9）洗滌拍干后，TMB底物液立刻加入100μl/孔 ，加第一孔即開始計(jì)時(shí)。避免產(chǎn)生氣泡。

（10）蓋上板蓋或貼上封板膜22～25℃（室溫達(dá)不到時(shí)，放25℃恒溫箱）條件下避光（蓋黑色蓋板或放置抽屜）孵育15±1min，嚴(yán)格計(jì)時(shí)。

（11）終止液加入100μl/孔，終止反應(yīng)，添加順序與TMB底物液保持一致。避免產(chǎn)生氣泡。

（12）終止反應(yīng)10min內(nèi)，測(cè)量并且記錄樣本和對(duì)照的吸光值A(chǔ)650。

（13）將測(cè)量結(jié)果以Excel的形式保存，計(jì)算結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定

CSFV：阻斷率≥40.0%為陽(yáng)性，阻斷率≤40.0%為陰性;PRRSV：S/P值（陽(yáng)性對(duì)照平均值的比值）≥0.4為陽(yáng)性，S/P值<0.4為陰性;PRV gE：S/N值（陰性對(duì)照平均值的比值）>0.6為陰性，S/N值≤0.6為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬場(chǎng)整體三種疫病抗體檢測(cè)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，母豬藍(lán)耳抗體陽(yáng)性率為96.29%、豬瘟為94.81%、偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為14.82%;而三種疫病抗體陽(yáng)性率離散度分別為37.74%，21.17%，21.01%。

2.2 不同階段三種疫病抗體檢測(cè)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，妊娠30～60d母豬藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率分別為97.77%、91.10%、22.23%，離散度為33.25%、23.85%、26.54%;而妊娠60～90d藍(lán)耳病與豬瘟抗體陽(yáng)性率分別為100.00%和93.33%，離散度為24.04%與4.38%，偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為8.9%，而離散度為14.25%;哺乳15d母豬三種疾病的陽(yáng)性率分別為91.10%、100.00%、13.33%，離散度為55.94%、15.29%、22.23%。

2.3 不同生產(chǎn)線三種疫病抗體檢測(cè)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，生產(chǎn)一線母豬藍(lán)耳病、豬瘟、偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率分別為100.00%、88.90%、0.00%，離散度為30.87%、30.02%、5.31%;而生產(chǎn)二線藍(lán)耳病與豬瘟抗體陽(yáng)性率分別為95.53%和100.00%，離散度為43.64%與15.97%，偽狂犬野毒抗體陽(yáng)性率為4.47%，而離散度為14.81%;生產(chǎn)三線三種疾病的陽(yáng)性率分別為93.33%、95.53%、40.00%，離散度為38.72%、17.53%、42.89%。

3 討論與分析

據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部統(tǒng)計(jì)近期豬新傳染病多達(dá)20種，其中豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病是目前中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的3種重要傳染病。藍(lán)耳病病毒可導(dǎo)致豬免疫系統(tǒng)受到印制，進(jìn)而繼發(fā)或混合感染其他疾病;再加上藍(lán)耳病病毒具有高度變異的特性，使得其不斷產(chǎn)生毒力增強(qiáng)的變異毒株，因此，主會(huì)場(chǎng)那個(gè)科學(xué)防控藍(lán)耳病最有效的措施就是對(duì)其抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。而豬瘟目前多以非典型、慢性、隱形的情況發(fā)病，一個(gè)豬場(chǎng)往往是全群感染，這就導(dǎo)致全部撲殺不現(xiàn)實(shí)，并且其還可進(jìn)行垂直傳播，進(jìn)而使得其持續(xù)感染;并且高密度的飼養(yǎng)以及豬群流動(dòng)頻繁等不規(guī)范的操作，往往可導(dǎo)致豬偽狂犬的流行傳播，其也嚴(yán)重影響豬場(chǎng)的發(fā)展與經(jīng)濟(jì)效益。

因此，對(duì)藍(lán)耳、豬瘟、偽狂犬抗體水平進(jìn)行免疫檢測(cè)，既可以快速發(fā)現(xiàn)它們的感染與傳播，同時(shí)還可以檢測(cè)三種疾病的免疫抗體，對(duì)規(guī)模化豬場(chǎng)調(diào)整優(yōu)化免疫程序、保證疫苗免疫效果至關(guān)重要;且可有效的評(píng)估疫病的感染壓力和風(fēng)險(xiǎn)。離散度是衡量一個(gè)豬群抗體陽(yáng)性率均勻度的一個(gè)重要指標(biāo)，其高低可提示豬場(chǎng)在免疫后抗體水平的整齊度，可對(duì)疫苗免疫效果進(jìn)行評(píng)估?？贵w離散度要求是離散度越小越好。藍(lán)耳病的離散度一般在35%～45%;母豬群豬瘟的離散度一般≤40%。

涂長(zhǎng)春等研究認(rèn)為豬瘟群體的免疫保護(hù)率至少要達(dá)到 85%，才能避免豬瘟的發(fā)生。而本次試驗(yàn)結(jié)果，豬瘟整群抗體陽(yáng)性率在94.81%以上，豬瘟抗體整體離散度為21.17%，而且均低于40%;說明豬瘟免疫后的抗體整齊度較好;因此，本場(chǎng)豬瘟免疫效果較好。

良好豬場(chǎng)的藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性率一般在70%以上。本次試驗(yàn)藍(lán)耳病抗體陽(yáng)性率結(jié)果為96.29%，而藍(lán)耳病抗體整體離散度為37.74%，這提示該豬場(chǎng)藍(lán)耳病陽(yáng)性比較穩(wěn)定，是一個(gè)良好的藍(lán)耳病陽(yáng)性穩(wěn)定場(chǎng);但母豬處于哺乳期15d時(shí)，其藍(lán)耳抗體陽(yáng)性雖然為91.1%，但離散度為55.94%，表明母豬在哺乳期藍(lán)耳抗體參差不齊，但S/P值在2.5以內(nèi)，這說明藍(lán)耳病疫苗免疫時(shí)間較長(zhǎng)，或者是免疫效果較差;第三生產(chǎn)線需要進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。

而偽狂犬野毒抗體水平比較偏低，基本維持在14.82%左右;低于戴愛玲等在 2012～2014 年調(diào)查的閩西南地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)母豬陽(yáng)性率22.0%，但這也說明本豬場(chǎng)存在偽狂犬野毒持續(xù)感染壓力和風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)后備豬進(jìn)場(chǎng)前進(jìn)行檢測(cè)、凈化以及進(jìn)場(chǎng)后及時(shí)消毒等措施相結(jié)合，使得其一直維持在低水平的感染風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本場(chǎng)豬瘟、藍(lán)耳病整體疫苗免疫較好，但第三線哺乳階段藍(lán)耳病免疫較差，需要重新免疫，偽狂犬野毒處于低水平感染;整體豬場(chǎng)免疫效果比較好。由此可知，抗體水平檢測(cè)在豬瘟、藍(lán)耳、偽狂犬能夠疾病的防控中有不可替代的作用。

要堅(jiān)持定期開展免疫監(jiān)測(cè)，評(píng)價(jià)疾病的免疫效果以及感染壓力，及時(shí)調(diào)整本場(chǎng)的免疫程序，抗體不合格及時(shí)補(bǔ)免，淘汰帶毒種豬，保障健康的母豬群。

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