程漢　吳秋萍　解慧梅

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的傳染病，本項目研究選取了黃芪等5種中藥，具有免疫力強，解毒清熱等功效，研究這些中藥在體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用，篩選出能有效抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒的中藥組合配方，為治療豬繁殖與呼吸綜合征提供臨床治療幫助。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征;中藥組方;抗病毒;細胞免疫

豬繁殖與呼吸綜合征臨床上主要以妊娠母豬的早產(chǎn)、流產(chǎn)，產(chǎn)弱仔、死胎和木乃伊胎以及生長豬呼吸道疾病為特征。郭寶清[1] 等于1996年在我國發(fā)現(xiàn)該病并分離到病原，此后，豬繁殖與呼吸綜合征給養(yǎng)豬業(yè)造成的威脅的很大，同時有較大經(jīng)濟損失。當前，該病主要靠預(yù)防，還沒有防治的有效藥物和相關(guān)防治辦法。近幾年，中藥受到市場追捧，運用比較普遍，在調(diào)整機體陰陽平衡，增強動物機體免疫力，扶正培本等方面具有很好的效果，實驗研究證明，許多單味中藥和復(fù)方藥物應(yīng)用臨床，具有抑制病毒感染復(fù)制、阻止病毒致細胞病變、調(diào)節(jié)免疫等功效，同時，中藥具有副作用少，藥物低殘留，藥源豐富等優(yōu)勢[2-6] 。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

Marc-145細胞，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制品重點研究室提供，常規(guī)培養(yǎng)傳代。病毒由江蘇農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)院鑒定分離。

1.2 主要材料

胰酶細胞消化液，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）均購自上海生工生物工程有限公司。將MTT以無鈣離子、鎂離子的PBS液配制成5mg/ml，除菌，過濾分裝，-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 藥水提取物的制備

將市場采購的黃柏、黃芩、梔子、黃芪和黃連等5種藥物，每種藥物稱4g，用水浸泡1h，小火煎2次，每次煮30min，兩次合并，再低速離心，濃縮，定容至20ml。提取后的中藥水相當于生藥0.2g/ml。用碳酸氫鈉溶液調(diào)整pH值到7，再經(jīng)高壓蒸汽滅菌，滅菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥物對細胞安全濃度測定

在九十六孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)Marc-145細胞長成單層，棄去培養(yǎng)液原液，用PBS洗滌1次。用細胞培養(yǎng)液對各中藥原液分別進行2倍倍比稀釋至1×2，第1～12孔分別加入100μl，細胞對照孔為第11、12孔，每個稀釋度重復(fù)4孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h，每天定時觀察生長情況。72h后倒去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌，加入MTT液20μl/孔，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后倒去MTT液，加入二甲基亞砜，150μl/孔，振蕩10min，等晶體全部溶解，測定OD490nm數(shù)值，計算出不同濃度藥物的生長抑制率。

1.5 半數(shù)病毒組織細胞感染量（TCID50）的測定

參照文獻[7-8]，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒按十倍倍比稀釋，在長滿細胞的九十六孔細胞培養(yǎng)板上，按100μl/孔的量加入，，最后兩列為細胞對照組，各稀釋度重復(fù)八孔，于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5h，病毒液除去，各孔加100μlDMEM維持液，再進一步培養(yǎng)。觀察病變細胞（CPE）的情況，等72～96h后，用MTT測定法測定各孔OD490nm值，計算出豬繁殖與呼吸綜合征病毒對細胞的生長抑制率。

1.6 中藥體外抗PRRSV效果的測定

參照冼瓊珍等[2，7，9]方法，以中藥的起始濃度為最大安全濃度，共四個稀釋度，用細胞培養(yǎng)液進行兩倍稀釋中藥，每個稀釋度重復(fù)8孔，豬繁殖與呼吸綜合征病毒液的使用稀釋度是100TCID50，設(shè)立設(shè)細胞病毒對照組和對照組。在37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，注意及時查看CPE的情況，培養(yǎng)72h以后，通過MTT法檢測得出各孔OD490nm數(shù)值，通過計算得出各中藥對感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒的Marc-145細胞的保護率。用MTT法檢測中藥配方組合物的OD490nm數(shù)值高，中藥的細胞保護率就高，說明它的抑制病毒的吸附能力就越強。

（1）藥物的切斷作用方法是首先加中草藥，其次加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒，再將中藥液加入細胞培養(yǎng)板上，該中藥液為安全濃度起始濃度，100μl/孔，37℃培養(yǎng)4h，然后除去中藥液，再加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒液，100μl/孔，于37℃培養(yǎng)2h后除去病毒液，各孔中加入10微升DMEM液。

（2）藥物的抑制作用方法是先加豬繁殖與呼吸綜合征病毒，再加中草藥，在Marc-145細胞上長到單層的九十六孔細胞培養(yǎng)板上加入豬繁殖與呼吸綜合征病毒液，100μl/孔，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)2h后，除去病毒液體，而后加入中藥液，此時的中藥液濃度為安全濃度，100μl/孔，于37℃下培養(yǎng)，4h后，再除去藥液，各孔中加入100μlDMEM維持液。

（3）藥物的殺滅作用方法是中藥與豬繁殖與呼吸綜合征病毒一并加入，制備以藥物安全濃度為起始濃度，不同濃度中藥培養(yǎng)液倍比稀釋，在九十六孔細胞培養(yǎng)板中加入Marc-145細胞，100μl/孔，37℃培養(yǎng)，4h后除去藥液，各孔加DMEM維持液100μl。

（4）藥物評價及數(shù)據(jù)處理用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，用各中藥對細胞保護率來評價效果，如果細胞保護率大就說明藥物抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用就強。

2 實驗結(jié)果

2.1 藥物對細胞的安全濃度

藥物對Marc-145細胞的毒副作用：導(dǎo)致細胞變圓、折光性增加，細胞間黏連和細胞損傷及脫落現(xiàn)象。如果中藥液的濃度高，就證明豬繁殖與呼吸綜合征病毒對細胞毒性作用就強;如果活的細胞較少，通過MTT法測量，得到的OD值也不高，通常情況下，藥物濃度越高，副作用就越大，本實驗的結(jié)果跟這個規(guī)律是符合的。不同濃度下的中藥對細胞的生長抑制率，是通過公式以及OD490nm值計算得出的，同時結(jié)合CPE的情況，根據(jù)以上幾種因素，來綜合判斷中藥毒性的強弱。結(jié)果說明黃芪的安全濃度最高

（50mg/ml），其他4種中藥的最大安全濃度在1.56～3.13mg/ml范圍內(nèi)（如表1所示）。

注：黃連、黃芩起始濃度為50mg/ml，其他藥物的起始濃度為100mg/ml。

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征病毒TCID50的測定

依據(jù)Reed-Muench法計算豬繁殖與呼吸綜合征病毒的TCID50的結(jié)果是1×10-5.393/0.1ml，如果病毒液稀釋到1×10-5.393的時候，結(jié)果半數(shù)的細胞感染?？梢钥吹接貌煌兴幰旱南♂尯螅i繁殖與呼吸綜合征病毒對細胞的生長抑制率產(chǎn)生了不同程度的影響，如圖表2。

2.3 中藥抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的效果

（1）中藥的阻斷作用如表3顯示，黃芪對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的阻斷效果最強，黃芪在50～6.25mg/ml濃度下均能100%保護細胞。黃連和黃柏次之，黃連在0.2～1.56mg/ml濃度、黃柏在1.56～3.13mg/ml濃度均能保護50%以上的細胞。黃芩和梔子也有一定的阻斷豬繁殖與呼吸綜合征病毒吸附的作用。

（2）中藥的抑制作用，由表3可知，5種中藥對PRRSV增殖都有一定程度上的抑制作用，黃芪、黃連和梔子的作用最為顯著，黃芩其次，中藥黃柏的抑制效果最差。

（3）中藥的直接殺滅作用，如表3可知，黃芩和黃芪對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的殺滅作用非常明顯，梔子其次，而黃柏和黃連對PRRSV的直接殺滅作用較低。

從上述可知，五種中藥中體外抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒黃芪效果顯著，其他4種中藥則在對病毒的阻斷、抑制或殺滅作用上均有不同程度的效果。

3 討論

本試驗結(jié)果顯示黃芪在5種中藥中對Marc-145細胞的生長抑制率最低，安全用藥的濃度最高，而且在阻斷病毒的吸附、抑制病毒的復(fù)制和直接殺滅豬繁殖與呼吸綜合征病毒方面都表現(xiàn)較強。本實驗所選的黃芪等五種中藥做了同樣的實驗，對細胞的毒性程度不同，藥物種類不一樣，毒性的強弱不一樣。在該研究中，當每一種中藥液如果稀釋至某一個倍數(shù)后，幾乎不會出現(xiàn)細胞的病理變化。如果所測的藥物組OD值相等，或者是測得值大于對照組，這就證明該濃度的中藥能引起細胞的生長，同時也證明對細胞是沒有毒性的，本實驗各中藥測定結(jié)果與胡元亮[8]等人的研究相符。這些中藥之所以對細胞有作用，是因為這些藥物中含有很多的活性物質(zhì)，如多糖類、生物堿類及揮發(fā)油類物質(zhì)等。而藥物中的礦物質(zhì)、氨基酸、維生素、生長因子，與細胞生長和機體免疫力的提高，是密切聯(lián)系的。藥理學(xué)研究結(jié)果表明，中草藥對畜禽病毒性疾病的作用主要體現(xiàn)在直接作用（抗病毒）和間接作用（調(diào)節(jié)機體免疫功能）2個方面[9]。直接作用體現(xiàn)在一些中藥通過阻斷病毒增殖過程的吸附、穿入、復(fù)制、成熟中的某個環(huán)節(jié)，從而達到抗病毒的目的[10]。

參考文獻

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