陳 露，陳 瑤，高 湛，劉小轉，陶宇昌，余增麗

1)鄭州大學第三附屬醫(yī)院保健部 鄭州450052 2)鄭州大學第五附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科 鄭州 450052 3)鄭州大學第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 4)河南省人民醫(yī)院單細胞研究中心 鄭州 450003 5)河南省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科 鄭州 450003 6)鄭州大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室 鄭州 450001

腭裂是人類最常見的出生缺陷之一，發(fā)病率為10.63/10 000活產(chǎn)兒[1]。環(huán)境和遺傳因素的異常均可導致腭裂的發(fā)生。2，3，7，8-四氯二苯并對二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是工業(yè)燃燒過程中產(chǎn)生的對人體和環(huán)境有害的持久性有機污染物。有報道[2]哺乳動物孕期接觸過多TCDD可出現(xiàn)死產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎以及包括腭裂在內的出生缺陷。近年來，表觀遺傳學在腭裂發(fā)生中的作用越來越受到重視。研究[3]發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾參與TCDD誘導的腭裂過程，其中DNA甲基化被認為在腭裂形成過程中發(fā)揮了重要作用。轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)在哺乳動物腭發(fā)育過程中扮演重要角色[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn)TGF-β2或TGF-β3基因敲除小鼠出現(xiàn)了包括腭裂在內的多種出生缺陷。因此，我們比較了正常和TCDD誘導的胎鼠腭組織中TGF-β2和TGF-β3啟動子甲基化水平和基因表達水平，探討TGF-β2以及TGF-β3啟動子甲基化對TCDD誘導腭裂發(fā)生的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑63只6～8周齡C57BL/6N系成年小鼠(雄鼠21只，雌鼠42只)購于北京維通利華有限公司(合格證號No.1100111911039761、1100111911014659)。飼養(yǎng)條件為溫度(20±2) ℃，濕度(50±5)%，光暗12 h交替。TCDD和二甲基亞砜購于美國Sigma公司，玉米油購于山東三星產(chǎn)業(yè)科技有限公司，中性蛋白酶購于上海羅氏制藥有限公司，Trizol購于美國Life Technologies公司，反轉錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，TGF-β2和TGF-β3抗體購于美國Pepro Tech公司，小鼠抗兔β-actin單克隆抗體購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 動物模型建立及分組63只小鼠在屏障環(huán)境內適應性飼養(yǎng)1周后，雌雄小鼠于晚8點按2∶1比例合籠，次日早8點查到陰栓則記為妊娠第0天(gestation day 0,GD0)，將42只孕鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組(n=21)和TCDD組(n=21)，TCDD組于GD10用64 μg/kg的TCDD(用玉米油配制成10 mg/L)經(jīng)口一次性灌胃，對照組以等體積玉米油一次性灌胃。

1.3 標本制備對照組和TCDD組孕鼠分別于GD13、GD14、GD15隨機取3只頸椎脫臼處死，剖腹取胎鼠頭部，用40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后，頭喙部朝下，石蠟包埋切片；同法隨機另取3只孕鼠的胎鼠，用眼科剪分離胎鼠腭突后，提取總RNA，用于TGF-β2和TGF-β3 mRNA表達的檢測；每組余3只孕鼠于GD14提取胎鼠腭組織總DNA后進行甲基化檢測。

1.4 胎鼠腭組織形態(tài)學觀察石蠟切片經(jīng)脫蠟、復水后行HE染色，后經(jīng)脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 胎鼠腭組織中TGF-β2、TGF-β3 mRNA表達的qRT-PCR檢測用Trizol提取胎鼠腭組織總RNA，分光光度計測定濃度和純度，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，制備PCR反應體系(共20 μL：cDNA 2.0 μL，SYBR 10.0 μL，引物1.6 μL，無RNase dH2O 6.4 μL)。擴增條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s，然后72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。引物序列：TGF-β2上游5’-GCTGAGCGCTTTTCTGATCCT-3’，下游5’-CGAGT GTGCTGCAGGTAGACA-3’；TGF-β3上游5’-GGACTTCGGCCACATCAAGAA-3’,下游5’- TAGGGGACGTGGGTCATCAC-3’;內參β-actin上游5’-CTGT GCCCATCTACGAGGGCTAT-3’,下游5’-TTTGAT GTCACGCACGATTTCC-3’。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.6 胎鼠腭組織中TGF-β2、TGF-β3啟動子甲基化檢測根據(jù)QIAamp DNA Mini試劑盒(Qiagen公司)說明書提取胎鼠腭組織DNA并進行CpG位點甲基化檢測。使用Sequenom公司Epidesigner (http://www.epidesigner.com)設計引物，見表1、2。亞硫酸氫鹽處理胎鼠腭組織DNA并進行PCR擴增，反應體系9 μL，擴增條件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s，62 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min(10個循環(huán))；94 ℃ 45 s，57 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min(35個循環(huán))；72 ℃ 3 min。產(chǎn)物經(jīng)堿性磷酸酶處理、純化、點樣，最后進行質譜分析，數(shù)據(jù)通過EpiTYPER軟件(Sequenom公司)進行分析并輸出結果。

表1 TGF-β2啟動子甲基化檢測的引物

表2 TGF-β3啟動子甲基化檢測的引物

1.7 統(tǒng)計學處理運用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學處理。2組TGF-β2、TGF-β3啟動子甲基化水平和mRNA相對表達量的比較均采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組胎鼠腭組織形態(tài)學觀察結果見圖1。GD13對照組和TCDD組胎鼠腭部形態(tài)無差異。GD14、GD15，對照組胎鼠雙側腭架抬高至舌體上方，并彼此接觸融合；而TCDD組胎鼠雙側腭架太小以至于無法彼此接觸融合，導致腭裂。

2.2 2組胎鼠腭組織TGF-β2、TGF-β3 mRNA相對表達量的比較見表3、4。與對照組相比，GD13～GD15 TCDD組胎鼠TGF-β2和TGF-β3 mRNA表達水平均降低。

A、C、E：對照組GD13、GD14、GD15；B、D、F：TCDD組GD13、GD14、GD15

表3 2組胎鼠腭組織TGF-β2 mRNA的相對表達量(n=3)

表4 2組胎鼠腭組織TGF-β3 mRNA的相對表達量(n=3)

2.3 2組GD14胎鼠腭組織中TGF-β2、TGF-β3啟動子甲基化水平比較見表5～9。2組TGF-β2和TGF-β3整體甲基化程度比較，差異均無統(tǒng)計學意義。但是與對照組相比，TCDD組TGF-β2的CpG10、CpG32.33.34位點甲基化水平降低，CpG14、CpG18.19、CpG25和CpG29甲基化水平升高；TGF-β3中CpG2.3、CpG16.17.18、CpG6甲基化水平升高，而CpG18甲基化水平降低。

表5 2組胎鼠TGF-β2、TGF-β3整體甲基化水平比較(n=3) %

表6 2組胎鼠TGF-β2片段1甲基化水平比較(n=3) %

表7 2組胎鼠TGF-β2片段2甲基化水平比較(n=3) %

表8 2組胎鼠TGF-β3片段1甲基化水平比較(n=3) %

表9 2組胎鼠TGF-β3片段2甲基化水平比較(n=3) %

3 討論

本研究中我們利用TCDD構造胎鼠腭裂模型，評估胎鼠腭組織中TGF-β2和TGF-β3的表觀遺傳調控及其在TCDD誘導腭裂過程中的作用。HE染色結果顯示TCDD組腭發(fā)育異常，這與先前的研究[7]結果一致。由于GD14是胎鼠腭發(fā)育過程中雙側腭架接觸融合的關鍵節(jié)點[8-9]，我們選取GD14胎鼠腭組織DNA進行TGF-β2和TGF-β3啟動子甲基化分析，結果顯示，盡管對照組和TCDD組TGF-β2、TGF-β3啟動子整體甲基化水平差異無統(tǒng)計學意義，但啟動子個別位點甲基化水平差異有統(tǒng)計學意義。有證據(jù)[10-11]表明，啟動子區(qū)CpG位點甲基化可以抑制基因表達，去甲基化則激活基因表達。本研究結果顯示，TGF-β2兩個片段共6個位點發(fā)生變化，其中4個位點甲基化水平升高，2個位點甲基化水平降低；TGF-β3兩個片段共4個位點發(fā)生變化，其中3個位點甲基化水平升高，1個位點甲基化水平降低。本研究中TCDD組胎鼠腭組織中TGF-β2和TGF-β3 mRNA相對表達量低于對照組。因此，我們推測TCDD導致的TGF-β2和(或)TGF-β3基因表達降低，可能與TGF-β2和(或)TGF-β3啟動子部分位點甲基化有關。

TGF-β2在胎鼠腭組織中的表達水平降低，這似乎并不足以引發(fā)腭裂，因為此前在TGF-β2基因敲除小鼠中腭裂僅表現(xiàn)出低于25%的外顯率[6]。Fox2基因敲除模型顯示腭架發(fā)育不良，作者間接地將其歸因于TGF-β2表達下降及Smad信號通路的作用[12]。綜上，我們推測TGF-β2可能不直接參與腭架的生長。

有研究[5]發(fā)現(xiàn)TGF-β3基因敲除小鼠表現(xiàn)出以中線上皮縫持續(xù)存在為特征的腭部融合失敗導致的腭裂，體外實驗[13]中也發(fā)現(xiàn)高劑量TCDD可使腭突間充質細胞中TGF-β3表達降低。本研究結果顯示，TCDD組胎鼠腭組織中TGF-β3 mRNA表達降低。由此我們推測，TGF-β3的表達降低似乎更有可能干擾了雙側腭部融合而不是阻礙腭架的生長。

綜上，TCDD可能通過誘導啟動子部分位點發(fā)生甲基化影響TGF-β2和(或)TGF-β3在腭架中的表達，進而影響腭架的生長(間接或直接通過TGF-β2)以及雙側腭部融合(直接通過TGF-β3)，從而導致腭裂的發(fā)生。本研究只探討了TGF-β2和TGF-β3基因水平的改變，未來我們將繼續(xù)深入探討蛋白水平的機制。