高媛 孟祥才 劉秀波 徐姣 馬偉 趙春建

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)(黑龍江中醫(yī)藥大學)(東北林業(yè)大學)

人參(PanaxginsengC. A. Meyer)栽培受到很多因素的制約，病害是其中最主要因素。人參病害以黑斑病、灰霉病、炭疽病、疫病等為常見的病害，且發(fā)生非常普遍。目前人參病害主要防治技術(shù)手段為化學防治，生長期一般7～10 d需要噴施1次化學農(nóng)藥，進行病害防治。然而，人參病原菌會對化學殺菌劑產(chǎn)生一定程度的抗藥性[1]，且人工栽培的人參被遮陰棚所覆蓋，葉片上的化學農(nóng)藥不能完全被雨水沖淋，殘留在葉片之上，嚴重影響人參藥材的質(zhì)量。中藥材農(nóng)藥殘留問題一直是制約中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]，綠色生態(tài)農(nóng)業(yè)中藥是中藥材產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必由之路[3]。

人參病原菌在人參生長環(huán)境中廣泛存在。植物發(fā)病的本質(zhì)原因多是高溫、高濕等環(huán)境變化導致菌落失衡，有益菌減少、病原菌增多。根據(jù)達爾文“物種競爭”理論，可通過人為施加有益菌，占領人參葉面的“空間”；或用益生菌拮抗病原菌；從而達到防病、治病的目的。近年來，芽孢桿菌作為一類優(yōu)勢菌種，成為生物防治領域關(guān)注度較高的研究對象。目前對枯草芽孢桿菌的應用研究相對較為成熟，已有大量試驗結(jié)果[4-9]證明，枯草芽孢桿菌，對于枯萎病、軟腐病、立枯病、根腐病、紋枯病、灰霉病、早疫病、青枯病等植物病害，均有較好的防治效果。特基拉芽孢桿菌，對稻瘟病的防治效果可達到防效范圍55.71%～83.33%[10]，可以降低鱷梨的炭疽病嚴重程度(41.9%)[11]。貝萊斯芽孢桿菌，對花生白絹病的防治效果可達66.15%[12]，對番茄產(chǎn)后灰霉病的防治效果可達到73.47%[13]，成為最新發(fā)現(xiàn)的潛力生防菌之一。同樣作為最新發(fā)現(xiàn)的潛力生防菌之一的地衣芽孢桿菌，對桃枝枯病菌具有明顯的抑制作用[14]，對棉苗立枯病、炭疽病、紅腐病的防治效果分別為60.42%、62.56%、41.47%[15]。已有研究證明，枯草芽孢桿菌對人參黑斑病及灰霉病均表現(xiàn)出良好的抑菌效率[16]，其他3種有潛力的生防菌還未被應用于人參病原菌的防治。

為此，本研究從2個不同的人參栽培基地選取健康無病變的人參植株葉片作為篩選生防菌的材料，應用選擇性分離法從人參葉片中分離芽孢菌，經(jīng)染色鑒定、菌落形態(tài)鑒定、顯微形態(tài)鑒定及基因序列分析，篩選出286株芽孢菌，其中枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)、地衣芽孢桿菌(B.Licheniformis)4種菌為優(yōu)勢菌種；制備復合芽孢桿菌制劑，4個菌種的菌株比例n(枯草芽孢桿菌)∶n(特基拉芽孢桿菌)∶n(貝萊斯芽孢桿菌)∶n(地衣芽孢桿菌)約為100∶60∶70∶40；分別用4種優(yōu)勢菌與復合芽孢桿菌做平板，進行對峙拮抗試驗，分析4種優(yōu)勢菌與復合芽孢桿菌對人參黑斑病和灰霉病防治效果。本研究開發(fā)可用于防治人參黑斑病、灰霉病的高效復合菌劑，旨在為有效彌補單一菌劑防治效果易受到環(huán)境影響而不穩(wěn)定的缺點、促進綠色人參中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料和方法

人參葉片采于黑龍江省沾河林業(yè)局和慶安縣，每產(chǎn)地在不同區(qū)域采集健康葉20余片。

1.1 人參葉片中芽孢菌的分離

在超凈工作臺內(nèi)，將人參葉片用消毒剪刀剪切成邊長為1～2 cm的方形碎片，放入裝有50 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，120 r/min振蕩1 h，置于保溫箱中63 ℃保溫處理4 h，殺滅非芽孢菌，無菌紗布濾除葉片后的懸液可得芽孢菌懸液，即待分離的樣本。

制備滅菌綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(CPDA)，倒入直徑為9 cm的滅菌培養(yǎng)皿制成綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)平板。吸取上述熱處理后的樣本0.5 mL均勻涂布于綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)平板，每瓶樣本取樣10次并涂布于10個綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)平板，將涂布好的培養(yǎng)平板置于37 ℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)平板上長出單菌落。無菌操作下，將每個單菌落分裝于2個滅菌離心管中，其中1份用于菌種鑒定和DNA測序分析，另一份用于后續(xù)研究。無菌操作下用挑取少量菌體樣本，涂抹于載玻片上，吹干。向載玻片滴加2滴質(zhì)量分數(shù)5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，微火上加熱染液，待出現(xiàn)蒸氣時計時，并維持5 min。待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。用質(zhì)量分數(shù)0.5%番紅水溶液復染2 min后，用緩流自來水沖洗至流出水無色為止。將載玻片晾干后用油鏡觀察，以菌體內(nèi)部存在墨綠色囊狀體作為判定芽孢菌的依據(jù)，確定分離獲得的菌株為芽孢菌，保留孔雀綠染色結(jié)果為芽孢菌的樣品，后續(xù)用16S rDNA序列分析法鑒定，確定其種屬。

1.2 人參葉片中芽孢菌的鑒定

對分離的樣品進行形態(tài)學鑒定，將純化后的菌種，均接種于新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上進行活化，相應菌種培養(yǎng)相應時間(天)，觀察不同菌種的菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地、紋飾、色素等生長情況進行鑒定；而后采用微量菌體制成水載玻片，觀察菌種的孢子生長，依據(jù)芽孢菌科圖解，對菌種進行歸屬類的鑒別，鑒別到屬。然后用16S rDNA序列分析法鑒定，根據(jù)測序結(jié)果，提交到NCBI Blast項目上進行基因序列比對，從而確定該待測芽孢菌菌株的種屬。

16S rDNA序列分析法鑒定步驟：①提取菌體基因組DNA；②聚合酶鏈式反應擴增16S rDNA特異引物；③純化擴增產(chǎn)物；④DNA測序、序列比對。

1.3 拮抗菌的篩選與平板對峙法對拮抗效果的檢測

分別純化培養(yǎng)上述分離鑒定的芽孢菌，培養(yǎng)條件：用綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)平板置于恒溫培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng)2 d，形成肉眼可見的小菌落；再分別接種到裝有液體綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基的錐形瓶振蕩培養(yǎng)，25 ℃、120 r/min搖床上培養(yǎng)36 h左右；待培養(yǎng)液中活菌濃度為2×109個/mL時停止培養(yǎng)；取其中單一菌種或它們的組合物作為后續(xù)拮抗試驗中的接種樣本。

在每一個綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)平板上設置試驗組和對照組2個區(qū)域；培養(yǎng)平板的左側(cè)接種黑斑病病原菌(作為對照組)；在培養(yǎng)平板的右側(cè)先接種黑斑病病原菌，再在病原菌接種點的上下左右4個方位間距1 cm接種芽孢菌或其組合物；然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)至72 h時分別測定試驗組和對照組黑斑病或灰霉病的病原菌的菌落直徑大小；根據(jù)試驗組和對照組2個區(qū)域病原菌菌落直徑的差別，判定芽孢菌或其組合物對病原菌的拮抗能力，試驗組病原菌菌落直徑越小說明芽孢菌或其組合物對病原菌的拮抗能力越強。

拮抗效率=[(對照組病原菌菌落直徑-試驗組病原菌菌落直徑)/對照組病原菌菌落直徑]×100%。

將篩選出的具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌用于生物防治菌。

1.4 田間試驗

試驗地點設在黑龍江中醫(yī)藥大學清河中藥材種子種苗基地(黑龍江省清河林業(yè)局育林林場)。人參莖單生，直立，4 a以上的人參4～6枚大小形狀相同的掌狀復葉輪生莖頂。選擇4枚葉及以上的人參20株，每株隨機選擇4片葉分別噴施代森錳鋅、撲海因、復合芽孢桿菌劑和空白處理。每間隔10 d噴施1次上述藥物，連續(xù)3次。在施藥后第5天，將2片人參黑斑病和1片人參灰霉病葉片(病斑直徑1 cm左右)放入500 mL礦泉水瓶中，震蕩1 min，制成致病菌液，然后立即噴在施藥的葉片上，每間隔10 d噴施1次致病菌液，連續(xù)3次。

質(zhì)量分數(shù)70%代森錳鋅(四川國光農(nóng)化股份有限公司)：500倍藥液噴施。

質(zhì)量分數(shù)50%撲海因(拜耳作物科學(中國)有限公司)：200倍藥液噴施。

復合芽孢桿菌(4個菌種的菌株比例n(枯草芽孢桿菌)∶n(特基拉芽孢桿菌)∶n(貝萊斯芽孢桿菌)∶n(地衣芽孢桿菌)約為100∶60∶70∶40)：菌液濃度為108個/mL，葉面噴施。

空白對照：不噴任何藥物。

計數(shù)每植株發(fā)病葉數(shù)和病情指數(shù)，與對照比較計算防治效果。以病斑面積占整個葉片面積比例(R)確定病情分級：0級為無病斑、1級為R≤5%、3級為5%50%以上。

病情指數(shù)={∑[(各級病株數(shù)×該病級值)/(調(diào)查總株數(shù)×9)]}×100。

防治效果=[(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參葉片中芽孢菌分離鑒定結(jié)果

從不同產(chǎn)地人參葉片中培養(yǎng)的芽孢菌主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)，沾河的樣品經(jīng)培養(yǎng)獲得110個菌落，慶安的樣品經(jīng)培養(yǎng)獲得176個菌落，共獲得286株(見表1)，其中：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)4種菌為優(yōu)勢菌種，枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的菌株比例為100∶56∶74∶40。

表1 不同產(chǎn)地人參葉片芽孢桿菌菌株數(shù)量

2.2 拮抗菌篩選與平板對峙法試驗結(jié)果

在人參黑斑病病原菌的菌落周圍的上下左右4個方位間距1 cm接種枯草芽孢桿菌后培養(yǎng)形成的菌落，進行平板拮抗試驗(見圖1)。培養(yǎng)條件：25 ℃，用綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板恒溫培養(yǎng)72 h。在人參黑斑病病原菌的菌落周圍的上下左右4個方位間距1 cm接種復合芽孢桿菌后培養(yǎng)形成的菌落，進行平板拮抗試驗(見圖2)。培養(yǎng)條件：25 ℃，用綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基平板恒溫培養(yǎng)72 h。

圖1 枯草芽孢桿菌拮抗抑制黑斑病病原菌

圖2 復合芽孢桿菌拮抗抑制黑斑病病原菌

枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和由4種芽孢桿菌組成的復合芽孢桿菌，分別對黑斑病病原菌、灰霉病病原菌做平板對峙試驗，分析4種芽孢桿菌與復合芽孢桿菌對黑斑病病原菌、灰霉病病原菌的抑制作用(見表2)。

由表2可見：4種芽孢桿菌與復合芽孢桿菌對黑斑病病原菌均有不同程度的抑制作用，4種芽孢桿菌中，枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(抑制率為78.69%)、貝萊斯芽孢桿菌和特基拉芽孢桿菌次之、地衣芽孢桿菌的抑制作用最弱。復合芽孢桿菌抑制效果優(yōu)于單一使用的其中任何1種，其抑制率高達89.74%，抑制率比枯草芽孢桿菌相對高出14.04%、比地衣芽孢桿菌相對高出27.96%。

由表2可見：4種芽孢桿菌與復合芽孢桿菌對灰霉病病原菌的抑制作用與對黑斑病病原菌的抑制作用非常相似，但對灰霉病病原菌的抑制效果弱于對黑斑病病原菌的抑制效果；其抑制率由大到小依次為枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌。復合芽孢桿菌抑制效果優(yōu)于單一使用的其中任何一種，復合芽孢桿菌的抑制率比枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌分別相對高出6.33%、23.38%。說明4種優(yōu)勢拮抗菌聯(lián)合使用(按比例制成芽孢菌的復合物)，能夠顯著提高對人參黑斑病和灰霉病病原菌的抑制作用。

表2 4種芽孢桿菌與復合芽孢桿菌對黑斑病、灰霉病病原菌的抑制效果

2.3 復合芽孢桿菌對人參黑斑病和灰霉病的防治結(jié)果

在黑龍江中醫(yī)藥大學清河中藥材種子種苗基地(黑龍江省清河林業(yè)局育林林場)進行試驗，每間隔10 d噴施1次上述藥物，連續(xù)3次，統(tǒng)計復合芽孢桿菌田間防治效果(見表3)。由表3可見：復合芽孢桿菌對黑斑病的防治效果較好(達到85.9%)，高于撲海因，與代森錳鋅接近無顯著性差異；復合芽孢桿菌對灰霉病的防治效果達53.8%，低于撲海因，與代森錳鋅無顯著性差異。復合芽孢桿菌對黑斑病與灰霉病總體防治效果為65.1%，與代森錳鋅總體效果無顯著性差異；雖然低于撲海因的效果，但是復合芽孢桿菌沒有農(nóng)藥殘留，不會對環(huán)境造成影響，是一種環(huán)境友好型的生物菌劑。

表3 復合芽孢桿菌田間防治效果

3 結(jié)論與討論

代森錳鋅和撲海因是人參黑斑病和灰霉病的常用農(nóng)藥，兩種農(nóng)藥均為保護性藥劑，不具有內(nèi)吸性。本研究采用復合菌劑防治人參2種常見病害，防治效果與代森錳鋅接近，略弱于撲海因。人參是藥食兩用名貴藥材，不僅在國內(nèi)需要量較大，而且大量出口國外，人參農(nóng)藥殘留問題一直是人參商品銷售的關(guān)注熱點。本復合菌劑的開發(fā)應用有利于促進綠色人參的生產(chǎn)發(fā)展。

生態(tài)位是指一個種群在生態(tài)系統(tǒng)中，在時間空間上所占據(jù)的位置及其與相關(guān)種群之間的關(guān)系與作用，是一個物種的食物、習性、棲息地等生活要素的集合。不同菌種的生活要素有重合部分，所以雖然有很多物種能夠在特定環(huán)境中生存，任一環(huán)境因素的改變都可能會有利于其中的某些生物物種生存，而對其他生物不利。本研究采用的生防菌與人參常見病害的黑斑病菌、灰霉病菌均生長在人參葉片上，生態(tài)位極為接近。根據(jù)達爾文生物競爭理論，群落中不同物種之間、種內(nèi)和種間的個體之間，無時無刻不在進行著競爭，人為增加生防菌的數(shù)量，占據(jù)人參葉片一定空間，減少病原菌生存可用的葉面資源，從而減少病原菌的數(shù)量，使病害得到有效控制。埃爾頓(Charles Sutherland Elton)的經(jīng)典觀念認為，結(jié)構(gòu)簡單的群落種群越復雜，外來物種越不容易入侵[17]。事實上，外來物種容易入侵單一種群，如種植的農(nóng)作物種群單一，病原菌容易侵入，病害嚴重，這是栽培人參容易發(fā)病的原因之一。從另一角度看，人參葉片微生物種群多樣性豐富，病原菌也不易侵入。因此，本研究采用枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌4種菌為優(yōu)勢菌種進行生物防治。與化學防治相比，采用對病原菌的拮抗菌株可更加有效防止病原菌的侵入，同時還可以達到綠色環(huán)保的生態(tài)效果。