林 巍，曲國強，劉曉蘭，任 健

(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006)

隨著我國經(jīng)濟的高速發(fā)展，酒類產(chǎn)量和消費量逐年增高，酒精性腦病的發(fā)病率呈逐年增長趨勢，飲酒導(dǎo)致的腦損傷不僅嚴(yán)重影響人體身心健康，而且對社會也造成嚴(yán)重危害[1]。長期過量飲酒是腦損傷、腦血管病的主要病因，也是誘發(fā)腦血管病突發(fā)(如腦梗死)及老年癡呆的重要危險因素[2]。目前，有關(guān)酒精性腦病的臨床治療主要采取戒酒、營養(yǎng)支持和對癥治療等綜合療法，其目的就是減輕酒精性腦病臨床癥狀，阻止酒精性腦病的進(jìn)一步發(fā)展。由于目前慢性酒精中毒所致腦損傷缺乏有效的治療，因而預(yù)防酒精中毒對腦組織的損傷至關(guān)重要。所以研究開發(fā)拮抗酒精性腦損傷的天然保健食品是目前醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的熱點。

玉米蛋白多肽鏈中存在多個功能區(qū)，經(jīng)過蛋白酶控制性酶解之后，生理活性得到顯著釋放。目前已發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物具有醒酒保肝、降血壓、抗疲勞、抗氧化等多種活性[3-5]。其中玉米肽的醒酒活性研究最早，Yamaguchi等[6-8]率先報道了玉米肽具有促進(jìn)乙醇代謝的醒酒作用。國內(nèi)眾多學(xué)者也分別制備出具有體外激活乙醇脫氫酶活性的玉米肽[9-12]；體內(nèi)實驗的研究主要集中在玉米肽的解酒效果以及玉米肽對酒精性肝損傷的保護作用[13-15]，而忽視了中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。本實驗室研制開發(fā)的玉米肽不僅具有醒酒作用，并且能夠減輕酒精對神經(jīng)系統(tǒng)的刺激，緩解醉酒后頭痛。但是玉米肽如何降低酒精對腦組織的損傷作用，如何改善酒后頭痛的機制尚未清楚。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討玉米肽對慢性酒精性腦損傷小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平及促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，以期找到玉米肽改善酒精性腦損傷的客觀依據(jù)，從而對長期大量飲酒的人群采取相應(yīng)的保護措施，為預(yù)防腦損傷的天然保健食品的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級ICR小鼠((18±2)g，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(吉)2015—0005)，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米肽粉(蛋白質(zhì)含量45.3%，其余為淀粉，肽分子質(zhì)量<1 kDa)，依據(jù)發(fā)明專利ZL 201910249682.2實驗室自制；基礎(chǔ)鼠糧，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司；活性氧簇(ROS)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、γ干擾素(IFN-γ)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性和核因子κB(NF-κB)試劑盒，購于上海江萊生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

MT70擠壓膨化機，濟南美騰機械設(shè)備有限公司；EnSpire全波長多功能酶標(biāo)儀，美國珀金埃爾默公司；CF15RXII型高速低溫離心機，日本日立公司；1X73倒置熒光顯微鏡，奧林巴斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)與分組

加肽鼠糧的制作：以1 g/kg中劑量玉米肽為例說明添加玉米肽鼠糧的制作。首先，用粉碎機將基礎(chǔ)鼠糧粉碎，之后將玉米肽與粉碎后的基礎(chǔ)鼠糧以質(zhì)量比1∶1 000用攪拌機混合均勻，最后將混合后的飼料利用擠壓膨化機制作成具有一定硬度的圓柱體飼料。高劑量玉米肽和低劑量玉米肽的制作，除質(zhì)量比分別為2∶1 000和0.5∶1 000之外，其余過程均與中劑量玉米肽的制作過程一致。

ICR小鼠80只(雌雄各半)，隨機分為5組，每組16只，分別為正常對照組、慢性酒精性腦損傷模型組(酒精模型組)、玉米肽高劑量組(2 g/kg)、玉米肽中劑量組(1 g/kg)、玉米肽低劑量組(0.5 g/kg)。慢性酒精性腦損傷模型建立參考 Turchan等[16]方法。將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，正常對照組飲用蒸餾水，飼喂基礎(chǔ)鼠糧；給酒精模型組小鼠依次飲用體積分?jǐn)?shù)為6%、12%、15%、20%的酒精溶液，飼喂基礎(chǔ)鼠糧，其中體積分?jǐn)?shù)為6%、12%、15%的酒精溶液分別飲用1周，體積分?jǐn)?shù)為20%的酒精溶液一直飲用到實驗結(jié)束；玉米肽實驗組按分組分別飼喂加肽鼠糧，飲用酒精溶液同酒精模型組。各組小鼠皆自由攝食，實驗周期為5個月。實驗結(jié)束后，小鼠頸椎脫臼處死，取腦組織，一半用于病理組織學(xué)觀察，一半用于腦組織中各項指標(biāo)的測定。

1.2.2 腦組織的病理組織學(xué)觀察

小鼠脫臼處死后，取出腦組織，留取雙側(cè)大腦半球，福爾馬林固定，制成 HE染色切片并做病理組織學(xué)觀察。

1.2.3 腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定

小鼠脫臼處死后迅速取腦組織，稱重，加入一定量的pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2～8℃。加入一定量的PBS，用勻漿器將標(biāo)本充分勻漿。用低溫離心機以2 000 r/min離心20 min。仔細(xì)收集上清，分裝待檢測。按試劑盒說明書進(jìn)行腦組織中ROS、MDA、GSH含量和GST、GSH-Px、T-SOD活性的測定。

1.2.4 腦組織中促炎細(xì)胞因子含量的測定

腦組織處理同1.2.3，按試劑盒說明書進(jìn)行IFN-γ、IL-6、TGF-β1、TNF-α含量的測定。

1.2.5 腦組織中凋亡相關(guān)指標(biāo)的測定

腦組織處理同1.2.3，按試劑盒說明書進(jìn)行Caspase-3活性和NF-κB含量的測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Duncan’s多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗。P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米肽對小鼠酒后腦組織病理組織學(xué)的影響(見圖1)

由圖1可知，與正常對照組小鼠腦組織相比，酒精模型組小鼠腦組織病理切片可見軟腦膜充血(100倍可見，未展示)，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，錐體神經(jīng)細(xì)胞固縮、染色加深，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多。玉米肽低劑量組軟腦膜充血略減輕，神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞病變也顯著減輕。玉米肽中劑量組軟腦膜充血明顯減輕，但仍可見一定的神經(jīng)細(xì)胞固縮和部分神經(jīng)細(xì)胞溶解，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生減輕。玉米肽高劑量組軟腦膜充血，可見明顯的神經(jīng)細(xì)胞固縮和部分神經(jīng)細(xì)胞溶解，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生減輕。3個劑量組的玉米肽對酒精引起的腦損傷有不同程度的減輕作用。

圖1 小鼠腦組織病理組織學(xué)觀察結(jié)果(400×)

2.2 玉米肽對小鼠酒后腦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響

2.2.1 玉米肽對小鼠酒后腦組織中ROS含量的影響(見圖2)

注：不同小寫字母表示有顯著性差異(P<0.05)。下同

由圖2可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中ROS含量顯著升高(P<0.05)，表明酒精可引起氧化應(yīng)激，增加小鼠酒后腦組織細(xì)胞中ROS含量；與酒精模型組相比，玉米肽低、中、高劑量組中ROS含量顯著降低(P<0.05)，表明玉米肽可降低小鼠酒后神經(jīng)細(xì)胞中ROS含量，減輕酒精導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

2.2.2 玉米肽對小鼠酒后腦組織中MDA含量的影響(見圖3)

圖3 玉米肽對小鼠酒后腦組織中MDA含量的影響

由圖3可知：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中MDA含量顯著增加(P<0.05)，表明酒精攝入增加了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的形成；與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組中MDA含量皆顯著減少(P<0.05)，其中高劑量組恢復(fù)到正常對照組水平(P>0.05)，表明玉米肽可以減輕酒精及其代謝物乙醛導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化。

2.2.3 玉米肽對小鼠酒后腦組織中GSH、GSH-Px及GST水平的影響(見圖4)

圖4 玉米肽對小鼠酒后腦組織中GSH、GSH-Px及GST水平的影響

由圖4可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中GSH含量顯著減少，GST和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組GSH含量顯著增加(P<0.05)，玉米肽中劑量組GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)，玉米肽低、中、高劑量組GST活性皆顯著提高(P<0.05)。這表明玉米肽可通過提高腦組織中GSH的含量，恢復(fù)GST和GSH-Px活性，緩解酒精及其代謝物對神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和自由基損傷作用。

2.2.4 玉米肽對小鼠酒后腦組織中T-SOD活性的影響(見圖5)

由圖5可知：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中T-SOD活性顯著降低(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組中T-SOD活性顯著提高(P<0.05)。小鼠酒后T-SOD水平降低可能與其被氧化自由基大量消耗有關(guān)，同時脂質(zhì)過氧化物可抑制T-SOD活性，玉米肽能通過自身較強的抗氧化活性抑制脂質(zhì)過氧化，從而緩解乙醇導(dǎo)致的T-SOD活性下降，提高細(xì)胞的抗氧化能力，減輕自由基對神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

圖5 玉米肽對小鼠酒后腦組織中T-SOD活性的影響

2.3 玉米肽對小鼠酒后腦組織中促炎細(xì)胞因子含量的影響

2.3.1 玉米肽對小鼠酒后腦組織中IL-6含量的影響(見圖6)

圖6 玉米肽對小鼠酒后腦組織中IL-6含量的影響

由圖6可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中IL-6含量顯著升高(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽中、高劑量組IL-6含量顯著降低(P<0.05)，其中玉米肽高劑量組與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.3.2 玉米肽對小鼠酒后腦組織中TGF-β1含量的影響(見圖7)

圖7 玉米肽對小鼠酒后腦組織中TGF-β1含量的影響

由圖7可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中TGF-β1含量顯著升高(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽低、中、高劑量組TGF-β1含量顯著降低(P<0.05)，但未恢復(fù)到正常對照組水平。

2.3.3 玉米肽對小鼠酒后腦組織中IFN-γ含量的影響(見圖8)

圖8 玉米肽對小鼠酒后腦組織中IFN-γ含量的影響

由圖8可知：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽低劑量組沒有顯著變化，但玉米肽中、高劑量組IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，恢復(fù)到正常對照組水平(P>0.05)。

2.3.4 玉米肽對小鼠酒后腦組織中TNF-α含量的影響(見圖9)

圖9 玉米肽對小鼠酒后腦組織中TNF-α含量的影響

由圖9可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中TNF-α含量顯著升高(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽低、中、高劑量組中TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，其中高劑量組恢復(fù)到正常對照組水平(P>0.05)。

2.4 玉米肽對小鼠酒后腦組織中凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響

2.4.1 玉米肽對小鼠酒后腦組織中Caspase-3活性的影響(見圖10)

由圖10可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中Caspase-3活性顯著升高(P<0.05)，表明細(xì)胞凋亡途徑在酒精誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷中發(fā)揮作用；與酒精模型組相比，玉米肽低、中、高劑量組中Caspase-3活性未見顯著改變(P>0.05)，表明玉米肽對酒精誘導(dǎo)的Caspase-3表達(dá)沒有調(diào)節(jié)作用。

2.4.2 玉米肽對小鼠酒后腦組織中NF-κB含量的影響(見圖11)

圖11 玉米肽對小鼠酒后腦組織中NF-κB含量的影響

由圖11可見：與正常對照組相比，酒精模型組小鼠腦組織中NF-κB含量顯著升高(P<0.05)；與酒精模型組相比，玉米肽低、中劑量組NF-κB含量未見顯著改變，但玉米肽高劑量組NF-κB含量顯著降低(P<0.05)。這表明高劑量的玉米肽對酒后NF-κB含量具有一定的調(diào)節(jié)作用，可以通過抑制NF-κB表達(dá)，從而降低多種促炎因子的生成，減輕酒后腦組織炎癥反應(yīng)，緩解酒精對腦組織的損傷作用。

3 結(jié) 論

玉米肽對小鼠酒精性腦損傷具有顯著的改善作用，能夠提高腦組織中GSH含量，增加GST、GSH-Px和T-SOD活性，降低MDA含量，減少神經(jīng)細(xì)胞中ROS含量；同時玉米肽還能夠顯著降低腦組織中TNF-α、IL-6、IFN-γ、TGF-β1和NF-κB水平。由此可知玉米肽不僅可調(diào)節(jié)酒精引起的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，而且還通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子水平從而改善慢性酒精性腦損傷，提示飲酒前食用玉米肽制品，可以減輕酒精對大腦的毒性作用。但是本研究對玉米肽保護腦組織的具體分子機理尚不清楚，還有待進(jìn)一步深入研究。