王曉丹, 李 杰, 劉 宇, 丁廣洲,*

(1.黑龍江大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 哈爾濱 150080; 2.黑龍江省甜菜技術(shù)創(chuàng)新中心, 哈爾濱 150080; 3.國家糖料改良中心, 哈爾濱 150080)

0 引 言

對于所有生命體來說，磷(P)是磷脂、核酸和 ATP 的主要組成元素，也是酶反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)節(jié)因子[1]。植物以無機磷酸鹽(Pi)的形式獲取磷，由于無機磷酸鹽分布不均勻，溶解性低，在土壤中存在很低的水平(<10 μM)。因此，施用化肥已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中確保作物生產(chǎn)力的做法[2-3]。這導(dǎo)致了不可再生的磷礦資源巖儲量迅速下降，如按照目前的速度開采，只可持續(xù)50～100 a。磷肥的過度使用造成土壤中難溶性磷的積累，威脅到糧食生產(chǎn)，以及土壤磷流入水體后導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，帶來了系列生態(tài)環(huán)境問題[4]。因此，挖掘促進磷高效吸收的基因資源，探討植物高效吸收磷素的分子機制，提高低磷條件下植物吸收磷素的能力，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟價值[5]。

磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白能夠調(diào)節(jié)植物對磷的吸收和轉(zhuǎn)運，對提高植物磷利用率具有重要作用。在植物中，磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(PT)被分為 PHT1，PHT2，PHT3，PHT4，PHT5 和 PHO1 家族[6]。PHT1和PHO1 是質(zhì)膜磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白，PHT2，PHT3，PHT4，PHT5 是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白[7-9]。Wang D等首次從擬南芥[8]中克隆出植物的PHT1家族基因，并與釀酒酵母 PHO84進行了序列同源性分析。近年來在水稻、煙草、馬鈴薯、大豆、大麥、玉米、小麥、番茄、高粱和楊樹等植物體中均發(fā)現(xiàn)了PHT1s的同源性，如擬南芥的AtPT1;1、AtPT1;4、小麥TaPT1;1、TaPT1;3、大豆GmPT1;8、水稻OsPT1;8等在植物體內(nèi)的表達(dá)模式及對植物吸收的影響已被報道。PHO1蛋白主要參與 Pi 從根部向地上轉(zhuǎn)運，具有長的細(xì)胞質(zhì) N-末端，含有3部分SPX結(jié)構(gòu)域，具有EXS 結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞質(zhì)C-末端和6個跨膜螺旋。EXS 結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)PHO1的信號傳導(dǎo)能力和Pi轉(zhuǎn)運活性[10-11]。

甜菜(Beta vulgaris L.)屬藜科甜菜屬，作為世界上最重要的糖料作物之一，且在我國北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[12]。甜菜種植主要分布在高寒地區(qū)，特別是東北地區(qū), 土壤肥沃，有機磷含量高, 但直接可利用的游離無機正磷酸鹽(土壤有效磷)含量一直處于較低水平[13]。正由于土壤中有效磷含量有限[14]，高效利用磷的甜菜品種對于甜菜的大規(guī)模生產(chǎn)和新品種的選育與開發(fā)具有重要意義。迄今為止，低磷脅迫下的甜菜生理響應(yīng)已有報道，但是涉及甜菜耐低磷相關(guān)基因的表達(dá)模式研究較少，對甜菜PTs磷酸鹽蛋白基因家族的研究鮮見報道。本研究從甜菜中克隆出磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因BvPT1;4和BvPHO1，并運用生物信息學(xué)方法對BvPT1;4和BvPHO1蛋白的理化性質(zhì)分析，對甜菜磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因深層次的功能研究具有一定的借鑒作用，同時為培養(yǎng)甜菜的優(yōu)良品種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

以甜菜磷高效品種‘B8033’為材料，為催芽選取飽滿、大小均勻的甜菜種子浸泡過夜(12 h)。在1∶600的福美霜溶液浸泡6 h, 然后用蒸餾水洗凈備用。將種子放在72孔穴盤中培養(yǎng)至子葉完全展平后開始移苗，將甜菜幼苗移入盛有改良版1/2Hougland完全營養(yǎng)液玻璃槽中。在溫度 25 ℃、光照16 h、黑暗8 h、濕度25%的條件下培養(yǎng)20 d。

1.2 基因的克隆

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI和轉(zhuǎn)錄組的序列數(shù)據(jù)來獲得甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計特異性引物(表1)，將設(shè)計好的引物送至上海生工生物股份有限公司合成。

表1 甜菜磷轉(zhuǎn)運蛋白基因克隆所用引物

1.2.2 RNA提取和cDNA合成

取適量甜菜幼嫩葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮充分研磨。采用Trizol法提取甜菜的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。利用核酸蛋白儀Nanodrop2000測定OD260和 OD280，根據(jù) OD260/OD280比值的質(zhì)量。按照TIANGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟獲得cDNA。

1.2.3 甜菜BvPT1;4基因的克隆和測序

由反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用引物進行擴增。25 μL按照說明書設(shè)置反應(yīng)體系，為：PrimeSTAR Max Premix(2×)12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O為9.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，變性-退火-延伸為1個循環(huán)，連續(xù)30個循環(huán)，然后在 72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進行1%凝膠電泳檢測，回收目的片段，-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴增產(chǎn)物進行純化后與pMD19-T Vector連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過菌落PCR檢測后，挑選陽性克隆菌液送至上海生工進行測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過在線軟件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的氨基酸組成、正負(fù)電荷殘基數(shù)、親水平均系數(shù)等理化性質(zhì)[10]，使用跨膜螺旋預(yù)測工具TMHNM Serverv2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用 NCBI 中的 CDD 數(shù)據(jù)庫(conserved domain database)預(yù)測甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用Blastp在線工具查找甜菜BvPT1;4和BvPHO1蛋白的同源氨基酸序列，并使用DNAMAN 7.0軟件多重比對同源氨基酸序列；利用軟件MEGA7制作進化樹。利用軟件Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測BvPT1;4和BvPHO1蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用軟件SignalP(http://ww w.cb s.dtu.dk/services/SignalP/)在線預(yù)測與BvPT1;4和BvPHO1蛋白的信號肽；用SWISSMODEL(https://swiss model.expasy.org/interactive)在線預(yù)測工具預(yù)測BvPT1;4和BvPHO1蛋白三級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用網(wǎng)站NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/servic-es/NetPhos/)預(yù)測BvPT1;4和BvPHO1蛋白的磷酸化位點；利用WOLFPSORT(https://www.genscript.com/tools/wolf-psort)預(yù)測BvPT1;4和BvPHO1蛋白的亞細(xì)胞定位信息[15-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜幼苗RNA的的提取

Trizol法提取甜菜幼苗總RNA，采用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1(a)，提取的RNA 28S、18S和5S條帶清晰表明RNA質(zhì)量良好。分光光度計檢測RNA的A260/A280比值在1.9～2.0，說明RNA純度較高，滿足后續(xù)實驗要求。

2.2 甜菜BvPT1;4和BvPHO1基因的擴增

以上述提取的甜菜幼苗RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設(shè)計的引物進行基因擴增。擴增結(jié)果見圖1(b,c)。由圖1可見，甜菜BvPT1;4基因PCR擴增獲得產(chǎn)物長度約為1 600 bp,BvPHO1基因產(chǎn)物長度約為2 400 bp。切膠回收，克隆轉(zhuǎn)化，獲得測序結(jié)果BvPT1;4基因為1 581 bp，BvPHO1基因為2 394 bp?；虍a(chǎn)物的大小與引物設(shè)計時基因產(chǎn)物相符。

圖1 甜菜幼苗總RNA電泳檢測(a)和甜菜PT基因基擴增 M:2 000 bp DNA ladder(b,c)

2.3 甜菜PT基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測分析

甜菜PT蛋白理化性質(zhì)分析見表2。BvPHO1和BvPT1;4蛋白分別編碼797、526個氨基酸，分子量分別為91 910.50 Da、57 859.43 Da。理論等電點(pI)分別為9.24、8.76，均大于7，為堿性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。相對較高的脂肪系數(shù)可以維持蛋白質(zhì)良好的穩(wěn)定性，有助于在不同環(huán)境中發(fā)揮正常的功能?？偲骄H水性分析表明BvPHO1的值為負(fù)數(shù)，說明BvPHO1為親水性蛋白，BvPT1;4的值為正數(shù)，說明BvPT1;4為疏水性蛋白。

表2 甜菜PT蛋白理化性質(zhì)分析

2.4 甜菜PT基因編碼蛋白疏水性、磷酸化位點、信號肽、亞細(xì)胞定位預(yù)測分析

利用在線軟件ProtScale預(yù)測BvPHO1和BvPT1;4編碼蛋白的親疏水性見圖2。由圖2可見，BvPHO1蛋白在第385位親水性最強，在第532位疏水性最強；BvPT1;4蛋白在第515位親水性最強，在第472位疏水性最強。BvPHO1和BvPT1;4蛋白氨基酸的分值分別為負(fù)值和正值，則推斷BvPHO1和BvPT1;4分別為親水和疏水蛋白，與所預(yù)測的理化性質(zhì)結(jié)果一致。甜菜BvPHO1蛋白中共87個氨基酸磷酸化位點，其中有55個絲氨酸，23個蘇氨酸和9個酪氨酸。甜菜BvPT1;4蛋白含有25個絲氨酸磷酸化位點，23個蘇氨酸磷酸化位點和6個酪氨酸磷酸化位點，共54個磷酸化位點見圖3。兩者均發(fā)生在絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸上，且磷酸化位點個數(shù)都是絲氨酸最多。推測BvPHO1和BvPT1;4蛋白可通過其磷酸化修飾調(diào)控其活性，與甜菜PT的功能相關(guān)。BvPHO1和BvPT1;4蛋白均不存在信號肽，可推測不是分泌蛋白。甜菜PT蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果，BvPHO1和BvPT1;4在質(zhì)膜、葉綠體和細(xì)胞核中均可能存在。其中BvPHO1在質(zhì)膜中存在的概率為71.4%，在細(xì)胞核中存在的概率為14.3%；BvPT1;4在細(xì)胞核中存在的概率為71.4%，在葉綠體中存在的概率為21.4%。

圖2 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白親/疏水性預(yù)測

圖3 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白磷酸化位點預(yù)測

2.5 甜菜PT基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

甜菜PHT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析表明：甜菜BvPHO1蛋白具有高度保守的SPX和EXS 超家族結(jié)構(gòu)域，BvPT1;4蛋白的保守結(jié)構(gòu)域為2A0109，這兩個結(jié)構(gòu)域為磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族的必要結(jié)構(gòu)，發(fā)揮轉(zhuǎn)運蛋白的功能。通過對甜菜PHT蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測，得知甜菜BvPHO1和BvPT1;4蛋白分別有7、11個跨膜結(jié)構(gòu)域，均為跨膜蛋白(圖4)。對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，在蛋白BvPHO1和BvPT1;4中，α-螺旋結(jié)構(gòu)共計分別為445、258個氨基酸,占比分別為55.83%、49.05%；延伸主鏈結(jié)構(gòu)最少，分別為64、82個氨基酸，僅占8.03%、15.59%；無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)共計分別為264、168個氨基酸,分別占33.12%、31.94%。甜菜BvPHO1、BvPT1;4蛋白三級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致(圖5)。

圖4 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

圖5 BvPHO1和 BvPT1;4蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.6 甜菜PT基因編碼蛋白系統(tǒng)進化分析

為研究甜菜BvPHO1和BvPT1;4與其它物種磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的進化關(guān)系，利用NCBI的BlastP工具分析甜菜BvPHO1和BvPT1;4蛋白與其相似度較高的序列進行構(gòu)建系統(tǒng)進化[15]。進化樹分析結(jié)果表明，甜菜BvPHO1蛋白與藜麥(Chenopodium quinoa)、菠菜(Spinacia oleracea)、芝麻(Sesamum indicum)、小果咖啡(Coffea arabica)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白親緣關(guān)系最近。BvPT1;4蛋白與藜麥(Chenopodium quinoa)、菠菜(Spinacia oleracea)、杜鵑(Rhododendron simsii)、圓葉杜鵑(Rhododendron williamsianum)的高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白親緣關(guān)系較近。

3 討 論

通過克隆甜菜BvPHO1和BvPT1;4基因并且對該基因及其編碼的蛋白進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)BvPHO1蛋白含有PHO1家族蛋白中高度保守的SPX(SYG1/PHO81/XPR1)-EXS結(jié)構(gòu)域，此類結(jié)構(gòu)域已經(jīng)在擬南芥和水稻的液泡Pi轉(zhuǎn)運蛋白中被發(fā)現(xiàn)，以維持Pi穩(wěn)態(tài)。BvPT1;4蛋白含有526個氨基酸殘基，蛋白分子質(zhì)量為58.1 ku，等電點 8.76，是一個定位在質(zhì)膜上疏水性、無信號肽的非分泌性蛋白，含有高親和力磷酸轉(zhuǎn)運蛋白典型的 11個跨膜域和一個大親水環(huán)的跨膜結(jié)構(gòu)。甜菜作為世界上最重要的糖料作物之一，且在我國北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，同時也是最具競爭力和潛力的經(jīng)濟作物。正由于土壤中有效磷含量有限，高效利用磷的甜菜品種對于甜菜的大規(guī)模生產(chǎn)和新品種的選育與開發(fā)具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究通過克隆甜菜BvPHO1和BvPT1;4基因并且對該基因及其編碼的蛋白進行生物信息學(xué)分析，BvPHO1蛋白含有SPX(SYG1/PHO81/XPR1)-EXS結(jié)構(gòu)域，對維持植物體內(nèi)Pi穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。BvP71;4蛋白具有高親和力，可有效利用土壤中的磷元素。研究結(jié)果為進一步探索甜菜PT基因深層次的功能研究提供方向，也為培養(yǎng)甜菜的改良品種提供了候選基因，具有一定的學(xué)術(shù)價值。