蔡琨，楊雅楠*，李旭文，姜晟，卜亞謙，肖倩倩，朱冰清

(1. 江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210019；2. 江蘇省環(huán)境科學(xué)研究院，江蘇 南京 210036)

魚類作為水生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的頂層生物群落，活動(dòng)能力強(qiáng)，水體分布范圍廣，其在水生態(tài)系統(tǒng)中的分布特征和種群數(shù)量變化可以較好地反映水生態(tài)環(huán)境狀況，是水生態(tài)系統(tǒng)中能夠?qū)λ|(zhì)及水生態(tài)安全與健康做出靈敏響應(yīng)的重要生物要素。現(xiàn)有的傳統(tǒng)魚類群落監(jiān)測方法主要包括網(wǎng)具捕撈、水下聲吶探測、水下攝影、市場調(diào)查、漁民座談以及根據(jù)一些物種的資源量估計(jì)其他物種的資源量等[1]。目前，科研和監(jiān)測單位主要采用定點(diǎn)網(wǎng)具捕撈方法，對捕獲物進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，以提供魚類組成、豐度及魚類種群年齡結(jié)構(gòu)的信息。但該方法既具有侵入性和破壞性，還需要基于分類學(xué)專業(yè)知識對標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[2]，對監(jiān)測技術(shù)人員依賴性強(qiáng)，監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)化難以實(shí)行。

近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展和人口的不斷增長，江蘇省各流域水生態(tài)系統(tǒng)健康受到較大影響[3]。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通告，自2020年1月1日起，開始實(shí)施長江“十年禁漁”計(jì)劃(洪澤湖、駱馬湖等主要水體均執(zhí)行該政策)，需要采用高效、經(jīng)濟(jì)且破壞性較小的方法來開展魚類群落調(diào)查。

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用于水生生物監(jiān)測。環(huán)境DNA(eDNA)指環(huán)境中游離的DNA分子，即生物通過細(xì)胞脫落、糞便、唾液、配子和分泌物等方式向環(huán)境中分泌的游離DNA[4]。盡管eDNA技術(shù)是一種相對較新的調(diào)查方法，但其已被證明在生物多樣性和資源量監(jiān)測中具有巨大的潛力[5-7]。由于eDNA監(jiān)測方法具有易標(biāo)準(zhǔn)化、高通量等特性，可以通過針對不同物種的靶向監(jiān)測、更大范圍取樣、提高分類結(jié)果分辨率等途徑，提高對生物群落監(jiān)測評估的準(zhǔn)確性[8-9]。

現(xiàn)采用eDNA技術(shù)，對江蘇省域尺度開展高密度點(diǎn)位的魚類群落監(jiān)測，探索了該方法應(yīng)用于水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測、評估和管理的適用性、可行性和易用性，以期為流域生態(tài)狀況評估工作提供支撐。

1 材料與方法

1.1 采樣時(shí)間及點(diǎn)位設(shè)置

江蘇省位于中國東部沿海，地處長江流域和淮河流域下游。根據(jù)江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心生態(tài)遙感解譯結(jié)果，全省水域面積約為1.73×104km2，占全省總面積的16%。江蘇省水域共有長江、太湖、淮河和近岸海域4個(gè)主要流域水體[3]。于2020年4—5月，采集148個(gè)地表水監(jiān)測斷面的樣品，覆蓋全省13個(gè)設(shè)區(qū)市，按流域范圍劃分，淮河流域75個(gè)，太湖流域40個(gè)，長江流域33個(gè)(圖1)。

1.2 樣品采集及前處理

以S8245豎式水樣采集器(嘉興市遠(yuǎn)航環(huán)保教育儀器有限公司)采集水下20 cm左右的表層水，裝入500 mL的Nalgene PE瓶(美國Thermo Fisher公司)后暫時(shí)存放于-4 ℃的避光冷藏箱中，8 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，以ROCKER 410隔膜真空泵(中國臺灣洛科儀器股份有限公司)將水樣過濾到0.45 μm的親水性尼龍膜上(美國Millipore公司)，濾膜裝入5 mL的離心管中，于-20 ℃保存[2]。

圖1 148個(gè)地表水?dāng)嗝纥c(diǎn)位分布

1.3 DNA提取及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

采用 DNeasy PowerWater Kit試劑盒(德國Qiagen公司)提取濾膜上富集的水樣eDNA。采用魚類生物多樣性監(jiān)測試劑盒(南京易基諾環(huán)?？萍加邢薰?擴(kuò)增12S rDNA基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增體系為50 μL：包括25 μL 混合緩沖液，3 μL 引物，2 μL DNA，20 μL去離子水。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，35個(gè)循環(huán)反應(yīng)，95 ℃變性15 s，62.4 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s， 72 ℃最后延伸5 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，之后用MinElute PCR Purification Kit試劑盒(德國Qiagen公司)純化樣品，用Qubit 4核酸/蛋白質(zhì)定量熒光計(jì)(美國Life Technologies公司)測定純化后的PCR產(chǎn)物濃度，等量混庫。

1.4 高通量測序

取100～200 ng混庫后的PCR純化后產(chǎn)物，采用Ion Plus Fragment Library Kit建庫試劑盒(美國Agilent公司)按照試劑盒使用說明進(jìn)行測序文庫的構(gòu)建。將磁珠純化好后的測序文庫使用Agilent 2100 生物分析儀(美國Agilent公司)檢測測序文庫的DNA片段長度，將構(gòu)建成功的測序文庫稀釋到100 pmol/L，最后采用Ion Torrent S5 plus測序儀(美國Life Technologies公司)進(jìn)行高通量測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

所有樣品高通量測序的生物信息學(xué)分析都在Ubuntu操作環(huán)境下運(yùn)行，分析過程中主要使用的程序?yàn)镼IIME V1.9.0工具包和USEARCH V7軟件[10]。分析步驟包括：原始序列Reads數(shù)過濾，評估測序生成的序列Reads質(zhì)量，去除測序產(chǎn)生的低質(zhì)量Reads，消除重復(fù)序列并丟棄單倍型，去除PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體，所有處理后的序列參考97%的核苷酸相似性聚類到可操作分類單元(OTU)，對獲得的12S rRNA的有效OTU使用網(wǎng)絡(luò)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，計(jì)算生物類群的多樣性指數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，均在R語言操作平臺(https://cran.r-project.org/)、Tableau 2019.4、Microsoft Excel 365和PRIMER 6.0等軟件中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 水樣eDNA物種注釋結(jié)果

eDNA宏條形碼檢測共得到有效拼接序列3152 755條，平均序列長度為303 bp，聚類得到1 228個(gè)OTU，其中注釋到脊索動(dòng)物門的OTU為738個(gè)，序列數(shù)共計(jì)369 993條，分別注釋到硬骨魚綱、哺乳動(dòng)物綱、鳥綱和其他，注釋結(jié)果見表1。哺乳動(dòng)物綱205個(gè)OTU注釋到3目6科8屬8種，分別為人、家豬、牛、山羊、綿羊、家犬、家貓及褐家鼠；鳥綱24個(gè)OTU注釋到3目3科4屬4種，分別為原雞、綠頭鴨、鴻雁及紫翅椋鳥。其中人的序列占比為哺乳動(dòng)物綱的79.5%，脊索動(dòng)物門的36.5%，表明人類活動(dòng)與水體環(huán)境密切相關(guān)。

表1 脊索動(dòng)物門OTU注釋結(jié)果

2.2 魚類種類組成及序列占比

2.2.1 種類組成

在現(xiàn)有eDNA樣品中共檢測到魚類(硬骨魚綱)OTU 418個(gè)，其中可準(zhǔn)確注釋到種的有168個(gè)，共注釋到10目14科32屬46種，僅注釋到魚類無其他分類信息的OTU共計(jì)99個(gè)。注釋到鯉形目27種，序列占比達(dá)81.2%；鱸形目12種，序列占比7.43%；鯡形目1種，序列占比1.89%；鲇形目3種，序列占比0.65%；其他各目均為1種，共占比0.49%。鯉科魚類有25種，優(yōu)勢明顯，其他各科種類數(shù)差別不大。魚類序列占比見圖2。

圖2 魚類序列占比

按流域劃分，在淮河流域監(jiān)測到魚類41種，長江流域35種，太湖流域31種。在三大流域共同檢出的魚類有24種，僅在淮河流域檢出的魚類有5種，分別為細(xì)尾蛇鮈(Saurogobiogracilicaudatus)、棒花魚(Abbottinarivularis)、紅須鱊(Acheilognathusbarbatus)和泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)，僅在長江流域檢出的魚類為阿部鯔鰕虎魚(Mugilogobiusabei)，僅在太湖流域檢出的魚類為青鳉(Oryziaslatipes)。

按棲息水層劃分，中上層魚類(翹嘴鲌、青鳉、刀鱭等)，中下層魚類(興凱鱊、似鳊、團(tuán)頭魴等)和底層魚類(河川沙塘鱧、光澤黃顙魚、高體鰟鮍等)均有檢出。

按攝食類型劃分，以雜食性魚類最多(23種)，包括鯉、鯽、鳙等；肉食性魚類次之(18種)，其中溫和肉食性魚類10種，兇猛肉食性魚類8種，包括鱖、鲇、鱸、鲌、烏鱧等；植食性魚類最少(5種)，包括草魚、團(tuán)頭魴、興凱鱊、紅須鱊和高體鰟鮍。

2.2.2 序列占比

不同流域的魚類物種檢出點(diǎn)位數(shù)與序列數(shù)占比差異明顯。

(1)淮河流域序列占比>5%的物種共有4種，分別為鯉(34.19%)、鯽(25.53%)、鳙(5.69%)和興凱鱊(5.11%)，而檢出點(diǎn)位數(shù)>1/4(18個(gè)點(diǎn)位)的物種則分別為真吻鰕虎魚(34/75)、鯉(26/75)、麥穗魚(26/75)、大鰭鱊(25/75)、興凱鱊(24/75)和(23/75)。

(3)太湖流域序列占比>5%的物種共有6種，分別為鯽(28.13%)、刀鱭(18.71%)、鯉(9.58%)、(8.78%)、興凱鱊(5.75%)和鳙(5.34%)，而檢出點(diǎn)位數(shù)≥1/4(10個(gè)點(diǎn)位)的物種則分別為刀鱭(10/40)、鯉(10/40)、(10/40)和真吻鰕虎魚(10/40)。

2.3 魚類多樣性分析

從點(diǎn)位來看，檢出10種以上魚類的點(diǎn)位有23個(gè)，檢出5～9種魚類的點(diǎn)位有51個(gè)，檢出1～4 種魚類的點(diǎn)位有62個(gè)，另有12個(gè)點(diǎn)位未檢出魚類(eDNA測序信息以硅藻和藍(lán)藻為主)。檢出魚類種數(shù)最多的點(diǎn)位是鹽城市川東閘斷面(24種)，其次為泰州市祥和大橋斷面(18種)、再次為鹽城市王港閘斷面(17種)。

從點(diǎn)位所屬的流域來看，淮河流域75個(gè)點(diǎn)位中有7個(gè)點(diǎn)位僅檢出1種或未檢出魚類物種，淮河流域點(diǎn)位的魚類多樣性指數(shù)(Shannon-wiener指數(shù))為0.04～3.99，種類豐富度指數(shù)(Margalef指數(shù))為0.18～3.26，均勻度指數(shù)(Pielou指數(shù))為0.04～1。長江流域33個(gè)點(diǎn)位中有6個(gè)點(diǎn)位僅檢出1種或未檢出魚類物種，長江流域點(diǎn)位的魚類多樣性指數(shù)為0.03～3.5，種類豐富度指數(shù)為0.17～2.91，均勻度指數(shù)為0.03～0.81。太湖流域40個(gè)點(diǎn)位中有12個(gè)點(diǎn)位僅檢出1種或未檢出魚類物種，太湖流域點(diǎn)位的魚類多樣性指數(shù)為0.01～3.43，種類豐富度指數(shù)為0.13～2.58，均勻度指數(shù)為0.01～0.95。三大流域各點(diǎn)位檢出物種數(shù)與魚類多樣性指數(shù)示意見圖3(a)(b)(c)。由圖3可見，淮河流域的魚類生物多樣性相對較好，長江流域次之，太湖流域相對較低。

圖3 三大流域各點(diǎn)位檢出物種數(shù)與魚類多樣性指數(shù)示意

2.4 魚類群落組成及結(jié)構(gòu)多樣性與歷史資料的比較

江蘇省地處北溫帶，境內(nèi)河流縱橫，湖泊密布，海洋和淡水魚類資源十分豐富，據(jù)《江蘇魚類志》[11]記載，江蘇淡水魚類計(jì)105種(18科、65屬)，其中鯉形目種類最多，有72種，占淡水魚類總數(shù)的68.6%。2016—2018年，劉燕山等[12]在淮河江蘇段共調(diào)查到魚類56種(14科、42屬)；2016—2017年，閻明軍等[13]在長江江蘇段靖江樣點(diǎn)共監(jiān)測到魚類61種(18科、47屬)，2017—2018年，在長江江蘇段常熟樣點(diǎn)共監(jiān)測到魚類41種(14科、34屬)；2009—2010年，毛志剛等[14]利用拖網(wǎng)等網(wǎng)具在太湖流域共采集魚類50種(15科、40屬)；2013—2014年李其芳[15]在太湖流域57個(gè)河道樣點(diǎn)調(diào)查到魚類46種。在本次調(diào)查中，鯉科魚類在三大流域的序列占比均較高，鯉、興凱鱊、刀鱭、鳙和鯽等結(jié)果與傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果相符。相比于歷史記錄而言，江蘇省內(nèi)魚類群落的物種數(shù)在不斷降低，水質(zhì)污染、增殖放流、過度捕撈和江湖阻隔可能是導(dǎo)致魚類多樣性下降和物種組成變化的主要原因[16-17]。

3 討論

3.1 水生態(tài)環(huán)境管理需求及傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)水生生物監(jiān)測特點(diǎn)

水生態(tài)環(huán)境管理需要依靠水生生物監(jiān)測評價(jià)結(jié)果來掌握水生態(tài)環(huán)境的現(xiàn)狀及變化趨勢。雖然水生生物、水生態(tài)環(huán)境的變化是非常緩慢的，但魚類的強(qiáng)活動(dòng)能力和生物“趨利避害”的特性，使得通過對魚類群落的高頻監(jiān)測(如每月1次)來反映斷面或小區(qū)域的水生態(tài)環(huán)境狀況變化具有科學(xué)基礎(chǔ)和現(xiàn)實(shí)意義。

基于水生態(tài)環(huán)境管理的需求，筆者認(rèn)為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的水生生物監(jiān)測存在3個(gè)方面的問題。(1)監(jiān)測效率低。監(jiān)測效率低源于形態(tài)學(xué)監(jiān)測需要對生物樣本個(gè)體逐一分類鑒定的方法原理，若要提高監(jiān)測時(shí)效性，只能通過延長工作時(shí)間或增加技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)，同時(shí)高專業(yè)性使得人員培養(yǎng)困難，導(dǎo)致人員工作負(fù)荷本就較大的全國環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)，沒有足夠的技術(shù)人員來實(shí)現(xiàn)水生生物高頻動(dòng)態(tài)監(jiān)控及快速響應(yīng)的環(huán)境管理需求。(2)專業(yè)技能要求高。形態(tài)學(xué)分類時(shí)，技術(shù)人員需要在顯微鏡或解剖鏡下，區(qū)分物種間十分微小的形態(tài)差異，要求技術(shù)人員具備大量的專業(yè)技能儲備和長久的經(jīng)驗(yàn)積累。(3)缺乏高效的質(zhì)控手段。質(zhì)控困難則會(huì)導(dǎo)致監(jiān)測結(jié)果橫向可比性較差，甚至可能存在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)監(jiān)測結(jié)果誤差較大的情況。相較于監(jiān)測效率低的問題，高效質(zhì)控手段的缺失可能是制約環(huán)境管理決策更重要的原因。

雖然形態(tài)學(xué)監(jiān)測技術(shù)方法對于水生態(tài)環(huán)境管理而言存在一定的不足，但并不意味著可以舍棄該方法。經(jīng)過多年的監(jiān)測評價(jià)研究和監(jiān)測業(yè)務(wù)開展，基于形態(tài)學(xué)方法的水生態(tài)監(jiān)測工作形式已經(jīng)越發(fā)成熟。以江蘇為例，除積累了大量連續(xù)、寶貴的監(jiān)測歷史數(shù)據(jù)外，全省水生生物監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)不斷完善，監(jiān)測技術(shù)人員能力水平持續(xù)提升，監(jiān)測評價(jià)方法不斷優(yōu)化，使得水生態(tài)評價(jià)結(jié)果更加可靠。

3.2 eDNA技術(shù)在魚類群落監(jiān)測中的應(yīng)用

eDNA技術(shù)最早開始于20世紀(jì)80年代，主要用于開展環(huán)境微生物研究。魚類多樣性是水生生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性的重要組成部分，1981年，Karr[18]首次提出了采用生物完整性指數(shù)(Index of Biological Integrity，IBI)，利用魚類群落多樣性來判定河流健康狀況。2008年，F(xiàn)icetola等[19]首次將eDNA用于檢測美國牛蛙的入侵，該技術(shù)得以從兩棲類、魚類開始在水環(huán)境監(jiān)測中廣泛應(yīng)用于其他類生物。目前，eDNA在魚類監(jiān)測方面的應(yīng)用主要為珍稀物種的種群分布監(jiān)測、入侵物種的范圍追蹤以及水生生物的群落結(jié)構(gòu)調(diào)查等[2,20-22]。Hering等[23]提出，考慮到代表性、敏感性、精確性、可比性、成本效益和環(huán)境影響，eDNA方法非常適合魚類生物多樣性的評估。

雖然采用eDNA監(jiān)測方法時(shí)，水樣的采集方法、提取方法、引物可靠性和穩(wěn)定性都會(huì)影響最終的魚類多樣性判斷。同時(shí)由于eDNA監(jiān)測技術(shù)廣譜、高通量的特性，在提取DNA時(shí)，由于引物對不同類群及不同物種的偏好性或多或少存在差異，提取出的DNA序列定量結(jié)果肯定與真實(shí)的情況存在一定偏差。但總體而言，eDNA方法的偏差量是整體可控的，并且隨著研究和應(yīng)用的不斷發(fā)展，可以從技術(shù)上不斷縮小偏差，提升結(jié)果的準(zhǔn)確性。

得益于高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，eDNA監(jiān)測方法的效率優(yōu)勢愈發(fā)明顯，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室分析過程類似于理化分析，重復(fù)、陽性對照、陰性對照、盲樣、標(biāo)樣等都是理論上可行的質(zhì)控手段，分析操作流程易標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，結(jié)果準(zhǔn)確性易評判分析，非常有希望解決形態(tài)學(xué)方法在水生生物監(jiān)測中的3個(gè)突出問題?，F(xiàn)階段，僅僅利用eDNA方法，或eDNA方法與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法相結(jié)合開展監(jiān)測，已經(jīng)可以較好地滿足環(huán)境管理對水生生物監(jiān)測評價(jià)提出的大范圍、高頻次、穩(wěn)定監(jiān)測的需求和目標(biāo)。

3.3 eDNA技術(shù)在魚類群落監(jiān)測中的不足

采用eDNA技術(shù)監(jiān)測魚類群落結(jié)構(gòu)的過程中也發(fā)現(xiàn)了一些問題，需要在今后的應(yīng)用中不斷完善。(1)eDNA監(jiān)測方法的結(jié)果準(zhǔn)確性需要通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，并與形態(tài)學(xué)方法進(jìn)行對比確認(rèn)。(2)采樣體積偏小。由于考慮到大規(guī)模采樣的便利性，采樣體積選擇了易于過濾的500 mL，eDNA富集程度低于相關(guān)學(xué)者科學(xué)研究時(shí)通常采集的量(1～2 L)，后續(xù)監(jiān)測工作須綜合考慮采樣的便利性與eDNA的富集效果，選擇合適的采樣量或使用更高效的富集工具和方法。(3)魚類群落的流動(dòng)性變化會(huì)導(dǎo)致隨機(jī)抽樣誤差，除需要加大富集量外，還需要對采樣點(diǎn)設(shè)置多個(gè)小樣方，增加不同生境條件下的樣品來進(jìn)行完善。(4)本土物種特征條形碼序列的缺失使得監(jiān)測結(jié)果必須與國際通用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，導(dǎo)致獲得了序列但無法有效比對的現(xiàn)象，應(yīng)注意完善本土魚類序列信息庫，提高監(jiān)測結(jié)果的完整性。(5)以序列來估算生物量，目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，因此序列數(shù)占比及以序列數(shù)計(jì)算的相關(guān)多樣性指數(shù)只能作為參考。