鄭劉輝，詹利云，侯 宇，喻衛(wèi)武，曾燕如，戴文圣

（浙江農林大學 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室, 浙江 杭州 311300）

榧樹Torreya grandis是紅豆杉科Taxaceae榧屬Torreya中國特有植物，為第三紀孑遺植物，零星片狀分布于浙江、安徽、福建、江西、湖南等省的丘陵地帶[1]。榧樹雌雄異株，稀同株。雄性榧樹是香榧T. grandis‘Merrillii’的父本，為雌性香榧提供花粉，并在在維持榧樹多樣性中具有重要地位。目前，生產中大面積栽培的僅香榧一個栽培類型，因而榧樹天然雜交產生的多樣性在優(yōu)良種質選育及新品種培育方面潛力巨大，其中雄性榧樹起著重要的作用。以前由于雄株不結果，榧農不了解它對香榧生產的重要性，雄性榧樹被嚴重破壞，種群數(shù)量及范圍越來越小，雌雄比例嚴重失調[2]。近年來，隨著香榧產業(yè)的發(fā)展，人們逐漸認識到充分授粉對種實產量的影響，日益重視香榧造林中授粉樹的配置。研究發(fā)現(xiàn)：雄性榧樹單株間在花期、花粉得率與生活力等表型指標上存在豐富的變異[3]。因為變異是選育的基礎，因此，從DNA標記分析研究雄性榧樹的多樣性，可從遺傳物質DNA水平了解雄性榧樹表型豐富變異的內在基礎，從根本上為榧樹雄株選育提供理論基礎。遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分。隨著生物技術的發(fā)展和研究層次的深入，DNA分子標記成為檢測遺傳多樣性的主要方法[4]。簡單序列重復(SSR)是基于聚合酶鏈式反應(PCR)的分子標記技術，具有重復性好，多態(tài)性高，共顯性遺傳，操作方便等優(yōu)點，已廣泛應用于植物基因定位、遺傳育種、遺傳圖譜構建和遺傳多樣性研究等方面[5-8]。在榧樹遺傳多樣性研究方面，閔會等[9]利用擴增片段長度多態(tài)(AFLP)分子標記對香榧天然群體進行分析，發(fā)現(xiàn)香榧群體的遺傳多樣性豐富，且居群內的遺傳變異大于居群間；吳昊等[10]依據個體間的差異現(xiàn)象，建立了基于序列相關擴增多態(tài)(SRAP)標記的榧樹核心種質確定方法；劉浩凱[11]則用SRAP分子標記研究榧樹雄性居群的遺傳多樣性，結果表明：榧樹種內變異十分復雜。前人的研究揭示了榧樹種質資源復雜的遺傳背景和豐富的遺傳多樣性，但他們均使用的是顯性標記。顯性標記不能區(qū)分純合顯性與雜合顯性的基因型，而SSR標記則反之，它是共顯性標記。有關雄性榧樹遺傳多樣性的研究尚未見報道。本研究以5個雄性榧樹居群為研究對象，用熒光SSR分子標記分析榧樹雄株的遺傳多樣性和遺傳結構，旨在為榧樹雄株后續(xù)的培育、雄株種質資源的保護與可持續(xù)利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

詹利云等[3]對浙江省淳安縣半夏村(淳安居群)、杭州市臨安區(qū)洪嶺村(臨安居群)、杭州市富陽區(qū)洞橋村(富陽居群)、浙江嵊州市榆樹村(嵊州居群)及安徽省黃山市呈坎村(黃山居群)等5個野生雄性榧樹居群葉片及雄球花相關性狀進行了研究。本研究的葉片材料來自上述研究相同居群相同單株，121份葉片材料包括來源于淳安17份、臨安24份、富陽24份、嵊州24份和黃山32份。每株采集的新鮮嫩葉放入裝有硅膠的自封袋中為1份，帶回實驗室后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用改良的CTAB法提取基因組DNA[12]，用紫外分光核酸測定儀(GENEQUANT,Eppen-dorf, 德國)測定DNA濃度和光密度[D(λ)]值，用質量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在AlphaImager成像系統(tǒng)(Alpha Innotech Corporation, 美國)中拍照儲存電泳結果。檢測合格的DNA樣品用無菌水稀釋到 50 mg·L-1，備用。

1.2.2 SSR 分析 從榧屬物種 (長葉榧T. jackii和榧樹)研究中選取 55 對 SSR 引物[13-16]。SSR 反應體系由北京睿博興科生物技術有限公司提供，即采用2步法，其中第2步擴增時的正向引物加有M13序列(5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′)(M13-F)，并在合成時分別加有藍 (FAM)、綠 (HEX)、紅 (ROX)、黑(TAMRA)熒光，以方便PCR產物的毛細管電泳檢測。引物均由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

PCR 第 1 步反應體系為 50 mg·L-1的 DNA 1.0 μL、2×TaqPCR MasterMix(諾唯贊生物科技有限公司)5.0 μL、10 μmol·L-1正反向引物各 0.5 μL、滅菌去離子水補足 10.0 μL；PCR 擴增程序為 95 ℃ 預變性5 min，后 35 個循環(huán)，每個循環(huán) 95 ℃ 變性 30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，最后 72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用質量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。第2步PCR反應體系為第1 步的 PCR 產物 1.0 μL、2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL，M13-F 及反向引物各 0.5 μL，滅菌去離子水補足20.0 μL；PCR擴增程序同第1次PCR，僅退火溫度降低了5 ℃。PCR產物用質量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰的樣送北京睿博興科生物技術有限公司毛細管電泳檢測。

隨機選取5株雄性榧樹樣品進行PCR擴增的引物篩選，并用篩選得到的引物對樣品進行SSR分析。

1.2.3 數(shù)據統(tǒng)計與分析 在 Excel中統(tǒng)計擴增的等位基因位點信息，并用 DataFormater軟件[17]進行格式轉換。利用GenALEx 6.5軟件[18]計算多態(tài)信息含量(PIC)、多態(tài)位點百分比(PPL)、近交系數(shù)(Fis)、遺傳相似度 (GD)和遺傳距離 (GI)，并進行分子方差分析 (analysis of molecular variance, AMOVA)和主坐標分析 (principal co-ordinates analysis, PCoA)，用 Popgene Ver.1.3.2 軟件計算等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s總基因多樣度(Ht)、遺傳分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)等遺傳參數(shù)。

采用NTSYS 2.10e軟件[19]計算Nei’s遺傳相似性。采用混合模型和Structure 2.3.4軟件分析居群的遺傳結構和lnP(D)[20]。lnP(D)為DeltaK和似然值的對數(shù)函數(shù)，針對基因庫數(shù)目建模，以確定最佳群體數(shù)K值，設置K為1～5，每個參數(shù)運行10次，每次運行的丟棄迭代時間和重復次數(shù)都為10000。

2 結果與分析

2.1 SSR 引物篩選

從55對引物中篩選出了24對擴增穩(wěn)定、條帶清晰的引物對(圖1)，并將其用于榧樹雄株遺傳多樣性分析。引物信息見表1。

圖1 部分引物對 PCR 擴增產物電泳圖Figure 1 Electrophoresis of DNAs amplified with some pairs of primers

表1 雄性榧樹 SSR 分析引物Table 1 SSR primers used in male T. grandis

2.2 遺傳多樣性分析

24對SSR引物在121株榧樹雄株中共獲得85個等位基因，每對引物擴增的等位基因數(shù)為2～7個，平均每對引物擴增出3.54個等位基因，其中引物對ZAFU-4檢測到7個等位基因；有效等位基因數(shù)為45.69個，平均每個位點有有效等位基因數(shù)為1.92個；平均觀測雜合度(0.461)略高于平均期望雜合度(0.400)；Shannon’s信息指數(shù)為 0.10～1.31，平均為0.70，其中GR98 位點的 Shannon’s信息指數(shù)最高(1.310)；多態(tài)信息含量為0.040～0.699，平均為0.400，其中GR98位點的多態(tài)信息含量最高(0.699)，GR48 位點最低 (0.040) (表2)。

表2 雄性榧樹 SSR 位點遺傳信息Table 2 Genetic information of SSR loci amplified from male T. grandis

平均等位基因數(shù)淳安居群最高，為2.292個，嵊州居群最少，為2.792個，平均為2.508個。平均有效等位基因數(shù)為1.798個；平均觀測雜合度為0.459，平均期望雜合度為0.365。5個居群的平均多態(tài)位點比率為82.50%，其中嵊州居群最高(95.83%)，黃山居群和臨安居群分別為87.50%和79.17%，富陽居群和淳安居群最低(75.00%)。Nei’s遺傳多樣性指數(shù)，嵊州居群最高，為0.431，淳安居群最低，為0.332，平均為0.365；Shannon’s信息指數(shù)嵊州居群最高，為0.720，淳安居群最低，為0.541，平均為0.608；各居群的Shannon’s信息指數(shù)高于Nei’s遺傳多樣性指數(shù)，且兩者變化趨勢一致。以多樣性指數(shù)為評價指標，則嵊州居群的遺傳多樣性最高(Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.431，Shannon’s信息指數(shù)為0.720)，淳安居群的遺傳多樣性較低(Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.332，Shannon’s信息指數(shù)為0.541) (表3)。

表3 雄性榧樹居群的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of male populations in male T. grandis

2.3 遺傳分化分析

5個雄性榧樹居群各位點的近交系數(shù)為-0.923(ZAFU-8)～0.143(GR12)，平均近交系數(shù)為-0.227，絕大數(shù)位點(22個)近交系數(shù)為負值，說明絕大數(shù)位點表現(xiàn)雜合子過剩[21]。各位點遺傳分化系數(shù)為0.006(GR81)～0.286(ZAFU-7)，平均遺傳分化系數(shù)為0.096。由 Nei’s遺傳多樣性指數(shù)估算的雄性榧樹Nei’s總基因多樣度為0.427?；蛄鞯淖兓秶^大，平均基因流為4.172(表4)。AMOVA結果表明：榧樹雄株居群間差異極顯著(P＜0.01)，居群內的遺傳變異遠大于居群間，居群內占79%，而居群間則只占21% (表5)，表明遺傳變異主要集中在居群內。

表4 SSR 位點的遺傳分化Table 4 Genetic differentiation of SSR loci in male T. grandis

表5 雄性榧樹居群的分子方差分析Table 5 Analysis of molecular variance (AMOVA) of male populations in male T. grandis

2.4 居群聚類分析

5個榧樹雄株居群的遺傳相似度為0.865～0.978，平均遺傳相似度為0.932，相似性很高，但也存在著一定的遺傳變異。淳安居群與嵊州居群的遺傳距離最大(0.145)，而遺傳相似度最小(0.865)，說明它們的遺傳變異最大。臨安居群和黃山居群的遺傳距離最小(0.022)，遺傳相似度最大(0.978)，表明兩者之間的遺傳差異最小(表6)。

表6 5個雄性榧樹居群的遺傳距離和遺傳相似度Table 6 Genetic distance and genetic identity among the 5 populations in male T. grandis

主坐標分析結果表明：5個野生榧樹居群主要分成2大類群，其中第1類群包括淳安居群、富陽居群、臨安居群、黃山居群，且彼此間混合在一起，難以區(qū)分，而嵊州居群單獨聚為一類(圖2)。

圖2 5 個雄性榧樹居群的主坐標分析Figure 2 PCoA of 5 populations in male T. grandis

2.5 遺傳結構分析

Structure軟件分析結果表明：K為 2～4 (圖3)。供試的所有樣品如果分成2個群體，則嵊州居群的雄株單獨成1個群體，其余4個居群組合成1個群體。如果將所有樣品歸屬于3個群體，則嵊州居群和黃山居群分別各自形成1個群體，另外3個居群形成1個群體。如果所有樣品歸屬于4個群體，則結果會和聚類的結果一樣，臨安居群和黃山居群組合成1個群體，另3個居群則各自形成1個群體。結合主坐標分析(圖2)的結果，將供試材料分成2～3個群體比較合理。當K為3時，lnP(D)最大，故將所有個體分成3個群體(圖3)。由群體遺傳結構圖(圖4)可知：每個顏色表示一種遺傳組成，同一聚類亞群中相同的遺傳組成占據主要成分，即同一顏色所占比率最大的居群聚類為同一亞群。因此5個野生榧樹居群可以劃分為3大亞群，淳安居群和富陽居群聚為一類(紅色基因池)，臨安居群和黃山居群聚為一類(綠色基因池)，嵊州居群單獨聚為一類(藍色基因池)。

圖3 基于 lnP(D)值供試材料的遺傳群體劃分Figure 3 Reasonable group number of tested apricot germplasms infered by lnP(D)

圖4 基于 Structure 分析的 5 個雄性榧樹居群的遺傳結構圖Figure 4 Genetic structure of 5 male T. grandis populations based on structure analysis

3 結論與討論

本研究表明：盡管SSR標記具有物種的特異性，但近緣種的SSR引物在同屬物種中具有一定的通用性。這也從一個側面反映了物種的親緣關系。SSR標記的開發(fā)基于DNA序列，利用近緣種的SSR引物進行目標物種SSR引物的篩選不失為一種經濟的方法。理論上，同一物種的SSR引物在具體的研究中應該都是適用的，但各研究所使用的PCR儀在循環(huán)過程中升降溫不同，會不同程度地影響引物與模板的結合，進而影響擴增結果，因而實驗過程需進行引物篩選。本研究專門研究雄性榧樹，這有別于雌性榧樹。這也可能造成已有的榧樹SSR引物不適用于雄株的現(xiàn)象。

本研究的SSR位點顯示：雄性榧樹存在多個等位基因的現(xiàn)象(表1)。除多態(tài)信息含量以外，不管是觀察雜合度還是期望雜合度，雄性榧樹的雜合度都較高，這也體現(xiàn)在Shannon’s信息指數(shù)上。BOSTSEIN等[22]認為：Shannon’s信息指數(shù)大于0.5時表明遺傳多樣性較高。這與榧樹雌雄異株天然雜交產生雜種的特性有關。同樣，居群水平觀察雜合度、Shannon’s信息指數(shù)、多態(tài)位點百分比都不低，但觀察雜合度要高于期望雜合度。與劉浩凱[11]利用SRAP標記研究雄性榧樹居群的結果相比，本研究結果(多態(tài)位點百分比、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù))要高于顯性標記的研究結果，可見共顯性SSR標記要優(yōu)于顯性標記，在茶樹Camellia sinensis[23]、甜菜Beta vulgaris[24]中也有類似的結果。

本研究所得的平均Shannon’s信息指數(shù)為0.704，均高于同屬植物巴山榧T. fargesii居群(Shannon’s信息指數(shù)為0.370)[25]和長葉榧居群(Shannon’s信息指數(shù)為0.309)[26]以及同科植物南方紅豆杉Taxus wallichiana(Shannon’s 信息指數(shù) 0.376)[27]和白豆杉Pseudotaxus chienii(Shannon’s信息指數(shù) 0.236)[28]研究所得的結果。WRIGHT[25]研究認為：遺傳分化系數(shù)大于0.25時，表明群體間有很大的遺傳分化。本研究雄性榧樹居群的遺傳分化程度很小(遺傳分化系數(shù)為0.096 ＜0.25)，說明居群間基因交流較頻繁?；蛄魇怯绊懢尤簝炔亢途尤洪g遺傳變異程度的重要因素[27]，其大小反映居群遺傳結構的變異，它能防止基因分化。WRIGHT[25]認為：基因流＞1時說明居群間存在一定的基因流動。本研究5個雄性榧樹居群間的基因流為4.172，不僅居群間存在較大的基因流動，且大于SRAP標記的分析結果(基因流為2.192)[11]，但低于異交、風媒植物基因流的平均水平(5.380)[29]。這與榧樹雌雄異株風媒的特性相符。頻繁的基因交流導致居群間遺傳的均質化，使各居群間遺傳相似度較高。這在遺傳分化系數(shù)上有所體現(xiàn)，與劉浩凱[11]的研究結果一致，也與HAMRICK[29]研究異交風媒植物的結論相符，即遺傳變異主要集中在居群內。因此，選育可基于居群內個體的表現(xiàn)進行，且要注意對優(yōu)良單株的保護。

從主坐標分析結果及遺傳結構來看，嵊州居群均相對單獨地聚為一類。嵊州是香榧的主產地，當?shù)夭环荷锨甑墓畔汩糩30]，也是榧樹古老的原生地，而另4個居群則非也。從主坐標分析結果來看：除嵊州居群外，其余居群的個體混雜在一起，這也說明居群間分化較小。

遺傳多樣性與生物自身的生存和競爭能力息息相關，其豐富程度決定物種對環(huán)境的適應能力和進化潛力[31]。遺傳多樣性越高，該物種對環(huán)境變化的適應能力越強，有利于資源進一步的選擇和保存[32]。本研究表明：雄性榧樹的遺傳多樣性豐富。雄性榧樹的多樣性為雌性榧樹的多樣性及榧樹物種水平的多樣性作出了重要貢獻，為優(yōu)良種質的選擇及雜交育種提供了豐富的物質基礎，但同時也是造成栽培類型香榧內部分化的原因[30]，因此，雄性榧樹資源值得大力保護與利用。