李煥苓，查晉燕，魏志遠(yuǎn)，侯憲文，姜成東，王家保*

（1．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)站，海南 ?？?571101；2．中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 ?？?571101；3．海南大學(xué)園藝學(xué)院，海南 海口 570228）

微生物是土壤生態(tài)中較為活躍的部分，在土壤有機(jī)質(zhì)的分解、養(yǎng)分循環(huán)和生態(tài)環(huán)境改善等方面起著重要作用，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和群落演替具有重要的作用［1-5］。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是反映土壤肥力和健康狀況的重要指標(biāo)［6-7］，而土壤微生物功能多樣性是土壤微生物群落狀態(tài)和功能的標(biāo)志，反映了土壤微生物的生態(tài)特征［8］。Biolog ECO 板法是美國(guó)Biolog 公司發(fā)展起來(lái)的，用于研究微生物代謝功能多樣性和活性，原理是通過(guò)微生物對(duì)板中不同碳源類型的利用能力及代謝差異來(lái)反映微生物群落的功能多樣性［9-10］。該方法具有無(wú)需分離培養(yǎng)微生物、方便快捷、數(shù)據(jù)量大等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于土壤、水體等研究［11-14］。

目前，關(guān)于荔枝園土壤中微生物群落多樣性的研究極少，阮傳清等［15］利用磷脂脂肪酸方法，研究了楊桃與荔枝根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)荔枝根區(qū)土壤微生物多樣性指數(shù)（Simpson）和細(xì)菌、真菌的特征脂肪酸含量大小為：距植株1.0 m 土壤＞0.5 m 土壤≈1.5 m 土壤。覃嬋嬋［16］利用Biolog ECO 板法和高通量測(cè)序研究了荔枝幼齡果園間作大豆、紅薯及覆膜處理后荔枝園土壤微生物群落對(duì)碳源的代謝水平及荔枝根際土壤微生物群落的多樣性，發(fā)現(xiàn)間作大豆對(duì)微生物群落多樣性的提高最佳，其次是間作紅薯，最后是覆蓋處理。施肥直接影響土壤理化性質(zhì)、生物活性及微生物群落結(jié)構(gòu)，不同施肥措施對(duì)微生物群落影響不同［17-18］。枝葉還田、施肥方式和土壤類型等都是影響土壤微生物活性及群落多樣性的因素［19］，目前尚未見(jiàn)關(guān)于施肥對(duì)荔枝園土壤微生物多樣性的研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)Biolog ECO 板法研究化肥減施對(duì)荔枝園土壤微生物功能多樣性的影響，為提出荔枝合理施肥方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)荔枝園位于海南省海口市東昌農(nóng)場(chǎng)興貴果園（110.618443° E，19.597410° N），供試品種為主栽荔枝品種‘妃子笑’，樹(shù)齡20 年，行間距4 m×5 m，單株均產(chǎn)45 kg 左右。試驗(yàn)于2018 年6 月開(kāi)始，本研究是在完成2 個(gè)年度生長(zhǎng)周期的施肥管理后，于2020 年6 月取樣研究的結(jié)果。試驗(yàn)共設(shè)10 個(gè)施肥處理：果農(nóng)習(xí)慣施肥處理（T0）和化肥減施處理（T1 ～T9）。T1 ～T9 是在荔枝采后第一次施肥時(shí)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，枝葉還田方式、有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥種類及用量3 個(gè)因素，設(shè)3 個(gè)水平，共9 個(gè)處理（表1）；其他物候期，T1 ～T9 的施肥種類和用量一致。在整個(gè)年度生長(zhǎng)周期內(nèi)，相對(duì)果農(nóng)習(xí)慣施肥處理T0，T1 ～T9 的化肥總施用量均有減少（表2）。在樹(shù)冠滴水線下開(kāi)溝施肥，有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥（T7 ～T9 添加粉碎后的枝葉）混合后埋施。各施肥處理試驗(yàn)用樹(shù)均為18株，6 株為1 個(gè)小區(qū)，3 次重復(fù)。以荔枝樹(shù)施肥坑邊10 cm 處0 ～20 cm 土層土壤混合作為1 個(gè)樣本，無(wú)菌袋收集后帶回實(shí)驗(yàn)室。去除根系和動(dòng)物殘?bào)w，過(guò)2 mm 篩，用于Biolog Eco 板法測(cè)定土壤微生物群落的功能多樣性。

表1 荔枝修剪后第一次施肥的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

表2 整個(gè)年度生長(zhǎng)周期內(nèi)不同處理的施肥種類及用量

1.2 測(cè)定方法

采用Biolog ECO 板法。參照錢葉等［20］的方法進(jìn)行培養(yǎng)。（1）稱5.0 g 新鮮土壤加入100 mL 滅菌離心管中，加入45 mL 滅菌的生理鹽水（0.85%NaCl，w/v），封口。（2）25℃，暗培養(yǎng)，250 r/min振蕩60 min，后靜置30 min。（3）按逐步稀釋法，用移液器吸取5 mL 上清液，加入盛有45 mL 滅菌生理鹽水的100 mL 離心管中，最終將土壤懸液稀釋為10-3g/mL。（4）在超凈工作臺(tái)中，用移液器將制備好的土壤懸液接種到Biolog ECO 板的各孔中，每孔接種量150 μL。（5）將接種好的Biolog ECO 板蓋好蓋子，放入25°C 的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)10 d，每隔24 h 檢測(cè)其在590 和750 nm 波長(zhǎng)下各孔的吸光度值（OD 值）

表3 年度生長(zhǎng)周期內(nèi)不同施肥處理N、P2O5、K2O 的施用量 （kg）

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2019 對(duì)吸光度值數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，計(jì)算Biolog ECO 板平均顏色變化率和多樣性指數(shù)等［20］；用DPS 18.10 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，多重比較采用LSD 法（P＜0.05）。用Origin 2019 完成主成分分析。

平均顏色變化率（AWCD 值）和多樣性指數(shù)（U）的計(jì)算公式如下：式中：C 為每個(gè)碳源孔590 和750 nm 兩波段光密度差值；R 為對(duì)照孔光密度值；31 為ECO 板供試碳源的種類數(shù)。S 為有顏色變化的孔總數(shù)目，即C-R＞0的孔總數(shù)目；N 代表碳源數(shù)，本試驗(yàn)用Biolog ECO板中共有31 種碳源；Pi代表第i 個(gè)孔的OD 值與總的OD 值兩者之間的比值；ni代表第i 個(gè)孔的OD 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化肥減施處理對(duì)平均顏色變化率的影響

平均顏色變化率（AWCD 值）是反映土壤微生物碳源利用能力和土壤微生物代謝活性的重要指標(biāo)，該值越大代表了土壤微生物群落代謝活性越高［21］。由圖1 知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，AWCD值呈“S”形曲線增加，可見(jiàn)，各處理土壤微生物利用碳源能力呈逐漸增加趨勢(shì)，0 ～24 h 內(nèi)AWCD值均有所增加，24 ～96 h AWCD 值增加最快，微生物的碳源利用增強(qiáng)，活性旺盛，120 h 后AWCD值增長(zhǎng)趨于緩慢，逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。確定120 h 為AWCD 值的拐點(diǎn)［22］，以該時(shí)間點(diǎn)的吸光度值作為進(jìn)一步微生物碳源利用能力及群落多樣性分析的依據(jù)。以T1 ～T9 的AWCD 值為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析（表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)極差R大小分析3 個(gè)因素對(duì)AWCD 值的影響排序?yàn)闊o(wú)機(jī)肥＞枝葉還田方式＞有機(jī)肥。枝葉還田方式、有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥施用的最優(yōu)水平分別是枝葉粉碎覆蓋、豆餅1.5 kg、復(fù)合肥1.0 kg，即T3 處理為各因素的最優(yōu)水平組合，但考慮枝葉還田方式和有機(jī)肥施用的互作影響，影響AWCD 值的最優(yōu)處理是T2處理［枝葉粉碎后覆蓋、有機(jī)肥用量最多（羊糞20 kg）、無(wú)機(jī)肥減施（磷肥投入最多）］。AWCD 值最低的是T9 處理［枝葉粉碎填埋、有機(jī)肥用量最少（豆餅1.5 kg）、無(wú)機(jī)肥最少（磷肥投入最少）］，與T2 呈顯著差異；其他處理（T1、T3 ～T8）間無(wú)顯著差異。為了解化肥減施的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)處理（T1 ～T9）和果農(nóng)習(xí)慣施肥處理（T0）的差異，以整個(gè)年度生長(zhǎng)周期內(nèi)不同施肥處理作為單因素統(tǒng)計(jì)（下同）。對(duì)T0 ～T9 的AWCD 值進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)果農(nóng)習(xí)慣施肥處理（T0），T2 的AWCD 值最高，呈顯著差異，而其他化肥減施處理（T1、T3 ～T9）的AWCD 值與T0 差異不顯著（圖2）。可見(jiàn)，枝葉粉碎后覆蓋、有機(jī)肥用量最多（羊糞20 kg）、無(wú)機(jī)肥減施（磷肥投入最多）的處理（T2）土壤微生物碳源利用能力顯著高于果農(nóng)習(xí)慣施肥處理，且其他化肥減施處理間無(wú)顯著差異。

圖1 不同施肥處理土壤微生物群落AWCD 值的動(dòng)態(tài)變化

表4 L9（34）正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

圖2 不同施肥處理荔枝園土壤培養(yǎng)120 h 隨時(shí)間微生物群落的AWCD 值差異

2.2 土壤微生物利用不同碳源的變化特征

Biology ECO 板中31 種碳源分為六大類，即糖類（10 種）、氨基酸類（6 種）、羧酸類（7 種）、胺類（2 種）、酚酸類（2 類）和聚合物類（4 種）。比較研究不同施肥處理下土壤微生物在吸光度變化拐點(diǎn)120 h 對(duì)六大類碳源的利用特征，發(fā)現(xiàn)不同施肥處理下土壤微生物對(duì)糖類、氨基酸類、胺類和聚合物類碳源的利用能力相對(duì)較高，而對(duì)羧酸類和酚酸類碳源的利用能力較低。各處理分別在氨基酸類和羧酸類碳源的利用能力無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，不同施肥處理微生物功能多樣性的區(qū)別在于對(duì)糖類、胺類、酚酸類和聚合物類4 類碳源利用的差異。在對(duì)糖類碳源利用上，T2 和T3 的利用能力較高，T0、T7、T8、T9 這4 個(gè)處理對(duì)糖類碳源的利用能力與之相比較低，呈顯著差異；對(duì)胺類碳源利用上，T0的利用能力最低，T1、T2、T4 ～T7、T9 利用能力較高，與T0 呈顯著差異；在對(duì)酚酸類碳源利用上，T1 和T3 的利用能力較高，而T0、T4、T5、T6、T9這5 個(gè)處理與之相比對(duì)酚酸類碳源利用的能力較低，呈顯著差異；在對(duì)聚合物類碳源利用上，T7 的利用能力最高，T5 的利用能力最低，與之呈顯著差異。

2.3 不同施肥處理土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

由表5 可知，T2 的McIntosh 多樣性指數(shù)最高，T9 的最低，且T0 和T9 的McIntosh 多樣性指數(shù)顯著 低 于T2。T1 的Shannon-wiener 均 勻 度 指 數(shù) 最高，T0 的 最 低，且T2 和T0 的Shannon-wiener 均勻度指數(shù)顯著低于T1。T6 的Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最 高，T0 最 低，且T0、T8 和T9 的Simpson 優(yōu) 勢(shì)度指數(shù)顯著低于T6。各施肥處理土壤微生物群落的Shannon-wiener 豐富度指數(shù)無(wú)顯著差異。

圖3 不同施肥處理土壤微生物群落對(duì)不同碳源類型的利用

表5 不同施肥處理荔枝園土壤微生物群落多樣性指數(shù)

2.4 土壤理化性質(zhì)與土壤微生物群落對(duì)碳源利用及多樣性的相關(guān)性

為了解不同施肥處理后土壤的理化性質(zhì)與土壤微生物群落對(duì)碳源利用及其多樣性的關(guān)系，本研究分析了土壤pH、有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、有效磷、速效鉀與對(duì)單糖/糖苷/聚合糖類、氨基酸類、酯類、醇類、胺類、酸類利用及AWCD 值、McIntosh 多 樣 性 指 數(shù)、Shannon-wiener 豐 富 度 指數(shù)、Shannon-wiener 均勻度指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)有效磷與微生物對(duì)氨基酸類碳源的利用和McIntosh 多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（表6）。

2.5 不同施肥處理土壤微生物群落碳源利用的主成分分析

利用培養(yǎng)120 h 測(cè)定的吸光值，對(duì)不同施肥處理土壤微生物對(duì)31 種碳源利用進(jìn)行主成分分析。根據(jù)累計(jì)方差貢獻(xiàn)率85%以上的原則，提取了11 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.05%。其中第1 主成分的方差貢獻(xiàn)率為21.81%，第2 主成分為14.93%，第3 ～11 主成分貢獻(xiàn)率均較小，分別為8.20%、8.03%、6.86%、6.19%、5.25%、4.33%、3.90%、3.53%、3.01%。由圖4 可知，T1 ～T4 依次在PC1 正軸分布，T7、T8、T5 和T6 依次在PC2正軸分布，T9 和T0 分別在PC1 和PC2 負(fù)軸分布，推測(cè)主成分分析中枝葉還田類型對(duì)其影響較大。分析PC1 和PC2 中相關(guān)性較高（|r|＞0.2）的19 個(gè)碳源（表7），發(fā)現(xiàn)糖類和羧酸類在PC1 中的權(quán)重較大，而糖類、氨基酸類和羧酸類在PC2 中的權(quán)重較大。這與2.2 中不同處理對(duì)6 類碳源類型利用的分析結(jié)果基本一致，即不同施肥處理土壤微生物功能多樣性的區(qū)別主要在于對(duì)糖類碳源利用的差異。

表6 土壤理化性質(zhì)與碳源和微生物指標(biāo)的相關(guān)性分析

圖4 不同施肥處理土壤微生物碳源利用的主成分分析

表7 主要碳源在PC1 和PC2 上的載荷值（僅顯示|r|＞0．2）

3 討論與結(jié)論

3.1 無(wú)機(jī)肥是影響荔枝園土壤微生物功能多樣性的主要因素

施肥制度對(duì)土壤微生物功能多樣性的影響較大，添加糞肥、植物殘?bào)w等有機(jī)肥可維持土壤肥力和微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定，微生物群落多樣性是反映土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)［23-25］。土壤微生物群落碳源代謝強(qiáng)度和代謝類型的變化能較早預(yù)測(cè)土壤養(yǎng)分的變化趨勢(shì)，被認(rèn)為是預(yù)測(cè)土壤質(zhì)量變化最有潛力的敏感性生物指標(biāo)［26］。Biolog 方法能獲得微生物群體的總體活性與代謝功能［27］。本研究為探討枝葉還田方式、化肥減施和配施有機(jī)肥3 個(gè)因素對(duì)荔枝園土壤微生物多樣性的影響，在荔枝采后第一次施肥時(shí)采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，枝葉還田方式、有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥種類及用量3 個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平，利用Biolog 方法進(jìn)行研究。AWCD 值反映了土壤微生物群落碳源代謝能力的高低，是土壤微生物活性和多樣性大小的一個(gè)重要指標(biāo)［28］。本研究以培養(yǎng)120 h時(shí)T1 ～T9 的AWCD 值為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)方差分析，3 個(gè)因素對(duì)AWCD 值的影響表現(xiàn)為無(wú)機(jī)肥＞枝葉還田方式＞有機(jī)肥，考慮枝葉還田方式與有機(jī)肥施用的互作影響，最優(yōu)方案是T2 處理［枝葉粉碎后覆蓋、有機(jī)肥用量最多（羊糞20 kg）、無(wú)機(jī)肥減施（磷肥投入最多）］。AWCD 值最低的是T9處理［枝葉粉碎填埋、有機(jī)肥用量最少（豆餅1.5 kg）、無(wú)機(jī)肥最少（磷肥投入最少）］。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了集成枝葉還田方式、化肥減施和配施有機(jī)肥的較優(yōu)施肥處理。

3.2 磷肥的合理施用促進(jìn)土壤微生物功能多樣性

施肥措施是影響土壤微生物群落的重要因素，合理的施肥措施能顯著促進(jìn)土壤微生物代謝活性，提高土壤微生物多樣性［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，化肥減施處理T2 的AWCD 值和McIntosh 多樣性指數(shù)最大，而T9 和T0 的AWCD 值和McIntosh 多樣性指數(shù)最小，可見(jiàn)T2 處理土壤中微生物群落對(duì)31 種碳源的代謝能力最強(qiáng)，多樣性指數(shù)也最高。施肥處理中T2 的有機(jī)肥用量、有機(jī)無(wú)機(jī)肥中總磷施用量是最高的，而T9 和T0 中有機(jī)肥用量、有機(jī)無(wú)機(jī)肥中總磷施用量較低，這可能是導(dǎo)致微生物碳源利用能力和多樣性呈顯著差異的原因。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤中有效磷與微生物對(duì)氨基酸類碳源的利用和McIntosh 多樣性指數(shù)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。高明霞等［29］認(rèn)為施磷處理（磷鉀、氮磷和氮磷鉀）對(duì)微生物代謝活性具有較大的促進(jìn)作用。長(zhǎng)期不同化肥處理土壤微生物的碳源利用能力和類型出現(xiàn)顯著差異，氮磷養(yǎng)分的差異是產(chǎn)生分異的主要原因，其中磷肥是引起差異的主要原因。張逸飛等［30］也發(fā)現(xiàn)施磷后土壤酶活性、微生物功能多樣性大于未施磷的土壤，與本研究結(jié)果一致。

盡管Biolog 方法能得到很大的微生物代謝功能信息量，但無(wú)法得到微生物群落結(jié)構(gòu)的信息。因此，我們僅通過(guò)此方法分析不同化肥減施處理下微生物活動(dòng)與碳代謝功能，而不考慮微生物類群的變化，尤其與土壤碳氮比等理化性質(zhì)密切相關(guān)的土壤微生物真菌細(xì)菌比的變化。下一步，可考慮借助高通量測(cè)序等分子生物學(xué)手段研究不同化肥減施措施間微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。

綜上，不同化肥減施處理對(duì)荔枝園土壤微生物功能多樣性的影響不同。不同施肥處理微生物功能多樣性的區(qū)別在于對(duì)糖類、胺類、酚酸類和聚合物類4 類碳源利用的差異。枝葉粉碎覆蓋、增施有機(jī)肥、高磷肥的化肥減施處理（T2）較果農(nóng)習(xí)慣施肥處理（T0）顯著提高了土壤微生物群落的碳源利用能力和多樣性。從土壤微生物功能的多樣性角度分析，T2 是較為合理的化肥施肥處理，該結(jié)果可為當(dāng)?shù)乩笾@化肥減施提供理論依據(jù)。