高 杰

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所）

簡化基因組測序(Reduced-representation sequencing)是一種從第二代測序發(fā)展而來的測序技術(shù)，利用實(shí)驗(yàn)手段，如酶解，降低物種基因組的復(fù)雜性，對基因組的特定區(qū)域進(jìn)行測序以反映結(jié)構(gòu)信息的測序技術(shù)。

通常簡化基因組測序，是指利用限制性內(nèi)切酶對基因組DNA進(jìn)行裂解，并分離出其中的某些特征片段，利用二代測序技術(shù)，可以用于全基因組遺傳標(biāo)記的開發(fā)和分型。利用簡化的基因組測序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模高通量SNP分型是目前國際上動植物基因組學(xué)研究的趨勢。

使用時(shí)間最長的簡單基因組分析技術(shù)是由美國Oregon大學(xué)發(fā)明的限制性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)DNA（RAD）技術(shù)。 然而，RAD技術(shù)有兩大技術(shù)缺陷：繁瑣的文庫構(gòu)建過程，涉及多輪的DNA分離和純化，嚴(yán)重影響了技術(shù)的可重復(fù)性和可靠性；RAD技術(shù)產(chǎn)生的DNA具有不同長度的限制性片段，但PCR技術(shù)本身具有對圖案的長度有偏好（即優(yōu)先擴(kuò)增較小的DNA片段）。而文庫構(gòu)建階段的PCR和測序階段的emulsionPCR，會嚴(yán)重影響擴(kuò)增DNA片段的基因組代表性。

2b-RAD技術(shù)有效地克服了上述RAD技術(shù)的固有缺點(diǎn)。它使用IIB型限制性內(nèi)切酶，通過全基因組消化產(chǎn)生33-36bp的等長標(biāo)記，這些標(biāo)記被富集并用于下游的高通量測序反應(yīng)，通過生物信息分析進(jìn)行高通量全基因組SNP篩選和分型分析。

1 簡化基因組技術(shù)介紹

隨著信息技術(shù)的不斷提升，從2008年至今已經(jīng)發(fā)展出至少以下7種簡化基因組測序技術(shù)。

表1 簡化基因測序技術(shù)發(fā)展順序

技術(shù)名稱 出現(xiàn)年份2b-RAD(IIB restriction sit e Associated DNA) [4] 2012 年SLAF（specific-locus amplified fragment sequencing) [5] 2013 年Multi-isoRAD（2b-RAD 升級版）[6] 2016 年Super-GBS（GBS 改進(jìn)版）[7] 2018 年

2 2b-RAD技術(shù)

針對RAD技術(shù)的一系列缺點(diǎn)，2012年Wang等推出基于IIB型限制性內(nèi)切酶的2b-RAD技術(shù)。其核心是IIB型限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用。將適合于高通量測序平臺的接頭連接于標(biāo)簽兩側(cè)后，再經(jīng)過PCR擴(kuò)增，即可上機(jī)進(jìn)行測序。

2.1 技術(shù)特點(diǎn)

與其他測序技術(shù)相比2b-RAD技術(shù)優(yōu)勢更加明顯，如表2。其所有酶切片段都用于測序，避免了像其他RAD技術(shù)那樣，必須經(jīng)過片段選擇而導(dǎo)致部分信息的損失；目前已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)嚴(yán)重降解的中華絨螯蟹、中國對蝦、等樣品的建庫測序[8]；如果DNA量非常少，常規(guī)情況下無法開展個(gè)體水平的研究，2b-RAD對1-10ng級的DNA依然可建庫成功。

表2 常用簡化基因組測序技術(shù)比較

2.2 遺傳圖譜和 QTL定位

遺傳圖譜（genetic map）又叫連鎖圖譜（linkage map），是根據(jù)重組率估算出來的基因或遺傳標(biāo)記在染色體上相對位置的線性排列圖。遺傳圖譜的構(gòu)建就是用重組率來表示基因的遺傳距離，圖距單位用厘摩（Centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致表示1%的重組率。

QTL（數(shù)量性狀基因座）定位是指控制數(shù)量性狀的基因在基因組中的位置，是利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方案，分析整個(gè)基因組DNA分子標(biāo)記和數(shù)量性狀表型值的關(guān)系。

利用2b-RAD技術(shù)，對某物種合適的作圖群體進(jìn)行測序，獲得酶切位點(diǎn)附近的基因序列信息，運(yùn)用生物信息學(xué)方法開發(fā)SNP，并計(jì)算標(biāo)記間的遺傳連鎖距離，繪制連鎖圖譜，可用于后續(xù)QTL定位、輔助基因組組裝等方向的分析。能夠降低基因組的復(fù)雜度，數(shù)據(jù)量低，操作簡便，節(jié)約成本，特別適合大樣本量的研究。

3 結(jié)語

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展基因測序技術(shù)也取得了一定的成就，2b-RAD技術(shù)具有信息全面、重復(fù)性好不受PCR偏好性影響等優(yōu)點(diǎn)，其為我們更加深層次和更快捷了解物種某一性狀提供了理論依據(jù)和技術(shù)手段。此技術(shù)的完善與發(fā)展將為未來基因測序提供了新的技術(shù)支持，推動簡化基因技術(shù)進(jìn)一步地發(fā)展。