于 雪，鄒永秋，王 穎，陳澤琨，馬德福

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院社會(huì)醫(yī)學(xué)與健康教育系，北京 100191)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,根據(jù)組織學(xué)類(lèi)型分型，肺癌可以分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)， 其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占肺癌的85%[1]。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)2020年發(fā)布的報(bào)告，在美國(guó)所有癌癥中，肺癌的發(fā)病率和病死率分別為第2位和第1位，接近四分之一的癌癥患者死于肺癌[2]。在我國(guó)，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，1988—2005年間，肺癌發(fā)病率的年平均增長(zhǎng)為1.63%， 其中男性為1.30%，女性為2.34%[3]。2015年我國(guó)肺癌新發(fā)病例達(dá)73.3萬(wàn)人，死亡61.0萬(wàn)人，占所有腫瘤發(fā)病和死亡人數(shù)的17.1%和21.7%[4]。目前NSCLC患者的治療方案主要包括根治性手術(shù)、放化療和分子靶向治療。雖然在手術(shù)方式的優(yōu)化、輔助支持治療和綜合治療方面取得了進(jìn)展，但是NSCLC患者的預(yù)后仍不理想，5年生存率僅約21%[5-6]。藥物化療作為肺癌一種常用治療手段，在中晚期肺癌的治療中發(fā)揮著重要的作用，但是NSCLC對(duì)傳統(tǒng)治療藥物并不敏感，并且常常出現(xiàn)耐藥[7-8]。因此，尋找對(duì)肺癌防治更加有效的方法至關(guān)重要。

天然食物及其活性成分在改變肺癌風(fēng)險(xiǎn)中所發(fā)揮的作用目前越來(lái)越受到研究者重視。大量證據(jù)已經(jīng)證實(shí)，水果、蔬菜、豆類(lèi)及其所含的特定抗氧化劑和活性成分(如植物雌激素)對(duì)肺癌具有預(yù)防作用[9]。大豆異黃酮是植物雌激素的一種，是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次生代謝產(chǎn)物，存在游離型的苷元和結(jié)合型的糖苷兩種形式，其中苷元主要為染料木素、大豆苷元和黃豆黃素3種。雌馬酚是大豆苷元在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的具有較穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物，是大豆異黃酮及其代謝產(chǎn)物中雌激素樣活性和抗氧化活性最高的一種[10]。與前體物質(zhì)大豆苷元不同，雌馬酚在呋喃環(huán)的C-3位置處有一個(gè)手性碳，因此是手性分子，存在R、S兩種對(duì)應(yīng)異構(gòu)體，體內(nèi)代謝產(chǎn)物均為S型，人工合成的雌馬酚則為二者混合物，即外消旋雌馬酚。目前雌馬酚(尤其是雌馬酚對(duì)應(yīng)異構(gòu)體)對(duì)肺癌影響的研究較少見(jiàn)，雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體對(duì)肺癌的影響及其機(jī)制尚不清楚。本研究以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，探討外消旋雌馬酚及雌馬酚對(duì)應(yīng)異構(gòu)體對(duì)肺癌的影響和其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，外消旋雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體(98%)購(gòu)自美國(guó)LC Laboratories公司，核因子紅系2相關(guān)因子2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2, Nrf2]抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，β-actin(AC001-M)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotecnology公司，二抗抗體購(gòu)自愛(ài)爾蘭Rockland公司，胰酶、胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，蛋白提取、定量及蛋白免疫印跡相關(guān)試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehye, MDA)和8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤(8-hydroxydeoxygunosine, 8-OHdG)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

5周齡雄性C57BL/6小鼠120只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室溫度(23±2)℃，濕度50%±5%，通風(fēng)良好，光線12 h明暗交替，動(dòng)物自由飲水和攝取配方飼料。采用改良的AIN-93G配方飼料，為了排除飼料中大豆異黃酮的影響，其中的大豆油用玉米油代替。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行動(dòng)物分組，同時(shí)進(jìn)行肺癌的造模。本研究開(kāi)始前獲得北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(LA2020048)。

120只小鼠隨機(jī)分為8組(表1)，每組15只，分別為肺癌腫瘤對(duì)照組(control group, CG組)、染料木素對(duì)照組(genistein control group, GCG)、低劑量外消旋雌馬酚組(low equol group, LEG)、高劑量外消旋雌馬酚組(high equol group, HEG)、低劑量R-雌馬酚組(low R-equol group, LRE)、高劑量R-雌馬酚組(high R-equol group, HRE)、低劑量S-雌馬酚組(low S-equol group, LSE)和高劑量S-雌馬酚組(high S-equol group, HSE)。調(diào)整人與嚙齒動(dòng)物的異速生長(zhǎng)比例后，250 mg/kg的雌馬酚與人類(lèi)從日常大豆食品的攝入量相當(dāng)[11]。因此，本研究雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體各設(shè)兩個(gè)劑量組，即250 mg/kg和500 mg/kg，比較常規(guī)大豆飲食和高劑量的雌馬酚對(duì)肺癌的影響，設(shè)置染料木素組比較雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體與經(jīng)典大豆異黃酮對(duì)肺癌的影響。

表1 各實(shí)驗(yàn)組飼料成分Table 1 Feed composition of each group

烏拉坦粉末溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水中，充分振蕩混勻配成4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的烏拉坦溶液，于棕色玻璃瓶中保存。皮下注射方式給與每只小鼠800 mg/kg劑量的烏拉坦溶液，每周2次,連續(xù)4周誘導(dǎo)肺癌動(dòng)物模型。烏拉坦連續(xù)注射4周后再繼續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月(17周)后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，脫頸椎法處死小鼠。開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的每周第1天及實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天稱(chēng)量并記錄小鼠體質(zhì)量和食物攝入量，觀察小鼠狀態(tài)和生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死解剖小鼠，取肺，肉眼進(jìn)行初步的腫瘤形態(tài)學(xué)鑒定，并進(jìn)行腫瘤取材，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟制作病理切片，顯微鏡下核實(shí)判斷。記錄各組發(fā)生腫瘤的小鼠數(shù)，計(jì)算各組腫瘤發(fā)生率，腫瘤發(fā)生率=(各組發(fā)生腫瘤的小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù))×100%。

1.3 血液氧化/抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠前對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，使用摘眼球法取血，所得血液立即經(jīng)離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，分離出血清，置于-20℃冰箱保存。血清中的SOD、MDA和8-OHdG的含量按照說(shuō)明書(shū)步驟使用相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

稱(chēng)量50～100 mg肝左葉組織放在玻璃勻漿器中，加入含有1 mol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethyl-sulfonyl fluorid, PMSF)的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，4 ℃，12 000 r/min離心5 min取上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白濃度測(cè)定法進(jìn)行定量。50 μg總蛋白等量上樣，10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的聚丙稀酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶溶液室溫封閉2 h后，Nrf2和β-actin的一抗抗體用5%脫脂奶稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液(tris buffered saline，with Tween-20, pH 8.0)漂洗3次后加入二抗，室溫下孵育1 h，使用增強(qiáng)熒光發(fā)光試劑顯影，然后使用圖像成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量和攝食量情況

每組小鼠平均體質(zhì)量周變化情況如圖1，隨機(jī)分組后各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，皮下注射烏拉坦造模期間小鼠體質(zhì)量呈基本不變或略有下降趨勢(shì)，隨后各組小鼠隨時(shí)間增加體質(zhì)量增加?？傮w來(lái)看，CG組小鼠體質(zhì)量最高而LRE和HRE組小鼠體質(zhì)量較低，但重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析發(fā)現(xiàn)各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CG， control group； GCG， genistein control group； LEG， low equol group； HEG， high equol group； LRE，low R-equol group； HRE， high R-equol group； LSE， low S-equol group； HSE， high S-equol group.圖1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠體質(zhì)量周變化情況Figure 1 Weekly changes in body weight of mice during the experiment

每組小鼠平均食物攝入量周變化如圖2，總體來(lái)看，CG組和HEG組小鼠平均食物攝入量較高，而LRE和HRE組較低，且LRE組和HRE組與CG組和HEG組小鼠平均食物攝入量間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

CG，control group；GCG，genistein control group；LEG，low equol group；HEG，high equol group；LRE，low R-equol group；HRE，high R-equol group；LSE，low S-equol group；HSE，high S-equol group.圖2 實(shí)驗(yàn)期間小鼠單位體質(zhì)量食物攝入量周變化情況Figure 2 Changes in weekly food intake per unit weight of mice in each group

2.2 小鼠肺癌發(fā)生情況

烏拉坦致小鼠肺癌切片經(jīng)HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部為肺腺癌，誘導(dǎo)時(shí)間短且無(wú)小鼠死亡。120只小鼠中49只出現(xiàn)肺癌，肺癌總體發(fā)生率為40.8%，各組小鼠的肺癌發(fā)生情況如表2，CG組肺癌發(fā)生率最高為86.7%(13/15)， HRE和HSE組肺癌發(fā)生率最低為13.3%(2/15)。與CG組相比，各實(shí)驗(yàn)組肺癌發(fā)生率均更低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同種藥物高劑量實(shí)驗(yàn)組肺癌發(fā)生率顯著低于低劑量實(shí)驗(yàn)組。同等劑量下，3種雌馬酚組小鼠肺癌發(fā)生率差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且與GCG組小鼠肺癌發(fā)生率相當(dāng)。

表2 各組小鼠肺癌發(fā)生情況Table 2 The incidence of lung cancer in each group

2.3 氧化/抗氧化指標(biāo)結(jié)果

ELISA檢測(cè)各組小鼠血清中SOD、MDA和8-OHdG的含量(表3)發(fā)現(xiàn)，與CG組相比，GCG、HRE和HSE組小鼠血清中SOD的含量較高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HEG、LRE和LSE組小鼠血清中SOD含量高于CG組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與CG組相比，LEG組小鼠血清中MDA含量較低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組小鼠血清中MDA含量均顯著低于CG組，且同種藥物高劑量雌馬酚組小鼠血清中MDA含量顯著低于低劑量雌馬酚組。與CG組相比，LSE組小鼠血清中8-OHdG含量較低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組小鼠血清中8-OHdG含量均顯著低于CG組，且同種藥物高劑量雌馬酚組小鼠血清中8-OHdG含量顯著低于低劑量雌馬酚組。同等劑量下，3種雌馬酚組小鼠血清中氧化/抗氧化指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且與GCG組小鼠相當(dāng)。

表3 各組小鼠血清中氧化/抗氧化指標(biāo)結(jié)果Table 3 The result of oxidation/anti-oxidation indices in serum of each group

為了進(jìn)一步探討雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體影響肺癌發(fā)生的抗氧化機(jī)制，通過(guò)Western blotting法檢測(cè)了肝組織中Nrf2蛋白的表達(dá)(圖3)，發(fā)現(xiàn)除LEG組外，其余各組小鼠的Nrf2蛋白表達(dá)水平均高于CG組小鼠，并且同種藥物高劑量雌馬酚組的Nrf2蛋白表達(dá)水平高于低劑量雌馬酚組。

CG， control group； GCG， genistein control group； LEG， low equol group； HEG， high equol group； LRE， low R-equol group； HRE， high R-equol group； LSE， low S-equol group； HSE， high S-equol group.圖3 各組小鼠Nrf2蛋白的表達(dá)情況Figure 3 Nrf2 protein expression profile in each group

3 討論

本研究以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，探討了外消旋雌馬酚及雌馬酚對(duì)應(yīng)異構(gòu)體對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程影響及其機(jī)制，并與經(jīng)典大豆異黃酮染料木素比較，發(fā)現(xiàn)雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體可能通過(guò)上調(diào)Nrf2基因的表達(dá)，增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力，進(jìn)而降低烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生率。3種雌馬酚降低肺癌發(fā)生率的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與同等劑量的染料木素作用相當(dāng)。

細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA和8-OhdG的含量可一定程度反映細(xì)胞的氧化損傷情況。SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中重要的酶類(lèi)，可以特異性地結(jié)合機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子，清除自由基，通過(guò)阻斷氫原子供體和終止自由基連鎖反應(yīng)，抑制機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，起到抗氧化作用。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的反應(yīng)終產(chǎn)物，MDA的增加表明組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物量的增加，可以間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度。8-OHdG是活性氧自由基氧化損傷細(xì)胞核DNA或線粒體DNA后形成的產(chǎn)物，在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定存在，不會(huì)通過(guò)非DNA氧化途徑形成，也不再被機(jī)體進(jìn)一步代謝，因此常作為內(nèi)源性及外源性因素對(duì)DNA氧化損傷作用的生物標(biāo)志物。大豆異黃酮含有多個(gè)酚羥基作為配氫體，可以為活性氧自由基提供電子和氫，使這些自由基得以穩(wěn)定發(fā)揮其抗氧化作用[12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮及其代謝產(chǎn)物雌馬酚可降低大鼠血清中8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷的含量，增加超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的表達(dá)[13-14]。本研究通過(guò)測(cè)量各組小鼠血清中SOD、MDA和8-OHdG的含量來(lái)衡量各組小鼠血液氧化/抗氧化水平，結(jié)果表明雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體可顯著提高小鼠的抗氧化能力，且同種藥物高劑量雌馬酚組的小鼠血清抗氧化水平顯著高于低劑量雌馬酚組，即雌馬酚具有的抗氧化性可能存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。

Nrf2是細(xì)胞調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而提高細(xì)胞抗氧化能力。有研究報(bào)道Nrf2可誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)來(lái)降低肝、肺等組織的氧化損傷，進(jìn)而發(fā)揮其化學(xué)防癌的作用[15-16]。本研究測(cè)量了各組小鼠Nrf2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體可上調(diào)小鼠Nrf2蛋白的表達(dá)。這些結(jié)果與各組小鼠肺癌發(fā)生率及血清中氧化/抗氧化相關(guān)指標(biāo)結(jié)果一致，提示雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體可能通過(guò)上調(diào)Nrf2基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)小鼠的抗氧化能力，進(jìn)而降低了烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌發(fā)生率。

綜上所述，雌馬酚及其對(duì)應(yīng)異構(gòu)體可能通過(guò)抗氧化效應(yīng)抑制肺癌的發(fā)生，本研究結(jié)果為利用雌馬酚，發(fā)揮其有益效應(yīng)，避免其有害影響提供了理論依據(jù)。