梁寶丹， 李子珊， 潘浣鈺， 劉麗英， 陳 焱， 郝燕娟

（廣州匯標(biāo)檢測技術(shù)中心，廣東廣州 510700）

近年來，隨著集約化養(yǎng)殖業(yè)和動物營養(yǎng)研究的不斷發(fā)展，淀粉糊化度作為表征飼料營養(yǎng)與加工的一個重要指標(biāo)參數(shù)（于紀(jì)賓等，2015），不僅直接影響飼料的轉(zhuǎn)化效率和畜禽生長性能，同時也是評價顆粒飼料加工質(zhì)量的重要指標(biāo) （王海東等，2008）。在飼料、谷物和食品加工領(lǐng)域中，國內(nèi)外學(xué)者利用不同的方法對淀粉的糊化性質(zhì)做了相關(guān)研究工作（黃立蘭等，2014）， 其中包括基于酶親和特異性的酶解法（AGS）（于紀(jì)賓等，2015）、基于熱特性的差式掃描量熱法（DSC）（Tatiana 等，2006）、基于流變特性的快速黏度分析法 （PVA）（Rabiha 等，2013；Zaidul，Nik 等，2007；）、 基于晶體的熔解特性研究的 X-衍射法（熊善柏等，2001；張璐，2001）等。

在飼料行業(yè)中， 通常采用和畜禽消化功能相接近的酶水解法。 其原理是利用各種酶對糊化淀粉和原有淀粉有選擇性地分解， 分別對其生成量進(jìn)行測定，得到準(zhǔn)確的糊化度（黃立蘭等，2014；付中華等，2004）。 酶解法又分為淀粉糖化酶法、β-淀粉酶法及葡萄糖淀粉糖化酶法。 熊易強(qiáng)（2000）提出的簡易酶解法， 其本質(zhì)是簡化了Y.Xiong 等（1990）建立的淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶酶法，將酶水解后的樣品的葡萄糖釋放量和同一來源的全糊化樣品的葡萄糖釋放量， 利用吸光度的比值直接計(jì)算淀粉糊化度，但此方法對于酶的選擇過于單一，有可能面臨斷供問題。李啟武（2002）利用β-淀粉酶將糊化淀粉轉(zhuǎn)化成還原糖及β-糊精，用鐵氰化鉀法測定其還原糖量， 計(jì)算出淀粉糊化度。 付中華等（2004）提出的混合酶系法（BAP 法），即用葡萄糖淀粉酶將酶解后的樣品的還原糖釋放量和同一來源的全糊化樣品的還原糖釋放量， 用Somogyi—nelson 的方法在520 nm 處分別測定其光密度，從而計(jì)算出淀粉糊化度（張森等，2014），但此方法對于環(huán)境有較嚴(yán)格的要求。 因此，開發(fā)一種準(zhǔn)確、簡便、長期有效的酶解法測定飼料中的淀粉糊化度，為飼料行業(yè)提供一種測定飼料中的淀粉糊化度的檢測方法，具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備 除非另有說明， 本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水為蒸餾水，符合GB/T 6682三級水的規(guī)定。乙酸鹽緩沖溶液 pH（4.5±0.05）；七水硫酸鋅溶液（10%）；氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L）；顯色溶液A（無水碳酸鈉40 g，酒石酸7.5 g，五水硫酸銅4.5 g，溶解后用水定容1000 mL）；顯色溶液B（氫氧化鈉 40 g，鉬酸 70 g，鎢酸鈉 10 g，溶解后煮沸20 min，磷酸250 mL，冷卻后定容1000 mL）；淀粉葡萄糖苷酶 （Sigma 10115-5G-F，180 U/mL）；國產(chǎn)淀粉葡萄糖苷酶 （源葉S10018，10 萬U/mL，液體）。

ME204E 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)（島津）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州澳華儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理 在規(guī)定的條件下， 淀粉葡萄糖苷酶可將樣品中已糊化的淀粉和該樣品經(jīng)全糊化的淀粉水解為還原糖，在沉淀蛋白后，用比色法測定，樣品與其全糊化吸光度值之比即為淀粉糊化度。

1.3 樣品的前處理 全糊化試樣溶液的制備：稱取試樣 0.2 ～ 0.5 g（精確至 0.0001 g），置于 25 mL刻度試管中，加入15 mL 乙酸鹽緩沖溶液，搖勻，標(biāo)注液面位置。 置100 ℃水浴中加熱1 h（其間振搖 2 ～ 3 次），取出，冷卻至室溫。 補(bǔ)加緩沖溶液至標(biāo)注液面處，混勻備用。

待測試樣溶液的制備：稱取試樣適量（精確至0.0001 g）（待測試樣與全糊化試樣之間重量±0.0002 g），置 25 mL 刻度試管，加入 15 mL 乙酸鹽緩沖溶液，混勻備用。

試劑空白溶液的制備： 取25 mL 刻度試管，直接加入乙酸鹽緩沖溶液15 mL，混勻備用。

在軟件接收機(jī)跟蹤穩(wěn)定后，利用本地生成的參考偽碼xref(t)和解調(diào)后獲得的基帶信號yr(t)進(jìn)行互相關(guān)運(yùn)算可得到用于計(jì)算測距偏差的互相關(guān)曲線，對其進(jìn)行歸一化運(yùn)算得到：

1.4 糊化度的測定 酶解： 取制備好的全糊化試樣溶液、待測試樣溶液和試劑空白溶液分別加入酶溶液 1 mL，搖勻，置（40±1）℃水浴中保溫，每隔15 min 振搖一次，保溫1 h，結(jié)束后冷卻至室溫備用。

沉淀蛋白： 將經(jīng)過酶解處理過的全糊化試樣溶液、 待測試樣溶液和試劑空白溶液分別加入硫酸鋅溶液2 mL，混勻，加0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL，用水定容至25 mL，混勻，過濾或8000 r/min離心5 min。 取濾液或上清液備用。

準(zhǔn)確移取得到的各種濾液0.1 mL， 分別置25 mL 比色管中，加顯色溶液A 2 mL，混勻。置沸水浴加熱6 min，加顯色溶液B 2 mL，繼續(xù)加熱2 min，立即用冰水浴冷卻至室溫，定容至25 mL，混勻。 以試劑空白溶液調(diào)零，在420 nm 波長下測定待測試樣溶液和全糊化試樣溶液的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選和濃度的確定 本方法研究的是將酶解樣品的淀粉和全糊化樣品的淀粉， 轉(zhuǎn)化為葡萄糖或其他還原糖。但實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，只能從形成還原糖的多少來辨別，而這不僅取決于酶的品種，也與所使用酶的濃度或活性大小有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)以玉米和配合飼料為典型樣品，用180 U/mL 的Sigma 淀粉葡萄糖苷酶（以下簡稱AMG）檢測其對應(yīng)的淀粉糊化度， 以玉米淀粉糊化度為13.34%，配合飼料淀粉糊化度為22.09%作為參考，考察酶的篩選和濃度的確定。

2.1.1 酶的選擇及其濃度的研究 首先考察不同濃度國產(chǎn) AMG（源葉，貨號：S10018，BR，10 萬 U/mL，液體）和 β-淀粉酶（BR，70n 萬 U/mL，液體）的作用效果。 對國產(chǎn) AMG， 首先測試酶濃度為 180 ～18000 U/mL，對β-淀粉酶則測試了4 萬～35 萬U/mL水解效果，初步的考察結(jié)果見圖1 和圖2。

圖2 β-淀粉酶酶濃度初篩的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

玉米和配合飼料，使用國產(chǎn)AMG 濃度在180 ～1800 U/mL 中某一濃度點(diǎn)檢測的淀粉糊化度結(jié)果與 Sigma AMG 結(jié)果相近；β-淀粉酶濃度在126000 ～35000 U/mL 中某一濃度點(diǎn)檢測的淀粉糊化度結(jié)果與Sigma AMG 結(jié)果相近。 但考慮到β-淀粉酶的用量過大， 成本較高， 加之AOAC、AACC 和ISO 酶法測定谷物、 食品或飼料中總淀粉含量時， 水解糊化后樣品使用的均為AMG，故本標(biāo)準(zhǔn)決定只用國產(chǎn)AMG。

2.1.2 國產(chǎn)AMG 適用濃度的研究 根據(jù)圖1 的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 將濃度180 ～1800 U/mL 的國產(chǎn)AMG 進(jìn)一步細(xì)分為6個梯度，分別測定了玉米和配合飼料的糊化度 （圖3）。 結(jié)果說明酶濃度在1000 ～ 1800 U/mL 的效果較好， 于是將1000 ～1800 U/mL 酶濃度再以100 U/mL 遞增，測試結(jié)果見圖4。 結(jié)果表明，國產(chǎn)AMG 濃度為1500 U/mL時， 玉米和配合飼料的淀粉糊化度測定結(jié)果與Sigma AMG 結(jié)果相近，穩(wěn)定性較好，因此將國產(chǎn)AMG 濃度選定為1500 U/mL。

圖3 國產(chǎn)AMG 濃度進(jìn)一步篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 國產(chǎn)AMG 濃度最終篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 不同國內(nèi)品牌AMG 的研究 為證明上述確定的酶濃度， 是否適于國產(chǎn)不同廠家和品牌AMG 類型的酶，分別購買了幾個不同公司生產(chǎn)的國產(chǎn) AMG（A、B、C、D、E、F，1500 U/mL）對玉米、豬配合飼料糊化度進(jìn)行測定，結(jié)果見圖5 和圖6。

圖5 不同AMG 對飼料糊化度的影響（玉米）

圖6 不同AMG 對飼料糊化度的影響（配合飼料）

不同公司不同品牌生產(chǎn)的AMG 在酶活力1500 U/mL 的時候，玉米和配合飼料的淀粉糊化度結(jié)果與Sigma AMG 偏差均小于0.5%， 結(jié)果穩(wěn)定。但考慮到Sigma AMG 的斷供可能和經(jīng)濟(jì)效益問題，本法選用國產(chǎn)AMG，酶活的濃度為1500 U/mL。

2.2 條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品粉碎粒度的選擇 粒度的大小理論上會對淀粉糊化度檢測結(jié)果有較大的影響， 因?yàn)榱６仍酱?，樣品分子與酶解液接觸面積會越小，使之達(dá)到樣品內(nèi)部的時間越長，最終導(dǎo)致結(jié)果偏低，但是當(dāng)粉碎粒度過小，也會損壞樣品的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致結(jié)果較低。為此，對過不同分析篩的玉米、大麥、配合飼料三個樣品 （10、20、30、40、50、60、80 目）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果見圖7。

圖7 不同粉碎粒度對結(jié)果的影響

由上圖可知，樣品粉碎度對測定結(jié)果有較大影響，得到的糊化度相差較大，目數(shù)在50 目（0.27 mm）均能達(dá)到近似于最大值的結(jié)果。 因此，本方法規(guī)定樣品過50 目（0.27 mm）能夠更好地讓樣品充分酶解。

2.2.2 酶解條件的選擇 酶促反應(yīng)速度受酶濃度影響，同時pH、溫度、反應(yīng)時間對其也有影響。 熊易強(qiáng)（2000）和對應(yīng)的 AOAC、AACC 標(biāo)準(zhǔn)中酶解均是在pH 4.5 的乙酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行的，也曾實(shí)驗(yàn)證明，緩沖液pH 在4.45 ～4.55，對葡萄糖釋放量無影響，故本法取 pH 為（4.5±0.05）。 本文分別就酶添加量（0.5、1、1.5、2 mL）、酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）、酶解時間（30、45、60、75、90 min）對玉米、大麥、配合飼料淀粉糊化度的影響進(jìn)行測定，結(jié)果見圖8 ～圖10。

圖8 酶添加量對糊化度的影響

圖9 酶解溫度對糊化度的影響

圖10 酶解時間對糊化度的影響

由上圖可知，酶的添加量達(dá)到1.5 mL，其酶解是最完全的；溫度于40 ～50 ℃時趨于穩(wěn)定；酶解時間在60 min 后趨于穩(wěn)定。 綜合考量，本方法選擇酶添加量為1.5 mL，酶解溫度為40 ℃，酶解時間為60 min。

2.2.3 蛋白沉淀劑的選擇 樣品經(jīng)酶解后， 測定葡萄糖之前，用蛋白沉淀劑沉淀蛋白，不僅可為下一步葡萄糖的測定消除干擾， 而且也起到了終止酶解的作用。目前常用的蛋白沉淀劑有硫酸鋅和鎢酸鈉等， 本研究比較硫酸鋅溶液和鎢酸鈉溶液沉淀蛋白后對糊化度測定的影響，結(jié)果見圖11。

圖11 不同沉淀劑對糊化度的影響

結(jié)果表明， 兩種沉淀劑的沉淀效果基本無差異， 但鎢酸鈉沉淀速度較慢， 而硫酸鋅能立即沉淀， 濾液清澈， 加之考慮一般實(shí)驗(yàn)室硫酸鋅更易得， 故本法選定硫酸鋅為蛋白沉淀劑。 再進(jìn)一步對硫酸鋅溶液和氫氧化鈉溶液的最佳添加量進(jìn)行考察，結(jié)果見圖12 和圖13。

圖12 硫酸鋅溶液添加量對糊化度的影響

圖13 氫氧化鈉溶液添加量對糊化度的影響

結(jié)果表明，酶解后分別加入硫酸鋅溶液2 mL 和0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液1.5 mL，沉淀蛋白較完全。

2.2.4 顯色條件的選擇 樣品經(jīng)過酶解沉淀蛋白后釋放出來的葡萄糖， 利用葡萄糖的還原性能將顯色溶液A 的Cu2+還原為氧化亞銅，氧化亞銅再與磷鉬酸反應(yīng)生成“磷鉬藍(lán)”，通過比色從而測得樣品的糊化程度。本文仔細(xì)考察了顯色反應(yīng)中，顯色溶液 A 用量（1、1.5、2、2.5、3 mL）、顯色溶液 B用量（1、1.5、2、2.5、3 mL）、顯色溫度（80、85、90、95、100 ℃）、加入顯色 A 溶液反應(yīng)時間（4、5、6、7、8 min） 和加入顯色 B 溶液反應(yīng)時間（1、2、3、4、5 min）， 這些主要實(shí)驗(yàn)條件與參數(shù)對糊化度的影響，結(jié)果見圖14 ～圖18。

圖14 顯色溶液A 添加量對糊化度的影響

圖15 顯色溶液B 添加量對糊化度的影響

圖16 顯色溫度對糊化度的影響

圖17 加入顯色A 溶液反應(yīng)時間對糊化度的影響

圖18 加入顯色B 溶液反應(yīng)時間對糊化度的影響

由上圖可知，加顯色溶液A 2.5 mL，混勻，置（100±1）℃水浴加熱 6 min， 加顯色溶液 B 2 mL，繼續(xù)加熱4 min 較為合適。

通過對糊化度檢測方法中樣品粉碎粒度、酶的添加量、酶解溫度、酶解時間、沉淀劑的選擇、沉淀劑溶液和氫氧化鈉溶液的添加量， 以及顯色反應(yīng)條件等幾個方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析， 確定了本方法的各項(xiàng)最優(yōu)參數(shù)， 即樣品經(jīng)50 目（0.27 mm）粉碎，酶解添加量為1.5 mL，酶解pH 為4.5，酶解溫度為40 ℃，反應(yīng)時間為60 min，沉淀劑為硫酸鋅，硫酸鋅溶液添加量為2 mL，氫氧化鈉溶液添加量為1.5 mL， 顯色條件為顯色溶液A 加入2.5 mL，混勻，置（100±1）℃水浴加熱 6 min，加顯色溶液 B 2 mL，繼續(xù)加熱4 min，冷卻定容后于 420 nm 處進(jìn)行比色。

2.3 方法的改進(jìn) 目前，熊易強(qiáng)（2000）的簡化法和 GB/T 38573-2020 等標(biāo)準(zhǔn)中糊化度的測定，均做了一個基本假設(shè)，即將“生”淀粉的糊化度設(shè)為0，而全糊化淀粉的糊化度設(shè)為100，然后將樣品中糊化淀粉與其全糊化淀粉的比值，作為樣品的糊化度。 盡管許多實(shí)際樣品“零”點(diǎn)會有“偏移”， 但至今鮮見對該做法做出改變的研究。 然而，隨著動物營養(yǎng)研究和飼料工業(yè)的發(fā)展，飼料中添加葡萄糖、乳清粉等日漸增多，這種“偏倚”會越來越大。 為了消除影響， 本方法對熊易強(qiáng)（2000）的簡化法做了一些改進(jìn)：增加試樣空白，即加入15 mL 乙酸鹽緩沖溶液先將試樣中還原糖提取出來，加入沉淀劑后，再加入酶解液混勻定容過濾，然后與過濾后的試樣溶液、全糊化試樣溶液分別進(jìn)行還原糖測定，由公式（試樣吸光值-試樣空白吸光值）/（全糊化樣品吸光值-試樣空白吸光值）×100，計(jì)算淀粉糊化度。 總之，本方法增加了試樣空白的處理，由此能校正樣品空白的還原糖，這對于本身含有或者添加葡萄糖及其他還原糖、乳清粉等的產(chǎn)品，在檢測糊化度時能夠得到更接近于真實(shí)的結(jié)果。通過增加試樣空白的校正，在比色過程中能夠消除有顏色干擾的某些樣品得以準(zhǔn)確測定。為了驗(yàn)證增加試樣空白后樣品的糊化度情況，測試了一些典型樣品的糊化度，結(jié)果見圖19。

圖19 校正試樣空白前后典型樣品的糊化度

由上圖可知， 校正試樣空白與沒有校正試樣空白相比，糊化結(jié)果都偏低，對于本身添加有糖類的乳豬料，其糊化度甚至降低了50%，說明增加試樣空白的測定能夠更好地消除樣品本身的影響，從而得到更加接近真實(shí)的結(jié)果。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度

2.4.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 用生面粉制成窩頭，蒸熟、切碎、烘干、粉碎、過篩，制成熟面粉，然后與不同比例的生面粉充分混合（熟面粉+生面粉=1+4、2+3、1+1、3+2 和 4+1）， 分別制成熟面粉占樣品總量20%、40%、50%、60% 和 80%的樣品，連同全生和全熟的面粉分別測定樣品的糊化度， 結(jié)果見圖20。 同時， 選取國產(chǎn) AMG 和 sigma AMG 進(jìn)行比較，結(jié)果見圖21。

圖20 不同熟面粉比例的糊化度

圖21 國產(chǎn)AMG 和sigma AMG糊化度的線性關(guān)系圖

由圖可知，用本文優(yōu)化的方法測得糊化度的結(jié)果準(zhǔn)確度的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9996； 從兩者的線性方程的斜率為1.0077，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9999，可見國產(chǎn)AMG 與Sigma AMG 所測淀粉糊化度有很好的相關(guān)性，使用國產(chǎn)AMG 完全可以替代Sigma 酶。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 選取飼料原料：玉米、壓片玉米、小麥、白豌豆及飼料產(chǎn)品：豬配合飼料、精補(bǔ)料、魚料、膨化料，每種樣品平行測定6 次（表1）。 結(jié)果表明，采用本方法檢測飼料原料和飼料產(chǎn)品中淀粉糊化度的結(jié)果的精密度均小于4%，精密度較好。

表1 飼料原料及飼料產(chǎn)品糊化度的測定結(jié)果 %

3 小結(jié)

3.1 酶的篩選和濃度的確定 本文參考Sigma AMG， 考察了能獲得相同酶解能力的國產(chǎn)AMG和 β-淀粉酶， 確定了國產(chǎn) AMG （1500 U/mL）與Sigma AMG（10115-5G-F，180 U/mL）在測定淀粉糊化度上有等同效果， 并且比對國內(nèi)不同廠家的AMG （1500 U/mL）， 其 結(jié) 果 均 與 Sigma AMG（10115-5G-F，180 U/mL）相當(dāng)，且準(zhǔn)確性和精密性較好。

3.2 方法條件的優(yōu)化 對酶解法的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證，確定了酶的添加量為1.5 mL，在pH 4.5 條件下 40 ℃ 水浴60 min， 能夠達(dá)到最大的酶解效果；選擇硫酸鋅并移取2 mL、氫氧化鈉1.5 mL 能使樣品的蛋白沉淀完全； 選擇移取顯色劑A 2.5 mL，沸水浴6 min 后，移取顯色劑B 2 mL 繼續(xù)沸水浴4 min，能將顯色溶液A 的Cu2+完全還原為氧化亞銅， 氧化亞銅再與磷鉬酸充分反應(yīng)生成“磷鉬藍(lán)”，從而在波長為420 nm 處測定各管的吸光值， 計(jì)算得到的淀粉糊化度能達(dá)到最大解。

3.3 方法的改進(jìn) 對于飼料中本身含有或者添加葡萄糖及其他還原糖、乳清粉等的產(chǎn)品，本方法增加了試樣空白的處理， 由此能校正樣品空白的還原糖，從而得到更加接近真實(shí)的結(jié)果。 另外，通過增加試樣空白的校正， 在比色過程中能夠消除有顏色干擾的某些樣品。

4 結(jié)論

（1）國產(chǎn)淀粉葡萄糖苷酶（AMG，1500 U/mL）與淀粉葡萄糖苷酶（Sigma，10115-5G-F，180 U/mL）在測定淀粉糊化度上有等同效果；（2）選擇樣品粉碎粒度50 目（0.27 mm），酶解添加量1.5 mL，在 pH 4.5 條件下40 ℃ 水浴60 min，選擇硫酸鋅并移取2 mL，氫氧化鈉1.5 mL，移取顯色劑A 2.5 mL 沸水浴6 min 后， 移取顯色劑 B 2 mL 繼續(xù)沸水浴4 min，在波長為420 nm 處測定各管的吸光值得到淀粉糊化度為最優(yōu)條件；（3）對方法改進(jìn)，增加試樣空白管，使之與酶解后的試樣溶液、全糊化試樣溶液分別進(jìn)行還原糖測定， 其淀粉糊化度結(jié)果更接近于真實(shí)的淀粉糊化度結(jié)果。